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GENÉTICA Prof. William Volino Aula 9: Diagnóstico Molecular GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Conteúdo programático Definição de diagnóstico molecular A técnica de PCR, suas etapas e aplicações da PCR As análises utilizando enzimas de restrição As técnicas de eletroforese de DNA Relação das técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Introdução Qual a importância do Diagnóstico Molecular? Vamos assistir ao vídeo que se encontra no Conteúdo On line para responder! http://www.biosphera.com.br/hpv-cancer-de-colo-de-utero.asp GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Conceito: Utilização de técnicas moleculares para o diagnóstico de doenças, genéticas ou não genéticas. Nos dois casos será possível fazer o diagnóstico das doenças antes que se manifestem e fornecer informações importantes para a escolha do melhor tratamento e estabelecimento do prognóstico. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Em doenças genéticas tem como objetivo: - Detectar mutações em genes; - Caracterizar mutações; - Estudar a ocorrência e frequência de mutações em determinadas populações; - Estudar características específicas do gene em questão; - Estudar o tipo de mutação (mutação pontual, grandes deleções, inserções, etc.), entre outras. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Em doenças não genéticas tem como objetivo: - Diagnosticar doenças infecciosas; - Identificar o agente infeccioso (vírus, bactérias, protozoários, fungos) através da detecção do seu material genético; - Estudar o agente infeccioso em questão; - Avaliar a resposta ao tratamento. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular As técnicas moleculares incluem: • Amplificação enzimática do DNA (PCR) • Digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição • Separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR • Hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Consiste na replicação do DNA in vitro. É uma técnica que revolucionou a genética molecular, permitindo muitos avanços na área, como a clonagem, a produção de alimentos transgênicos, e etc. É considerada uma técnica altamente sensível, por ser capaz de detectar e amplificar DNA a partir de uma pequena quantidade na amostra. Além disso, é altamente específica, pois é capaz de detectar sequencias específicas de DNA, que sejam o alvo do estudo. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Aplicações da PCR Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas; Amplificação de genes para posterior clonagem e estudos de sua expressão; Determinação de variabilidade genética e identificação; Detecção de OGMs Sexagem e diagnóstico de doenças em embriões. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Preparo da reação de PCR DNA polimerase (Taq - Thermus aquaticus) Primers ou iniciadores Nucleotídeos (A, T, G e C) Tampão de pH DNA (ou RNA) Mg++ GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular A reação é feita por termocicladores, máquinas que realizam vários ciclos térmicos de acordo com a programação. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular A reação ocorre em três fases (ciclo) Desnaturação – as duas fitas do DNA são separadas pela alta temperatura. Anelamento – os primers se ligam à sequencia alvo, marcando o seu início e o seu fim. Extensão – A Taq polimerase produz o novo DNA, complementar à sequencia alvo. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular A análise é feita por eletroforese, que separa os fragmentos de DNA em um gel de acordo com o seu tamanho. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular O gel é analisado num transiluminador UV e fotografado. O DNA amplificado emite fluorescência. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Anemia falciforme GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Infecção pelo HPV GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Análise com enzimas de restrição e sondas de DNA As enzimas de restrição e as sondas de DNA também podem ser utilizadas na realização do diagnóstico molecular, pois permite que o DNA seja analisado de diferentes formas. Este tipo de diagnóstico pode ser empregado em estudos de identificação humana e criminalística. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Enzimas de restrição São enzimas encontradas em bactérias, utilizadas para realizar cortes no DNA. Cada enzima de restrição corta o material genético em um sítio específico, que são palíndromos. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Os fragmentos gerados pelas enzimas de restrição são separados através de uma eletroforese em gel. A análise destes fragmentos se chama RFLP (Polimorfismo dos fragmentos gerados por enzimas de restrição). Existe um padrão de tamanho dos vários fragmentos gerados, que depende da existência dos sítios de corte no genoma do indivíduo. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Após a corrida o DNA é transferido para uma membrana para posterior hibridização com sondas de DNA. Para identificação dos fragmentos são utilizadas sondas de DNA. A sonda consiste em um segmento de DNA produzido em laboratório que é complementar à sequencia alvo de DNA, que se liga (hibridiza) ao DNA e permite a sua identificação. GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Teste de paternidade: GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Teste de identificação de criminoso: GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular “Impressão digital” de DNA: GENÉTICA Aula 9: Diagnóstico Molecular Nesta aula vimos: Definição de diagnóstico molecular A técnica de PCR, suas etapas e aplicações da PCR As análises utilizando enzimas de restrição As técnicas de eletroforese de DNA Relação das técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico
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