Determinação espectrofotométrica

Prévia do material em texto

Profa. Esp. Valéria Alessandra Prado Defávari Franco 
Aula 4 - Bioquímica e Biofísica 
ESPECTROFOTOMETRIA 
 
 
ESPECTROFOTOMETRIA 
 Absorção de luz pela matéria – determinar a [ ] 
de compostos em uma solução 
 
 Determinação espectrofotométrica de 
compostos corados(cromóforo) obtidos pela 
reação entre composto a ser analisado e 
reagente (cromogênico) originando produto 
colorido→ Método colorimétrico 
  Método colorimétrico: são específicos e 
muito sensíveis 
 
 Vantagem: absorvem luz visível 
Definição Espectrofotometria 
 Medida de absorção ou transmissão de 
luz 
 Método bem utilizado em técnicas 
analíticas 
 Componentes desconhecidos de uma 
solução podem ser identificados pelos 
espetros característicos ao UV, visível ou 
IV. 
 Feixe de luz monocromática atravessa a 
solução com moléculas absorventes, 
parte da luz é absorvida pela solução e o 
restante transmitido. 
 
 Absorção luz depende da [ ] de 
moléculas absorventes e da espessura da 
solução 
Absorção de luz 
Natureza da Cor 
 A intensidade da cor (solução) é 
proporcional a [ ] de moléculas 
absorventes de luz 
 Quanto > [ ] solução > será a absorção de 
luz 
 Cor da solução: determinada pela cor da 
luz transmitida 
Cores 
 
 Colocar tabela livro 
Absorção de luz e comprimento de onda 
 Luz: radiação eletromagnética – característica 
de onda e de partícula de energia (fóton) 
 O movimento ondulatório se da pelo 
comprimento de onda λ que corresponde a 
distancia linear entre dois cristais (nm) – 10-9m 
 A absorção de luz pela matéria envolve a 
incorporação de energia contida no fóton á 
estrutura das moléculas absorventes 
 
Absorção de luz e comprimento de onda 
Como ocorre?????? 
 As moléculas absorventes passam do estado 
fundamental (estado energético + baixo) para o 
estado excitado (estado energético + alto) 
 
 Duração estado excitado é breve 10-8 segundos 
 
 O retorno ao estado fundamental liberta energia 
na forma de calor 
 
Absorção de luz 
Como ocorre?????? 
 Quando feixe de luz fotocromática atravessa a 
solução com moléculas absorventes parte das 
ondas eletromagnéticas são absorvidas pela 
moléculas da solução assumindo o estado 
excitado retornando rapidamente ao estado 
fundamental e liberando energia na forma de 
calor 
 
Lei de Lambert - Beer 
•Fundamento da espectrofotometria 
 
•Baseia-se: a quantidade de luz absorvida ou transmitida 
por uma determinada solução depende da concentração 
do soluto e da espessura da solução 
Condições para Lei de Lambert - Beer 
 A luz utilizada é aproximadamente 
monocromática 
 As soluções analisadas estejam diluídas( baixas 
concentrações) 
 Não devem estar presentes na mesma solução 
mais de uma substancia absorvente de luz 
 O aumento da [ ] da substancia não altera as 
características químicas do meio – principal 
causa desvio lei: utilização de substancias 
concentradas 
 O aumento da concentração é crescente até 
um ponto limite deixando de existir a 
proporcionalidade linear entre os valores 
 
 Limite de linearidade: representa o limite de 
concentração na qual a lei de Lambert – Beer é 
valida 
 
 Concentrações superior ao limite de linearidade 
(desvio da lei) deixa de existir a 
proporcionalidade linear entre concentração e 
absorbância 
Espectrofotômetro 
 Instrumento utilizado para determinar 
valores de transmitância(luz transmitida) e 
absorbância(luz absorvida) de uma 
solução em um ou mais comprimentos de 
onda. 
Componentes espectrofotômetro 
 Luz (lâmpada) fracionada por um prisma 
(monocromador)nos comprimentos de onda que a 
compões (luzes monocromáticas) 
 
 O comprimento de onda é dirigido para solução (cubeta) 
sendo parte absorvida e parte transmitida 
 
 A redução da intensidade luminosa é medida pelo 
detector(célula fotoelétrica) porque o sinal elétrico de 
saída depende da intensidade da luz incidida. 
Componentes espectrofotômetro 
 O sinal elétrico amplificado e sinalizado no galvanômetro 
em números é lido como absorvancia sendo proporcional 
a [ ] da substancia absorvente da cubeta