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5 3 Criofratura Ao fi nal desta aula, você deverá ser capaz de: • Conhecer os princípios da criofratura. • Entender as informações contidas numa réplica de criofratura. • Correlacionar a criofatura à construção do modelo do mosaico fl uido de membrana. a u l a OBJETIVOS Aula_03.indd 39 17/6/2004, 11:36:36 Biologia Celular I | Criofratura CEDERJ40 planos de corte O “empilhamento" de vários perfis bidimensionais em série permite reconstruir o aspecto tridimensional da estrutura. Em cortes ultrafi nos, a membrana plasmática aparece sempre como uma estrutura trilaminar, com uma faixa clara limitada por duas linhas mais escuras. O aspecto trilaminar da membrana plasmática é chamado unidade de membrana. Esse aspecto difi culta a determinação da real estrutura da membrana, levando a conclusões erradas acerca da distribuição de proteínas e lipídeos (vide boxe), porém o desenvolvimento da técnica da criofratura abriu um novo horizonte de informações sobre as membranas celulares. Uma das limitações do microscópio eletrônico de transmissão sempre foi o fato de que as imagens observadas eram cortes ultrafi nos das amostras, isto é, imagens bidimensionais de estruturas (células) tridimensionais (Figura 3.1). Isto pôde ser contornado com a observação de cortes seriados, uma técnica bastante trabalhosa (Figura 3.2), e também com a microscopia de varredura. Entretanto, a resolução do microscópio eletrônico de varredura é menor que a do microscópio de transmissão, não permitindo a visualização de vários detalhes, principalmente do interior da célula (vide Aula 2) . INTRODUÇÃO Figura 3.1: No microscópio de transmissão o corte ultrafi no de uma célula resulta numa imagem bidimensional onde se vê o contorno (perfi l) trilaminar da membrana plasmática e as organelas internas (não representadas). Figura 3.2: Cortes em série de uma estrutura podem dar uma noção de sua forma tridimensional. plano de corte perfil bidimensional, membrana de aspecto trilaminar Aula_03.indd 40 17/6/2004, 11:36:53 CEDERJ 41 A U LA 3 M Ó D U LO 1 p ro te ín a lip íd eo Proteínas e outras moléculas hidrofílicas não atravessariam o “miolo” lipídico da membrana. Lipídeos e outras substâncias hidrofóbicas não cruzariam a “couraça” de proteínas da membrana. p ro te ín a Há muito tempo já era sabido que a membrana plasmática era composta principalmente de proteínas e lipídeos; entretanto, a observação da estrutura trilaminar da membrana em cortes ultrafi nos levou à conclusão errada de que a estrutura da membrana seria um "sanduíche" de proteínas recheado por uma bicamada lipídica. Uma membrana com essa organização seria não apenas muito rígida, difi cultando os movimentos celulares, como seria quase impossível que substâncias passassem através dela: aquelas hidrofílicas fi cariam impedidas de passar pela bicamada lipídica, assim como seria impossível que as substâncias hidrofóbicas atravessassem a cobertura de proteínas (veja o esquema na Figura 3.3). Fundamentos da técnica A técnica da criofratura começou a ser desenvolvida na década de 60 e a idéia inicial foi reduzir ao máximo os artefatos decorrentes da fi xação química por aldeídos. O objetivo era parar instantaneamente a atividade celular, provocando a fi xação das células sem que nenhum processo de decomposição celular tivesse tempo de acontecer. O procedimento básico para criofratura consiste em 4 etapas : a. congelamento das células em nitrogênio líquido; b. fratura das células; c, d. evaporação da superfície fraturada com carbono e platina formando um "molde" da superfície fraturada (chamado réplica); e, f. digestão dos restos celulares, de modo que apenas a réplica metálica é observada ao microscópio eletrônico de transmissão. Figura 3.3: O "modelo do sanduíche" da membrana era rígido e não explicava os movimentos celulares e o transporte através da membrana, embora correspondesse à imagem de microscopia eletrônica de transmissão de cortes ultrafi nos. Aula_03.indd 41 17/6/2004, 11:37:00 Biologia Celular I | Criofratura CEDERJ42 Figura 3.4: Principais etapas na produção de uma réplica. CONGELAMENTO Algumas adaptações tiveram de ser feitas para que os cristais de gelo que se formavam no processo de congelamento não perfurassem as células, lesando-as gravemente e impedindo a observação de sua organização. Assim, antes de congelar as amostras, elas são brevemente fi xadas em aldeídos e infi ltradas com glicerol, uma substância que difi culta a formação de cristais de gelo (Figura 3.5). Um outro fator que impede a formação de cristais é fazer um congelamento ultra- rápido, o que requer equipamentos ainda mais sofi sticados. Figura 3.5: Para criofratura, as células são inicialmente fi xadas com aldeídos, a seguir infi ltradas com glicerol, que impedirá a formação de cristais de gelo quando congeladas. Aula_03.indd 42 17/6/2004, 11:37:03 CEDERJ 43 A U LA 3 M Ó D U LO 1 FRATURA Depois de congeladas, as amostras são colocadas numa câmara a vácuo e aí fraturadas, também a baixa temperatura. Para observar a superfície exposta após a fratura, não seria possível retirar a amostra do aparelho, pois à temperatura ambiente ela simplesmente derreteria. Por esse motivo, é necessário fazer um molde que reproduza a superfície fraturada com todos os detalhes. Figura 3.6: O material congelado é fraturado, expondo o interior celular. REPLICAÇÃO Ainda sob vácuo e baixa temperatura, a superfície exposta é recoberta com uma fi na camada de platina. Lembre que o carbono é um átomo leve, pouco efi ciente para barrar os elétrons do microscópio eletrônico. A platina é evaporada em ângulo lateral, assim não se deposita em toda a superfície da amostra. Lembre também que a platina é um metal pesado, barrando os elétrons que colidirem com seus átomos. Imediatamente após, é feito um sombreamento com carbono, que forma a base da réplica. Essa réplica de carbono e platina é que será observada ao microscópio eletrônico. Para que a réplica não sofra interferência de restos celulares da amostra inicial, ela é limpa com a ajuda de ácido e bases fortes. Figura 3.7: A platina evaporada em ângulo se deposita apenas em algumas partes da superfície fraturada. O carbono forma um fi lme contínuo sobre a superfície fraturada. Aula_03.indd 43 17/6/2004, 11:37:32 Biologia Celular I | Criofratura CEDERJ44 INTERPRETAÇÃO DAS RÉPLICAS O aspecto de algumas réplicas era muito diferente das imagens dos cortes ultrafi nos. Embora algumas estruturas fossem identifi cadas (Figura 3.8), muitas vezes observava-se apenas grandes áreas que pareciam corresponder à superfície celular (Figura 3.9). Nessas superfícies de membrana havia sempre um grande número de partículas distribuídas: as partículas intramembranosas (Figura 3.9). Em 1966 foi possível demonstrar que a fratura ocorre preferencialmente no plano médio da membrana, isto é, separando as duas camadas de fosfolipídeos que a formam (Figura 3.10 ), e que as partículas inseridas nas membranas correspondiam a proteínas delas. Essa foi uma das evidências mais importantes para a sustentação do modelo do mosaico fl uido, proposto por Singer e Nicolson em 1972. Figura 3.8: Quando a célula é fraturada em seu plano médio é possível reconhecer o núcleo pelo seu envoltório duplo e complexos de poro. Vacúolos e organelas intracelulares são de identifi cação mais difícil. Figura 3.9: Quando a fratura expõe a superfície da célula, observamos várias partículas intramembranosas, setas que correspondem às proteínasda membrana. F o to : R au l D . M ac h ad o Aula_03.indd 44 17/6/2004, 11:37:46 CEDERJ 45 A U LA 3 M Ó D U LO 1 Figura 3.10: O plano de fratura preferencial divide os folhetos da bicamada lipídica. Podem ser observados o folheto voltado para o citoplasma (face P) ou o lado voltado para o meio extracelular (face E) da membrana. Figura 3.11: Esquema de uma hemácia (A) sendo fraturada (B) e (C) e expondo, ora a face E da membrana, voltada para o exterior (D1), ou a face P, voltada para o citoplasma (D2). CONCLUSÃO A criofratura continua sendo uma técnica importante no estudo das células, entretanto, muitas variações foram introduzidas, permitindo a observação não apenas do "miolo" da membrana, mas também das faces voltadas para o citoplasma, para o meio extracelular e também de estruturas citoplamáticas, como os microtúbulos. (A) (B) (C) (D1) (D2) Aula_03.indd 45 17/6/2004, 11:38:05 Biologia Celular I | Criofratura CEDERJ46 RESUMO A técnica de criofratura consiste em fraturar células ou tecidos depois de congelados. A fratura tem grande probabilidade de ocorrer entre as duas camadas de fosfoli- pídeos que formam as membranas, expondo uma matriz homogênea (os lipídeos) com partículas de diversos tamanhos nela inseridas. Essas partículas "intramembranosas" correspondem a proteínas que atravessam a bicamada lipídica. Para que a face fraturada possa ser observada é feita uma réplica em carbono e platina da mesma. Finalmente, os restos da amostra são separados da réplica que é colocada sobre uma grade e levada ao microscópio eletrônico de transmissão. O plano de fratura ocorre preferencialmente entre os dois folhetos de bicamada lipídica, expondo o plano hidrofóbico do lado voltado para o citoplasma (face P) ou do lado voltado para o meio extracelular (face E). EXERCÍCIOS 1. Liste as etapas do procedimento para criofratura, explicando os objetivos de cada uma. 2. Qual a parte da membrana que é exposta na fratura? 3. A que correspondem as partículas intramembranosas observadas nas réplicas? 4. Qual a contribuição da criofratura na elaboração do modelo do mosaico fl uido? Aula_03.indd 46 17/6/2004, 11:39:31