Sequenciamento de DNA

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2. O que é o sequenciamento de DNA?
 Não é nenhuma novidade que as características dos seres vivos são determinadas pelo seu DNA, molécula composta basicamente por nucleotídeos. Existem quatro tipos deles, cada um composto por uma base nitrogenada diferente: Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T). O que difere uma molécula de DNA de outra é a posição em que esses nucleotídeos estão dispostos. Essa ordem é de grande importância, já que é responsável por codificar as informações genéticas para o crescimento e desenvolvimento dos organismos.
 O sequenciamento de DNA nada mais é do que a determinação da ordem exata em que os nucleotídeos se encontram ao longo dessa dupla fita tão adorada por nós. Existem diversas ferramentas para sequenciamento e sua história é genial.
3. A história do sequenciamento de DNA
 Desde que Watson e Crick desvendaram a estrutura tridimensional do DNA em 1953 (com a ajuda de dados de cristalografia produzidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins), muitos avanços aconteceram e contribuíram para elucidar a replicação do DNA, bem como a tradução de ácidos nucléicos em proteínas. Contudo, a habilidade de “ler” ou sequenciar o DNA não acompanhou esses avanços.
 As estratégias até então desenvolvidas, usadas para inferir a sequência de cadeias de proteínas, não se aplicavam a ácidos nucleicos, pois as moléculas de DNA eram feitas de inúmeras pequenas unidades similares umas às outras, sendo difícil distingui-las. Dessa forma, os cientistas conseguiam mensurar a composição dos nucleotídeos, mas não a sua ordem.
 
 As descobertas de Watson e Crick contribuíram para elucidar o Dogma Central da Biologia: o DNA contém o código genético original para a produção de proteínas que as células vivas necessitam, e o RNA mensageiro (mRNA) é uma cópia do gene que é traduzido para formar essas proteínas.
 Foi somente na década de 70 que os primeiros métodos para sequenciamento de DNA foram criados, dando início à era de sequenciamento de primeira geração. Essa mudança, responsável por um grande impacto na ciência, aconteceu com a utilização da técnica de separação de polinucleotídeos por comprimento através da eletroforese em gel, sendo utilizada em dois protocolos: o método de sequenciamento químico de Allan Maxam e Walter Gilbert e o sistema de Alan Coulson e Frederick Sanger.
 O procedimento de Maxam e Gilbert determina a sequência das bases através da clivagem química da terminação 5’ dos fragmentos de DNA marcados radioativamente. Já a metodologia de Sanger e Coulon determina a sequência de nucleotídeos através da síntese de uma fita simples de DNA utilizando a DNA polimerase e didesoxinucleotídeos (ddNTPs). O uso da DNA polimerase é a principal diferença entre os métodos.
4. O legado de Frederick Sanger
 Frederick Sanger foi responsável por dois dos mais importantes avanços técnicos na área de genética. Primeiro, no início da década de 50, ele desenvolveu um método para determinar a sequência de aminoácidos de um polipeptídio e o fez funcionar no sequenciamento de aminoácidos da insulina.
 Este trabalho, finalizado em 1955, forneceu a primeira prova de que os aminoácidos em uma proteína estão presentes em uma sequência constante e geneticamente determinada. Isto deu aos biólogos moleculares a confiança em atacar outros problemas, tais como o código genético.
 Então, em 1977, Sanger aperfeiçoou um método rápido de sequenciamento do DNA. Por essa razão, ficou conhecido como método de sequenciamento de Sanger. Abriu assim a porta para a análise da estrutura do gene e sua organização. Ambos os avanços foram valiosos e reconhecidos com prêmios Nobel, em 1958 e 1980.
 A técnica desenvolvida por Sanger alterou para sempre a tecnologia de sequenciamento de DNA. essa metodologia utiliza ddNTPs, análogos químicos dos desoxirribonucleotídeos (dNTPs), os monômeros das cadeias de DNA, misturando-os em uma reação de PCR.
 Ao misturar os ddNTPs marcados radioativamente em uma reação de PCR, a síntese da nova fita de DNA continua até que um dos análogos seja incorporado, já que os ddNTPs não possuem o grupo hidroxila 3’ necessário para a extensão das cadeias de DNA. Quando isso ocorre, a etapa de elongação termina e a fita é inacabada. Cada reação vai terminar contendo uma mistura com diferentes comprimentos de fitas de DNA, todas terminadas com o ddNTP marcado para aquela reação, que serão visualizados por autoradiografia ou luz ultravioleta.
 Com o mesmo princípio das outras técnicas (o de produzir todos os possíveis comprimentos de sequências e marcá-las com um nucleotídeo final), a precisão e facilidade de uso levaram o método de terminação de cadeia didesoxi – ou simplesmente, sequenciamento de Sanger – a se tornar a tecnologia de sequenciamento mais utilizada nos anos seguintes.
 Frederick Sanger (1918-2013) foi um bioquímico inglês presente na lista das únicas 5 pessoas agraciadas com dois prêmios Nobel. Seus dois prêmios foram em Química. O segundo prêmio (1980) foi vencido devido ao sequenciamento do genoma completo de um bacteriófago em 1977. 
5. O Projeto Genoma Humano
 O Projeto Genoma teve como objetivo determinar a sequência de todo o genoma humano. Esse esforço de pesquisa internacional, custando mais de US $ 3 bilhões e levando 13 anos para ser concluído. A primeira sequência completa foi determinada em abril de 2003.
 O DNA sequenciado no Projeto Genoma Humano foi obtido a partir de 21 doadores, homens e mulheres, de diferentes grupos étnicos. O resultado possibilitou avaliar muitas informações sobre as diferenças entre os indivíduos de uma mesma espécie.
 Esse mapeamento abriu diversas fronteiras e forneceu meios para identificar mutações e doenças genéticas específicas. Pode determinar quais trechos de DNA contêm genes e quais trechos carregam instruções de regulação, ligando ou desligando os genes. Também abriu caminho para uma medicina mais personalizada, permitindo aos cientistas examinar até que ponto a resposta de um paciente a um medicamento é determinada pelo seu perfil genético.
 Essas conquistas exigiram o desenvolvimento e aprimoramento de novas tecnologias, com a intenção de melhorar a eficácia dos cuidados de saúde e promover a saúde humana. 
 Dentre as vantagens do projeto, o conhecimento de risco do desenvolvimento de patologias é a principal. Esse conhecimento permite o planejamento familiar por meio de aconselhamento genético.
 Apesar das inúmeras vantagens e benefícios, a principal desvantagem do projeto envolve a questão ética. A manipulação genética ainda é uma área recente e que vai além das questões científicas.
6. Automação do método de Sanger
 Os avanços técnicos possibilitaram automatizar o sequenciamento, trazendo melhorias para o método de Sanger.
 Os equipamentos são capazes de misturar os reagentes, aplicá-los, fazer correr e ler a ordem das bases de nucleotídeos a partir de um gel. O uso de nucleotídeos terminadores de cadeia, marcados com agentes fluorescentes de cores diferentes, facilita esse processo.
 As quatro reações de síntese podem ser realizadas no mesmo tubo e os produtos podem ser separados em uma única canaleta de gel por eletroforese capilar. Um detector lê e grava a cor do marcador fluorescente em cada banda à medida que ela passa. Assim a sequência pode ser analisada.
7. Sequenciamento de Nova Geração: Next-Generation Sequence (NGS)
 A ciência não parava de avançar e, em 1986, uma empresa de biotecnologia (Applied Biosystems) iniciou a fabricação de uma máquina de sequenciamento automático baseado no método de Sanger. Essa máquina utilizava marcadores fluorescentes para cada nucleotídeo, permitindo que as reações fossem corridas em uma coluna e lidas pela cor que emitiam (em vez de serem lidas pela ordem das linhas em que apareciam).Apesar de serem mais caras que as placas de vidro e os géis tradicionais, essas máquinas demandam menos tempo e geram sequências de dados mais baratas que qualquer outro método tradicional. Motivo pelo qual elas foram utilizadas por Craig Venter para acelerar o Projeto Genoma Humano, por exemplo.
Sequenciador ABI PRISM produzido pela empresa Applied Biosystems. Esse sistema permitiu que as reações fossem corridas em uma coluna e lidas pela cor.
 Desde então, muitos avanços na tecnologia de sequenciamento aconteceram. Enquanto alguns desses progressos dependiam de melhorias do método de Sanger, a principal mudança aconteceu em 2005, com a emergência das técnicas de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing, NGS) – termo utilizado para qualquer sequenciador que não era baseado no método de terminação em cadeia.
 A nova geração começou com um sistema desenvolvido pela empresa de biotecnologia 454 – Roche, que foi utilizado para sequenciar o genoma inteiro da bactéria Mycoplasma genitalium. Nessa metodologia, a incorporação de um nucleotídeo é traduzida pela emissão de luz por ação da luciferase (pirosequenciamento).
 Nos anos seguintes, vários métodos de nova geração surgiram ao mesmo tempo: métodos de segunda geração como Ion Torrent e Illumina; e de terceira geração como o Pacific Biosciences e a Oxford Nanopore. Apesar das diferenças consideráveis entre eles, todos têm como principal característica o processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA. Enquanto um sequenciador que utiliza eletroforese processa, no máximo, 96 fragmentos por vez, os sequenciadores de nova geração podem ler até bilhões de fragmentos simultaneamente.
 Através do NGS é possível realizar o sequenciamento de um genoma inteiro em questão de dias. A sua velocidade, capacidade de gerar dados em larga escala e precisão, a um custo inferior aos métodos tradicionais ganha, a cada dia, mais espaço.
 O princípio básico das plataformas de NGS está em sequenciar várias moléculas diferentes (ou vários fragmentos diferentes provenientes do mesmo genoma) em paralelo. Logo, elas diferem fundamentalmente das metodologias de Sanger, em que uma única sequência de DNA, oriunda de um trecho específico, é obtida em cada reação. Isso é possível graças à integração de ferramentas de nanotecnologia, robótica e informática em aparelhos de alto desempenho.
8. A importância do sequenciamento
 Graças à tecnologia de sequenciamento, pesquisadores atualmente são capazes de comparar grandes extensões de DNA ,1 milhão de bases ou mais, de indivíduos distintos, de maneira mais rápida e barata. Tais comparações geram grande quantidade de informações que permitem que os pesquisadores identifiquem mudanças nos genes, associações entre genótipos de doenças e fenótipos, além de contribuir com a identificação de potenciais alvos para drogas.
 Além disso, a habilidade de sequenciar o genoma mais rapidamente e com melhor custo-benefício cria o potencial para diagnóstico e terapias de doenças genéticas. Apesar da utilização de sequenciamento de DNA em consultórios médicos ainda estar distante da realidade, alguns centros médicos e de pesquisa já utilizam a técnica para detectar (e prevenir) algumas doenças em pacientes de risco, como certos tipos de câncer.
 O sequenciamento de DNA também é utilizado em diversas áreas da ciência, como em estudos evolutivos, na compreensão da relação entre organismos distintos e sua evolução. Além disso, pode ser utilizado para monitoramento ambiental, validação de matérias-primas e insumos, detecção de fraude de alimentos, análise de microbioma em plantas, entre outro.
O sequenciamento de DNA também possui papel fundamental no monitoramento ambiental. Utilizando uma pequena amostra, é possível conhecer todos os micro-organismos presentes no momento da coleta, contribuindo, dessa maneira, com a tomada de decisão em casos de contaminação.
1.Introdução
 A partir da descoberta da estrutura do DNA, importantes avanços levaram a compreensão da complexidade e diversidade de genomas. Os conhecimentos existentes sobre a organização do gene e genoma eram baseados principalmente em estudos de genética reversa, na qual a sequência de aminoácidos do produto do gene de interesse é retrotraduzida em uma sequência de nucleotídeos com base nos códons apropriados.
 O DNA pôde ser decifrado no final da década de 1970, quando dois grupos de pesquisadores, um liderado por Sanger e outro por Gilbert desenvolveram diferentes estratégias de sequenciamento. Nos dias atuais existem as técnicas de sequenciamento de nova geração, as NGS, e as técnicas de terceira geração, essas ainda em desenvolvimento. Em todos os processos utilizados, o objetivo final do sequenciamento de DNA é a leitura e identificação da ordem exata em que está às bases nitrogenadas, o que determina cada gene.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO..........................................................................................3 
O que é sequenciamento de DNA..........................................................4
A história do sequenciamento de DNA.................................................4
O legado de Frederick Sanger...............................................................6
Projeto Genoma Humano.......................................................................8
Automação de Sanger............................................................................9
Sequenciamento de nova geração.......................................................10
A importância do sequenciamento......................................................12
CONCLUSÃO..........................................................................................14
 REFERÊNCIAS..............................................................................................15
9. CONCLUSÃO
 Hoje é possível, portanto, determinar mais rapidamente uma sequência completa de um genoma humano, diferente do período inicial do Projeto Genoma. Os pesquisadores agora são capazes de comparar grandes extensões de DNA (1 milhão de bases ou mais) de indivíduos diferentes, com mais agilidade.
 Essas comparações podem gerar uma enorme quantidade de informações sobre o papel da herança na suscetibilidade a doenças e em resposta a influências ambientais. Abrem-se assim novas perspectivas para a medicina baseada nas características genéticas de cada indivíduo, criando um vasto potencial para diagnósticos e terapias.
 Da mesma forma, é possível determinar todo o conjunto de microrganismos presente em um ambiente (microbioma) a partir do sequenciamento de todo o DNA ali encontrado. Ou até mesmo comparar as sequências do genoma de diferentes tipos de animais e organismos, fornecendo insights sobre a biologia do desenvolvimento e da evolução.
REFERÊCIAS
Snustad, D. P.; Simmons, M. J. Fundamentos de Genética. Guanabara Koogan, 2ª edição. Rio de Janeiro 2001.
Scheid, N. M. J.; Ferrari, N.; Delizoicov, D. A construção coletiva do conhecimento científico sobre a estrutura do DNA, Ciência & Educação, v. 11, n. 2, p. 223-233, 2005.
Ferreira, M. E., Neto, C. R. B. A Importância da Pesquisa Genômica e o Sequenciamento de DNA. Comunicado Técnico n.91, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2003.
BASTOS, E. C. B. et al. Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na genômica de plantas. Cienc. Rural, Santa Maria, v. 40, n. 3, Mar. 2010.
Neoprospecta. A importância do sequenciamento de DNA. Disponível em: https://blog.neoprospecta.com/a-importancia-do-sequenciamento-de-dna/. 2017.
Neoprospecta. Sequenciamento de nova geração. Disponível em: https://blog.neoprospecta.com/sequenciamento-de-nova-geracao-ngs/.. 2017.