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AULA - 06/04/2017
Diagnóstico microbiológico das infecções do Sistema Nervoso Central (SNC)
SNC
Quando o indivíduo tem uma infecção no SNC, logo associamos a uma meningite. 
A meningite pode ser de origem:
Bacteriana (chamada de meningite bacteriana aguda – normalmente é a mais frequente no SNC);
Viral (chamada também de meningite asséptica);
Fúngica;
Micobactérias (indivíduos imunossuprimidos - TB extrapulmonar);
Parasitária;
Ou causada por outros microrganismos.
Ultimamente ela tem sido muito associada com o microrganismo Haemophilus influenzae tipo b, no entanto com as vacinas hoje em dia utilizando antígenos de Haemophilus tivemos uma alteração na epidemiologia e a meningite não é só causada por este. 
Existe uma relação faixa etária – microrganismos, isto é, dependendo da idade do indivíduo, o tipo de microrganismo encontrado é diferente. Veja o quadro abaixo (esse quadro não cai na prova, mais ajuda bastante em exames microbiológicos para o SNC):
Espécime clínico e coleta
Quando falamos de SNC, a amostra que chega ao laboratório para a identificação do microrganismo é o LCR (líquor cefalorraquidiano), este deve ser colhido em tubo estéril, enviado diretamente ao laboratório e em temperatura ambiente. O volume mínimo recomendado deve ser 1 ml para o isolamento de bactéria e 2 ml para o isolamento de fungos ou micobactérias. 	
Algumas vezes pode chegar 2 tubos de LCR do mesmo paciente ao laboratório, o procedimento a ser seguido é: escolher somente um tubo, e preferencialmente o tubo que estiver mais turvo, isso porque pode conter um pouco mais de bactérias, mas o principal é que o tubo contém mais informações, isto é, quais os parâmetros que devem ser medidos (células totais, células predominantes, fazer a dosagem de glicose, lactato e proteína – todos esses achados ajudam no diagnóstico microbiológico).
A coleta do LCR deve ser feita por meio de uma punção na lombar.
Controle de qualidade
Deve ser muito grande o controle de qualidade para evitar erros (não dar um diagnóstico errado ao paciente podendo leva-lo a óbito). Ver prazo de validade de tudo; Ver se o material está bem condicionado (se é material de geladeira ou temperatura ambiente); Manutenção de microrganismos conhecidos (fazer comparações).
Os meios de cultura utilizados devem ser controlados para verificar os microrganismos que vão crescer nesses meios (a padronização e o controle de qualidade devem ser bastante rígidos para que não ocorra contaminação). Além disso, ainda podemos utilizar kits de testes rápidos diretamente no LCR.
O padrão ouro para o diagnóstico de meningites é a cultura de LCR. Outra forma de diagnóstico é através do PCR.
Procedimento Laboratorial
Esses parâmetros no quadro ao lado são importantes para nos orientar, ou seja, com isso saberemos se o LCR tem uma suspeita ausência ou de presença de infecção. E se essa infecção pode ser viral, bacteriana ou fúngica. Isso porque, dependendo da dosagem teremos o diagnóstico laboratorial. Observe o quadro abaixo:
Observação: o professor não quer que decore esse quadro, mas quer que a gente saiba que esses parâmetros são importantes para dizer se o paciente está com ausência ou uma provável infecção, e se a meningite é asséptica (viral), bacteriana, fúngica ou causada por uma micobactéria. E associando esse quadro junto com o quadro de microrganismos mais prováveis por faixa etária, isso faz com que criemos um mecanismo para saber qual microrganismo queremos visualizar. 
Testes rápidos / Látex
O princípio do teste rápido é verificar a presença de antígenos específicos. Normalmente esses testes rápidos ocorrem por aglutinação de partículas de látex. 
Os antígenos mais comumente pesquisados são os de N. meningitidis sorogrupos A, C, Y, W135 e B, E. coli K 1, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b, S. galactiae e Cryptococcus neoformans. 
A sensibilidade desse teste é variável, por isso o padrão ouro não é o teste rápido. Esse teste dá o diagnostico inicial e a confirmação deve ser feita com a cultura do material. Não é 100% confiável.
Microrganismo X Sensibilidade
65 a 71% para S pneumoniae;
88 a 95% para Haemophilus influenzae;
97% para S. agalactiae;
64% para Neisseria meningitidis, com 98% de especificidade;
Microscopia
A microscopia no LCR tem valor diagnóstico, e ela pode ser feita com material a fresco, através da coloração pelo método de Gram (verificar bactérias gram+ e gram-), coloração pelo método de Ziehl-Neelsen (verificar a presença de micobactérias) e tinta da China ou Tinta Nanquim (verificar a presença de fungos).
Semeadura primária – Cultura 
Os meios de cultura utilizados são: meio ágar sangue ou ágar chocolate (são os mais utilizados), meio Thayer-Martin (utilizado como meio seletivo – utilizado para Neisseria (gonorrohoeae e meningitidis)).
Identificação dos principais patógenos
Streptococcus pneumoniae (pneumococos).
 Microscopia pelo método de Gram (Resultado = diplococos Gram + lanceolados);
Padrão de hemólise em ágar sangue (Resultado = hemólise parcial - alfa hemolítico);
Teste de susceptibilidade à Optoquina (Resultado = sensível);
Teste da bile solubilidade (Resultado = solúvel) Principal;
Sorotipagem (é um tipo de teste rápido).
Haemophilus influenzae (cresce no ágar chocolate, mas não cresce no ágar sangue).
Microscopia pelo método de Gram (Resultado = cocobacilos ou bacilos Gram -);
Satelismo (utilizando S. epidermidis);
Discos de fatores de crescimento X e V;
Fermentação de açúcares (Glicose, xilose, frutose (esses têm uma fermentação variável) e sacarose (o H. influenzae não é capaz de fermentar));
Sorotipagem (Resultado = reação de aglutinação).
Neisseria meningitidis
 Microscopia pelo método de Gram (resultado = diplococos Gram negativos);
Teste de oxidase (verifica se a bactéria possui a enzima citocromo oxidase. Nesse teste pegamos uma tira que esteja impregnada com reagente, e se a bactéria tiver citocromo oxidase vai ocorrer uma oxidação, e essa tira impregnada que tem a coloração cinza fica escura) e catalase (resultado dos testes = positivo);
Fermentação de carboidratos (glicose e maltose são positivos (ocorre fermentação), sacarose e lactose são negativos (não ocorre fermentação));
Sorotipagem (testes rápidos).
Streptococcus agalactiae
Microscopia pelo método de Gram (Resultado = Cocos Gram positivos em cadeia);
Padrão de hemólise em ágar sangue (Resultado = beta-hemolítico (hemólise total));
Bile esculina (resultado = negativo – é um teste utilizado para ver a presença de enterococos);
Nacl 6,5% (resultado = sensível – a concentração usual do soro fisiológico é de 0,9% de cloreto de sódio e essa quantidade torna a solução isotônica em relação às células (não vai agredir a célula). A concentração utilizada no teste vai ser hipertônica, e vai fazer com que mais Nacl entre na bactéria até que chega um ponto que ela estoura, matando- a);
Teste CAMP (resultado = positivo – esse teste faz a inoculação da bactéria junto com S. aureus; Observar se ocorrer hemólise (formação de seta) na proximidade da tira)).
Listeria monocytogenes
Microscopia pelo método de Gram (Resultado = Bacilos Gram positivos curtos);
Teste da catalase (Resultado = Positivo);
Teste da oxidase (Resultado = Negativo);
Bile esculina e NaCl 6,5% (Resultado = Positivo / Resistente);
Teste CAMP (Resultado = Positivo);
Fermentação da glicose (Resultado = Positivo);
Padrão de hemólise (Resultado = beta-hemolítico);
Motilidade (Móvel em TA (aspecto de “guarda-chuva”)).
Observação – o que saber dessa matéria:
Infecções associada à meningite;
Pode ser de origem asséptica (viral), bacteriana, fúngica ou por micobactérias;
Existem microrganismos de prevalência conforme a idade;
Qual a amostra que utilizamos para fazer o diagnóstico (R.: LCR);
Se tiverem dois tubos de LCR qual deve ser colhido (R.: o mais turvo, isso porque pode conter mais bactérias, mas principalmente terá mais informações e obteremos mais parâmetros);
Parâmetros: ver quais são as célulaspresentes, células predominantes, dosagem de lactado, glicose e proteína, isso porque esses parâmetros acabam dando indício de ausência ou presença de infecção (bacteriana, viral, fúngica ou micobactérias);
Juntamente com os parâmetros devemos ver o quadro por faixa etária do paciente veremos quais são as bactérias mais prováveis que estão causando a infecção;
Fazer microscopia usando método de Gram, Ziehl – Neelsen, Tinta da China ou Nanquim (A coloração de Gram pode ser usada como diagnóstico isso se for suspeita de micobactéria, porem pode ser que não dê para visualizar então fazemos Ziehl-Neelsen. E se for suspeita de fungo fazemos o método da Tinta nanquim);
O meio de cultura utilizado é o ágar sangue, chocolate e meio Thayer-Martin (seletivo para neisseria);
Depois de identificar, fazer um antibiograma (para poder liberar qual antibiótico o paciente tomar).
Liberação do laudo. 
Diagnóstico microbiológico das infecções sistêmicas (Hemoculturas) 
Hemocultura é a cultura de sangue e é feita quando o paciente tem uma infecção sistêmica.
Normalmente é feita uma coleta simultânea em um único local de 2 punções (venosa) de um par de frascos, ou seja, 2 tubos de cada punção (geralmente um para aeróbio e outro para anaeróbio).
Bacteremia X Septicemia (as duas são bacterianas)
Bacteremia – é quando a bactéria entra na corrente sanguínea (é circulante/ transitório), mas não colonizaram a corrente sanguínea.
Exemplos: pode ocorrer devido a um foco de infecção primária (amigdalite); extração do dente siso (deve-se tomar antibiótico antes da extração – medida profilática);
A bactéria pode se alojar em uma válvula cardíaca (leva a miocardite bacteriana), em uma articulação (leva a febre reumática);
Septicemia – é uma infecção generalizada. A bactéria entrou na corrente sanguínea e colonizou o sangue (ela se divide e se multiplica no sangue).
A invasão de microrganismos no sangue, tanto por bacteremia quanto por septicemia pode ser dada por drenagem de microrganismos a partir de um foco infeccioso ou acesso direto à corrente sanguínea.
Microrganismos mais frequentemente encontrados em hemoculturas (não são exclusivos)
Gram positivos - S. aureus, Staphylococcus coagulase negativo (ECN), Enterococcus spp., Streptococcus spp. e mais raramente outros como L. monocytogenes e Corynebacterium diphtheriae (difteria);
Gram negativos - Enterobactérias, E. coli, Salmonella (as duas anteriores são importantes) Enterobacter spp., Serratia marcescens, Klebsella pneumoniae; bacilos Gram negativos não fermentadores, como, P. aeroginosa, Acinetobacter baumanni, Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophila. Além de cocos Gram negativos como N. meningitidis.
Observação:
Últimos anos o aumento significativo de ECN (tem dificuldade na interpretação dos resultados).
O S. aureus é coagulase positiva, já S. epidermidis (está presente na pele – flora normal) e saprofitis é coagulase negativa. Na coleta sanguínea fazemos uma punção direta venosa e antes de fazer a coleta fazemos uma assepsia do local. Porem ao realizar a punção venosa pode ser também que seja coletada a microbiota do local da punção, e pode conter S. epidermidis. Então, se observamos presença desse tipo de staphylococcus na amostra coletada, como saberemos se esse sangue está realmente contaminado por essa bactéria ou se essa contaminação se deu no momento da coleta? Deveremos pedir mais duas amostras. Porque aí se nessas outras duas amostras detectar S. epidermidis, realmente o paciente está com essa infecção, caso contrário, a detecção de S. epidermidis na primeira amostra foi devido a uma contaminação durante a coleta.
Bacteremia por bactérias anaeróbias são muito raras.
Em relação aos fungos, devemos dar importância para cândida e cryptococcus neoformans.
Procedimento
Espécime Clínico 
Amostras são coletadas por punção venosa
Número de amostras
Adultos - 2 a 3 amostras (normalmente são amostras de locais diferente e são amostras simultâneas. Ao realizar a punção em um local coleta-se duas amostras, uma para crescimento aeróbio e outra para anaeróbio. Então vai para o local da segunda punção e também realiza 2 coletas (aeróbio e anaeróbio).
Crianças - 2 amostras 
Volume de Sangue 
Adultos - 8 a 10 ml por punção em cada frasco; 
Crianças (1 a 6 anos) - 1 a 5 mL por punção em frascos pediátricos; 
Recém-nascidos - 0,5 a 1 mL por punção em frascos pediátricos.
Intervalo entre as coletas de amostras
Geralmente 2 amostras de hemocultura são suficientes, porém se houver solicitação médica de uma terceira amostra, repetir o procedimento após outros 15 a 20 minutos ou em 24 horas, dependendo da urgência do estado clínico e/ou necessidade de introdução de antibioticoterapia imediata. 
Se o paciente já estiver fazendo o uso de antibioticoterapia, o ideal é que a coleta seja realizada 1 hora antes de tomar o medicamento. Isso porque, provavelmente nesse tempo a concentração de antibiótico no sangue é baixa e isso não vai interferir no crescimento do microorganismo.
Observação: esse intervalo de 15 a 20 minutos é para o paciente descansar entre uma coleta e outra, essa pausa não tem nenhuma condição biológica.
Frascos de coleta
Existem dois tipos de metodologias: manuais e automatizadas. Hoje em dia o mais preconizado é a metodologia automatizada, porém ainda se faz muito a manual.
Metodologias manuais – se pega o meio de cultura e adiciona-se o anticoagulante SPS (polianetolsulfonato sódico – serva para meio aeróbio e anaeróbio) 0,025 a 0,05%. Ex: BHI;
O SPS pode ter ação inibitória sobre alguns antibióticos, principalmente para aminoglicosídeos e polimixinas; inibe algumas frações do complemento e inibe parcialmente a fagocitose. Além disso, ele tem uma ação inibitória para certos microrganismos, ou seja, o anticoagulante acaba sendo eficiente para não deixar o sangue coagular, inibir a ação do antibiótico, porém não deixa os microrganismos crescerem, como no caso de N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Peptostreptococcus sp e Moraxella catarrhalis. Caso tenha suspeita de algum desses microrganismos deve-se acrescer ao frasco de coleta 1,2% de gelatina para inibir parcialmente os efeitos nocivos do SPS. 
Observação: nesse tipo de metodologia tem diversos passos, e é aí que pode ter algum tipo de erro, levando assim ao diagnóstico errado daquela cultura. 
Metodologias automatizadas – o frasco já vem preparado, já vem com os aditivos que é o anticoagulante, o aditivo que inibe a ação de alguns antibióticos. E às vezes o próprio sangue pode ser coletado diretamente no frasco, com isso não se tem manipulação.
Na metodologia automatizada após o sangue ser colocado no frasco, este vai para estufa escura e é ela que vai reconhecer se o material está contaminado ou não. Esse reconhecimento é feito através da tampa do frasco. O aparelho consegue reconhecer a produção ou o consumo de gases, e quando ele reconhece isso geralmente à cor da tampa muda. Após a estufa sinalizar o tubo que está contaminado, pegamos esse tubo e fazemos a semeadura. 
Procedimentos
Amostras coletadas sem antissepsia adequada podem levar ao isolamento de microrganismos contaminantes, não relacionados ao processo infeccioso;
Uma técnica de antissepsia muito utilizada é passar o degermante no local da punção em movimento circular e para fora, depois vir com uma gaze com álcool a 70% e passar no local em movimento circular e para fora e depois vem com uma gaze limpa e seca e passa sobre o local.
Essa antissepsia é muito importante, pois se não for realizada de forma adequada poderá haver contaminação da amostra coletada, levando a um falso-negativo. 
O método de coleta utilizado é crítico para a obtenção de resultados confiáveis;
Fazer coleta durante a ascensão da temperatura (isso porque a quantidade de microrganismo é maior) e, de preferência, antes da antibioticoterapia.
Transporte
Os frascos contendo as amostras devem ser enviados ao laboratório à temperatura ambiente (20 – 25oC) até 12 horas apósa coleta ou então refrigerados até chegar ao laboratório;
O resultado da hemocultura depende também da rapidez do transporte ao laboratório, principalmente quando a metodologia utilizada é a automatizada (melhor e mais rápida).
Não é recomendado realizar coloração pelo método de Gram das amostras de sangue devido à baixa sensibilidade nesse tipo de material clínico, isso porque o sangue tem muitas células e isso torna difícil achar bactérias no meio de tantas células (se encontrarmos, o paciente está com uma septicemia muito elevada – pode ir a óbito).
Metodologia manual
Não é recomendada atualmente;
Mínimo de 7 dias de incubação dos frascos, ou seja, se não visualizar presença de microrganismo no primeiro dia, deve-se ir até o sétimo dia para ver se vai ter;
Tanto os frascos de hemocultura como os sub-cultivos devem ser mantidos a 35-37°C e em microaerofilia (estufa mantendo 5% de atmosfera de CO2);
Meios de cultura para sub-cultivo
Ágar chocolate e ágar sangue, ou seja, a cada dia será feita uma semeadura em um dos meios.
Como é feito o exame? – Devemos saber muito bem esse quadro:
Primeiro dia:
Após a coleta, incubar o frasco na estufa a 37°C por 24h.
Segundo dia:
Depois se deve semear com ágar chocolate e/ou sangue;
Colocar novamente na estufa por 24h a 37°C;
Verificar se houve crescimento ou não.
Se houver crescimento, devemos fazer a identificação da bactéria e fazer o antibiograma (TSA).
Observação: podemos até fazer coloração de Gram e emitir um laudo parcial.
Se não houver crescimento o frasco volta para a estufa, ficando por 48h.
Terceiro dia:
Depois se deve semear com ágar chocolate e/ou sangue;
Colocar novamente na estufa por 24h a 37°C;
Verificar se houve crescimento ou não.
Se houver crescimento, devemos fazer a identificação da bactéria e fazer o antibiograma (TSA).
Observação: podemos até fazer coloração de Gram e emitir um laudo parcial.
Dias subsequentes até o sétimo dia:
Se não houver crescimento o frasco volta para a estufa (ficando lá até o 7° dia) e o procedimento sendo repetido.
Após o 7° dia pode ocorrer duas coisas se o teste der negativo: 
 Houve realmente a ausência de infecção;
O paciente está com uma infecção fúngica ou por micobactéria (bactérias de crescimento lento), e nesse caso a incubação é por mais 10 dias. 
Exemplo:
O indivíduo fez a coleta na segunda feira, e foi colocada em um frasco manual e foi para a estufa (por 24h). Na terça feira, pegamos esse frasco e fazemos a semeadura e voltamos com o frasco para a estufa (por 24h). Somente na quarta feira, olhamos a semeadura e vemos se houve ou não crescimento. Se ocorreu crescimento devemos identificar o microorganismo e fazer o antibiograma. Se não ocorreu crescimento, pegamos o frasco (2º dia – já se passaram 48h) novamente para fazer uma nova semeadura (volta o frasco pra estufa por 24h). Na quinta feira, olhamos a semeadura e vemos se houve ou não crescimento. Se ocorreu crescimento devemos identificar o microorganismo e fazer o antibiograma. Se não ocorreu crescimento, pegamos o frasco (3º dia – já se passaram 72h) novamente para fazer uma nova semeadura (volta o frasco pra estufa por 24h). E isso continua até o 7° dia se não houver crescimento antes disso. 
Metodologia automatizada
Existem diversos aparelhos no mercado para a realização de hemoculturas; 
Vantagens – rapidez, diminuição do trabalho técnico e diminuição de erros.
Protocolo, em geral, de 5 dias de incubação; 
Bactec e BacT-Alert - Baseado na detecção de CO2 produzido durante o metabolismo microbiano;
ESP System - Baseado na detecção de consumo e produção de gases.
Após o aparelho detectar os frascos positivos podemos agir de duas maneiras:
Primeira maneira:
Fazemos coloração de Gram. Teremos 2 resultados:
Positivo (visualização de bactérias gram + ou gram -) - podemos emitir um laudo com um resultado parcial;
Negativo (não visualizamos nenhuma bactéria) - devemos incubar o frasco novamente. 
Segunda maneira:
Fazer a semeadura dos frascos positivos, podendo ser em ágar sangue e ágar chocolate;
Verificar se houve crescimento ou não;
Se houver crescimento bacteriano e a coloração de Gram for +, devemos identificar e fazer antibiograma (TSA);
Se não houver crescimento bactéria e coloração de Gram for -, devemos reincubar o frasco até o 5º dia, isso porque às vezes o frasco não ficou tempo suficiente para as bactérias crescerem;
Se não houver crescimento bacteriano e a coloração de gram for +, devemos cultivar a bactéria em anaerobiose e depois que a bactéria crescer devemos fazer a identificação e antibiograma.
3 situações distintas:
No 1º caso, foi feita apenas uma amostra (o que é errado) e ocorreu contaminação da amostra. Conversar com o médico antes de liberar o laudo. 
No 2º caso, a primeira amostra deu positiva e a segunda também deu positiva, não ocorreu contaminação da amostra. Realmente o paciente está com um desses microrganismos no sangue. Fazer a identificação e um antibiograma (TSA).
No 3º caso, a primeira amostra deu positiva e a segunda deu negativa, ocorreu contaminação da amostra, provavelmente devido a uma má assepsia local na hora da coleta.
Identificação de prováveis patógenos
Staphylococcus aureus - coagulase (positiva);
Streptococcus pneumoniae - bile solubilidade, sensibilidade a optoquina;
Streptococcus agalactiae - catalase negativa e teste de gram +;
Neisseria meningitidis – catalase positiva, podemos fazer outros testes bioquímicos como fermentação de açúcares;
Haemophilus influenzae – teste do satelismo e fator de crescimento;
BGNNF - bacilos gram – não fermentadores.
Observação: 
Dar mais atenção à família de enterobatérias. 
Saber que toda enterobactéria é um microrganismo (com exceção de uma) fermentador de glicose e são oxidase negativa.
As enterobactérias não tem a enzima citocromo oxidase;
Um teste bioquímico para ver se tem enterobactérias, é fazer o teste OF glicose com óleo. A bactéria será semeada nesse meio, este possui um óleo em cima que serve para isolar a bactéria do ar atmosférico e quando colocamos o óleo no meio nos vemos a fermentação da glicose e o meio muda de cor, ele passa de verde para amarelo. Com essas mudanças saberemos que a bactéria é fermentadora;
Se a bactéria fermenta glicose, outro teste que devemos fazer é o teste da oxidase. Se der oxidase negativa (não muda a cor da tira), então teremos uma enterobactéria;
Não devemos confundir enterobactérias com enterococos.
Observação – o que saber dessa matéria:
Diferença de bacteremia e septicemia;
O ideal é que sempre tenhamos duas amostras;
Na metodologia manual temos que coletar um frasco para cultura de aeróbios e outro para anaeróbios. O frasco inicialmente fica 24h na estufa. Depois pegamos esse frasco e semeamos em ágar sangue ou ágar chocolate. Se houver crescimento fazemos a identificação e TSA (pode ser feita coloração de gram. Só não devemos fazer coloração de gram no sangue, pois não vai ter valor diagnóstico). Se não houver crescimento devemos realizar esse procedimento até o sétimo dia, e se mesmo assim não crescer nada, devemos pensar numa ausência de infecção ou então pensar numa infecção causada por fungos ou micobactérias. 
Na metodologia automatizada acaba sendo mais confiável porque diminui o trabalho técnico e diminui a possibilidade de erros. Teremos a certeza se o paciente tem uma infecção ou não, pois o frasco vai dar positivo ou não. Se o frasco der positivo faremos a coloração de gram e cultura. Na coloração de gram positiva poderemos emitir um laudo parcial dizendo se é uma gram + ou -. Na cultura, teremos que casar os resultados com a coloração de gram. Se a cultura for + e Gram +, deveremos identificar e fazer TSA. Se a cultura – e gram +, devemos cultivar em anaerobiose. Se a cultura – e gram -, devemos deixar o frasco mais tempo na estufa e esse frasco vai ficar até 5 dias e depois podemos desprezar. 
Se tivermos uma bactéria que seria um provável contaminante (ex.: staphylococcus epidermidis) e somente comuma amostra, o ideal é conversar com o médico (isso porque o médico pode falar que o paciente já melhorou e o mesmo não precisaria passar por uma nova coleta) ou reportar como contaminante ou liberar o laudo identificando o microrganismo e fazendo o TSA. 
Se tivermos duas amostras e as duas deram positivas, deveremos fazer a identificação, o TSA e liberar o laudo. Pode ocorrer também que as duas amostras tenham sido contaminadas, nesse caso deveremos realizar uma nova coleta. 
Se tivermos um frasco positivo e outro negativo, deveremos relatar que o correu contaminação proveniente do local da coleta. 
Um indício para que se tenha enterobactéria é que ocorra a fermentação de glicose e oxidase negativa.
PARA AV2
Principais testes para identificação de enterobactérias 
TSI (“Triple Sugar Iron” – triplo açúcar ferro) – temos num frasco o meio de cultura TSI e ele tem três açúcares (glicose, sacarose, lactose). Normalmente, a semeadura nesse meio ocorre com uma agulha bacteriológica, pegamos a colônia de bactéria e colocamos no meio. Perfuramos o meio quase até o final e depois chegando perto da superfície fazemos estrias. E depois disso encubamos a 37°C por 24 h. Após, veremos se ocorreu mudança de coloração na base e no ápice. A coloração do meio é um vermelho-alaranjado, e se mudar a coloração o meio vai para amarelo. Se mudar a base ocorreu à fermentação de glicose, e se mudar o ápice ocorreu fermentação de lactato e sacarose. Além disso, esse meio vai ver se a bactéria produziu ou não. Se a bactéria produzir gás o meio vai rachar ou se deslocar, veremos espaços dentro do tubo. Através desse meio vemos se a bactéria produz H2S (ácido sulfídrico). O H2S vai se combinar com o ferro que está no meio e vai formar o sulfeto ferroso, este tem uma coloração escura. 
SIM – teste bioquímico em meio SIM verifica se a bactéria produz H2S, indol (pela quebra do triptofano, ou seja, se a bactéria tem triptofanase) e ver se a bactéria é móvel ou não. 
	DIFERENÇAS
	 MEIO SIM
	MEIO TSI
	Termina perpendicularmente a borda do tubo
	Termina com um ângulo de 45°
	A semeadura do SIM é uma picada central com auxílio da agulha bacteriológica
	A semeadura também é feita com agulha bacteriológica, só que furamos o meio e fazemos estrias próximas à superfície.
	Se tiver presença de H2S o meio fica escuro
	H2S vai se combinar com o ferro que está no meio e vai formar o sulfeto ferroso, este tem uma coloração escura. 
	Para verificar a presença de indol, coloca-se um reagente e se na superfície ficar rosa é porque produziu indol
	Mudança de coloração na base e no ápice. A coloração do meio é um vermelho-alaranjado, e se mudar a coloração o meio vai para amarelo. Se mudar a base ocorreu à fermentação de glicose, e se mudar o ápice ocorreu fermentação de lactato e sacarose.
	Se a bactéria não for móvel ela vai crescer apenas no local que foi inoculada, ficando o meio turvo em um único local. E se ela for móvel, o meio vai ficar todo turvo.
	
Citrato – vê a capacidade da bactéria em consumir carbono a partir do citrato. Se houver o consumo, o meio muda de cor. É um meio verde, completamente inclinado onde a semeadura se dá apenas na superfície. Mais demorado. 
Urease – esse meio possui ureia; serve para ver se a bactéria produz ou não urease. Se ela produzir urease, o meio que é amarelo fica rosa (alcaliniza o meio). 
Descarboxilação e desaminação de aminoácidos (arginina, ornitinae lisina). 
Na prova, por exemplo, o quadro que ele vai dar:
TSI – base amarela e ápice vermelho – glicose (+), sacarose e lactose (-);
Com rachadura – produziu gás – H2S (-);
SIM – meio turvo – motilidade (+);
Citrato – meio verde – não houve mudança – (-);
Ureia – meio rosa – mudou de cor – (+).
NÃO SERÁ COBRADO NA PROVA
Enterococcus sp 
Eles não são da mesma família das enterobactérias.
Prova da catalase – Negativo;
Hidrólise da esculina (teste da bile esculina) – Positivo;
PYR – verifica a presença da enzima L-pirrolidonil-arilamidase; 
LAP – verifica a presença de L-leucina-arilamidase (esse teste se assemelha a PYR);
Resistência ao NaCl 6,5% - Enterococcus são resistentes, já streptococcus não;
Produção de pigmento amarelo observado na superfície do meio de ágar sangue. Após a visualização desse pigmento deve-se fazer a fermentação de alguns açúcares (chegamos a sp);
Descarboxilação da arginina - Realizado em anaerobiose e meio ácido; 
Fermentação de açúcares - Sacarose, L-arabinose, manitol, Drafinose, D-sorbitol, D-sorbose e Metil- -D-Glicopiranosídeo (MGP);
Motilidade.
Observação: O quadro de hemólise não cai na prova (não coloquei o quadro aqui).
Staphylococcus coagulase negativa 
Prova da catalase – Positivo; 
Prova da coagulase – Negativo (o positivo é o S. aureus);
Resistência a novobiocina – se a bactéria for sensível chegamos ao diagnóstico de S. epidermidis. E se a bactéria for resistente chegamos ao diagnóstico de S. saprophyticus;
Produção da enzima fosfatase alcalina;
Produção da enzima uréase;
Descarboxilação da ornitina;
Fermentação de açúcares - Manose, manitol e trealose.
AULA – 13/04/2017
Diagnóstico microbiológico das infecções do trato urinário (Urinoculturas)
Infecções de TU
O indivíduo faz uma urinocultura a partir do momento que se tem suspeita de uma infeção urinária.
A urina é estéril somente enquanto fica na bexiga, depois que ela passa pela uretra ela não é mais estéril.
Procedimento do exame de urina: fazer higiene local desprezando o primeiro jato e coletar a urina de jato médio. Ideal urinar no turno da manhã (houve acúmulo de bactérias durante a noite). Essa urina de jato médio em um indivíduo saudável contém bactéria, isso porque o primeiro jato foi para limpar a uretra, mas mesmo assim ainda ficam algumas bactérias na uretra, e estas vão contaminar a urina.
Como saber se a bactéria é por causa de uma infecção ou é da uretra? Devemos verificar a quantidade de bactérias, ou seja, hoje em dia o que é preconizado é que se tivermos até 10 mil bactérias por ml, significa dizer que o paciente está com ausência de infecção. Acima de 10 mil dizemos que tem infecção urinária.
Amostras de urina devem ser submetidas à cultura quando existem suspeitas de infecção do trato urinário, para controle de tratamento, ou em pacientes assintomáticos com alto risco de infecção; 
Agentes etiológicos mais frequentes - Escherichia coli (principal microrganismo), Klebsiella pneumoniae, Proteus sp e Enterobacter sp. Entre os cocos Gram positivos destacam-se Staphylococcus saprophyticus (principal), Streptococcus agalactiae (pode ocorrer bastante, principalmente em crianças) e Enterococcus sp;
ITU em pacientes ambulatoriais (internados) - > 70% de E. coli ; 
A análise do EAS (elementos anormais do sedimento) + urocultura vai ser de grande importância para interpretação dos resultados
Coleta do espécime clínico
Primeira urina da manhã em frasco estéril de rosca e boca larga, anterior ao uso de antimicrobianos; 
Tempo transcorrido entre a coleta e início das análises de no máximo 1 hora;
A sonda não é indicada porque vai ter muita bactéria, e isso pode contaminar a urina.
Microscopia pelo método de Gram 
A coloração de gram não é usada como diagnóstico;
Só terá valor diagnóstico em casos de amostras coletadas através de punção supra-púbica, isso porque não iremos passar pela uretra;
No caso de bacilos Gram negativos, reportar o número de microrganismos observados por campo de imersão; 
No caso de cocos Gram positivos, reportar apenas a presença dos microrganismos.
Procedimento laboratorial
Cultura
Assim que a urina chegar ao laboratório devemos fazer uma semeadura semi quantitativa, ou seja, é tentar ver a quantidade de bactéria por ml de urina. E esse procedimento pode ser feito através de diluição seriada ou através de uma alça calibrada de 1 microlitro e depositar no centro do meio de cultura, feito isso faremos as contagens das colônias.
Após a contagem das colônias, devemos multiplicara quantidade de colônias por 1000 e então teremos a quantidade de bactérias em 1 ml. Essa multiplicação por 1000 é somente se alça calibrada for de 1. Se a alça for de 10 nós multiplicamos por 100. 
1 ml é igual a 1.000 microlitros. Logo, 1 microlitro está para 10 bactérias e 1.000 microlitros está para quantas bactérias? 10.000 bactérias;
Quando semeio a placa, devo ter pelo menos 10 colônias;
Se for acima de 10 mil bactérias o paciente está com infecção urinária, então devemos identificar as bactérias e fazer TSA. 
Espalhar o material por toda a superfície do meio com o auxílio de uma alça de Drigalski; 
Meio de semeadura primária – CLED (mais utilizado) ou Brolacin;
Incubação – 37°C / até́ 48h (normalmente com 24h já dá para ver o crescimento)
Interpretação dos resultados
Acima de 10 mil tem infecção, então devemos fazer a identificação do microrganismo e TSA.
Abaixo de 10 mil não precisamos indicar nada, temos que colocar que a cultura foi negativa.
Cultura negativa quando não cresceu nenhuma bactéria.
obs.: esquecer esse de 10 a 20 mil que tem no quadro – não coloquei o quadro para não confundir
Identificação dos principais patógenos
O principal patógeno que está associado a infecção urinaria é a E. coli (pertence à família de enterobactérias).
Família Enterobacteriacea 
TSI (“Triple Sugar Iron”) – meio vermelho alaranjado; base glicose e ápice sacarose e lactose; perfura-se o meio e fazem-se estrias; incuba-se num período de 24h a 48h; verifica a produção de gás a partir da glicose, a fermentação de glicose, lactose e sacarose e a produção de H2S: 
Se a bactéria produzir H2S, ela combina com o ferro formando sulfato ferroso e o meio fica preto; 
Se a bactéria fermentar glicose, a base fica amarela; 
Se a bactéria fermentar sacarose e lactato, o ápice fica amarelo; 
Se a bactéria fermentar tudo, fica tudo amarelo; 
Se a bactéria produzir gás, ocorre rachaduras do meio ou se deslocar, veremos espaços dentro do tubo.
 
SIM – verifica a produção de indol (a presença da enzima tripofanase quebrando o triptofano com producão de gás indol - esse reage com o reagente paradimetil-amino-benaldeído dando uma coloração rosa, outro método de fazer isso é colocar uma tira impregnada com esse reagente preso na tampa do tubo. A tira é amarela é como indol é um gás depois que reagir com a tira, esta fica rosa.); a motilidade e a produção de H2S a partir da quebra do tiossulfato de sódio.
Citrato - verificar a utilização do citrato como única fonte de carbono pelo microrganismo (o meio muda de verde para azul devido à sua alcalinização devido à liberação de grupo amina pela utilização do citrato).
Degradação da uréia - verificar a presença da enzima urease, a qual degrada a uréia levando a uma alcalinização do meio de cultura (amarelo para rosa); O meio de cultura utilizado é o Rustigian & Stuart.
Oxidase – ver se a bactéria tem presença da enzima citocromo oxidase (enzima da cadeia respiratória), e então através do reagente de Kovac’s (é uma folha impregnada com esse reagente), se a bactéria tiver a enzima ela oxida o reagente e se não tiver a enzima não ocorre mudança de coloração.
Observação: a formação do composto oxidade + Kovac’s (azul de indofenol), que substitui o oxigênio como receptor final de elétrons; as enterobactérias são fermentadoras de glicose e oxidases negativas.
Staphylococcus saprothyticus (pode estar presente na microbiota normal ou levar a infecções urinárias).
Prova da catalase (+); 
Prova da coagulase (-); Lembrando que S. aureus é positivo; 
Fermentação de carboidratos (manose, trealose e manitol);
Descarboxilação da ornitina; 
Resistência a novobiocina (antibiótico) se a bactéria for sensível chegamos ao diagnóstico de S. epidermidis (forma um halo de inibição). E se a bactéria for resistente chegamos ao diagnóstico de S. saprophyticus (cresce junto com o antibiótico); 
Resistência à desferrioxamina; 
Produção de fosfatase alcalina; 
Produção de urease.
Streptococcus agalactiae 
Prova da catalase (-); Lembrando que positivo só Staphylococcus;
Padrão de hemólise (beta hemolítico – faz hemólise total); 
Teste CAMP (+); Utilizamos o meio ágar sangue e fazemos um risco com o microrganismo S. aureus. Com a bactéria fazemos estrias perpendiculares ao S. aureus. Se houver formação de setas (hemólise) na junção das duas bactérias. Se apareceu seta, positivo para S. agalactiae. 
Sorologia.
Enterococcus sp (NÃO CAI NA PROVA) 
Prova da catalase; 
Padrão de hemólise; 
PYR, LAP, Hidrólise da esculina; 
Resistência ao NaCL 6,5%; 
Descarboxilação de arginina; 
Produção de pigmento; 
Motilidade; 
Fermentação de carboidratos (arabinose, rafinose, sorbose, sorbitol e manitol).
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DAS INFECÇÕES DO TRATO INTESTINAL COPROCULTURA
Coprocultura é a cultura de fezes, e devem ser realizadas no caso de infeções gastrointestinais. Suspeita de infeção do trato intestinal, o que se caracteriza por Gastrenterites (Infecções intestinais que tem por consequências dores abdominais, náuseas, vômitos e diarréia, sendo a última principal). Algumas vezes pode acarretar numa disenteria (Infecção intestinal que se caracteriza pela presença de fezes muco sanguinolenta além do distúrbio hidro- eletrolítico).
Estádios de um processo infeccioso: primeiro passo é a bactéria fazer adesão (fundamental para que ocorra um dano tecidual). Além da adesão, algumas bactérias podem colonizar, se proliferar. Outras aderem e fazem invasão celular (o que vai gerar um dano). Mas nem sempre invadem, porém, colonizam e se multiplicam (o que também geram dano). Outras, além de aderir e colonizar liberam toxinas (leva ao dano tecidual). 
Desinteria é quando encontramos muco e sangue nas fezes. O que a bactéria está causando aqui? Está fazendo invasão celular. Ou seja, toda vez que a bactéria fizer invasão celular, o epitélio intestinal vai descamar, ocorrendo rompimento de vasos sanguíneos (tendo por consequência muco e sangue nas fezes – desinteria). 
Na diarreia, o que a bactéria está causando? Está colonizando, e pode estar destruindo as micro vilosidades (aumenta a superfície de contato para que tenha absorção).
Uma gastroenterite/ infecção intestinal é ocasionada apenas por bactérias? Não. Pode ser ocasionada também por toxinas. Um exemplo disso são as bactérias que não aderem e não colonizam, mas secretam toxinas, e estas fazem com que as vilosidades percam a capacidade de absorção e, portanto, ocorrerá à saída de líquido (distúrbio hidroeletrolítico) – diarreia. Ou seja, nem sempre a gastrenterite é causada por um microrganismo. Muita das vezes, a toxina liberada pelas bactérias induz ao processo infeccioso. 
No epitélio intestinal, na luz do intestino temos as vilosidades, as quais são vascularizadas. Se não houver perda desse epitélio, não haverá perda de sangue. Mas se houver perda desse epitélio, haverá exposição do vaso sanguíneo e perda de sangue. Na mucosa intestinal vemos as microvilosidades que servem para aumentar a área de contato, que consequentemente aumenta a absorção.
Bactérias que invadem levam a disenteria, isso porque terá perda da mucosa e perda do epitélio da região onde ela está aderida, além de expor os vasos sanguíneos, tendo então presença de muco e sangue nas fezes.
Flora Intestinal
Maior flora do corpo humano. É uma flora altamente vasta, que incialmente começa baixa, em torno de 5 a 10 bactérias, ou seja, 100 mil bactérias/ml, com predominância de anaeróbio (isso porque já passou pelo estômago), presença de bactérias ácidas tolerantes - 50% da massa seca de fezes são compostas apenas de bactérias – e no final teremos em média, 100 trilhões de bactérias anaeróbias por gramas de fezes e 100 milhões de bactérias aeróbias g/fezes. 
A flora intestinal é altamente importante, porque essas bactérias estão sempre estimulando o sistema imunológico e impedem o crescimento de outros microrganismos que são patogênicos. As fezescontêm cerca de 1.011 de bactérias por grama, dos mais diversos tipos:
Cocos e bacilos Gram-positivos;
Cocos, coco-bacilos e bacilos Gram-negatiovs;
Aeróbios e anaeróbios;
Vírus;
Fungos;
Parasitos;
Modalidades de infecção intestinal
Processo de adesão celular
Esse é o primeiro passo para a infecção, se a bactéria não aderir, não vai ocorrer infecção do local. E essa adesão pode ser ocasionada por vários fatores de virulência (ex.: adesinas (tipos: fímbrias, capsulas, ptn presentes no glicocálixe), e essa adesão leva a desorganização das vilosidades intestinais, perdendo assim a capacidade de absorção, levando então a alterações no fluxo de água e eletrólitos, portanto terá saída de muito líquido, causando diarreia. 
Após essa bactéria fazer a adesão, ela pode ou não invadir. Podendo ou não ser microrganismos invasivos, capazes de penetrar na mucosa e se multiplicarem. Em alguns casos essas bactérias podem ou não produzir toxinas. Exemplo: Escherichia coli enteropatogênica clássica (EPEC) – não produz toxinas. 
Processo invasivo 
Microrganismos invasivos, capazes de destruir a mucosa; 
Aderência às células epiteliais, penetração e multiplicação celular, dando origem à síndrome disentérica (consistência das fezes é pastosa);
Dependendo do grau de invasão dessas bactérias, elas podem cair na corrente sanguínea (ex.: salmonela – leva a febre tifoide).
Processo tóxico 
Bactérias produtoras de enterotoxinas;
Produzem toxinas fazendo com que o epitélio intestinal perca a capacidade de absorção de nutrientes;
A consistência das fezes é aquosa
Principais agentes de gastrenterites 
Três principais gêneros que podem produzir doença entérica primária (amplas epidemias de diarreia, casos esporádicos ou casos endêmicos):
Certas raças de Escherichia coli – algumas fazem parte da flora intestinal, mas outras podem fazer a invasão do epitélio intestinal;
Salmonella, que é o agente etiológico da febre tifóide e de outras salmoneloses (salmonella do tipo tiff fazem invasão);
Shigella, que é o agente da disenteria bacilar – é naturalmente enretoenvasora (sempre invasora).
Escherichia coli diarreicogênicas
 
 
Observações: 
Em adultos não ocorre com tanta frequência, pois já tem certa sensibilidade a elas;
E. coli enteroinvavoras e enterohemorragicas fazem invasão celular e destruição do epitélio;
E. coli enteroagregativa fazem adesão e começam a se dispor uma sobre as outras.
Escherichia coli
E. coli enteropatogênica clássica (EPEC) 
É normalmente causadora de surtos de diarreia não sanguinolentas que ocorrem frequentemente em crianças;
Muitos adultos possuem EPEC no trato intestinal, porém não expressam os sintomas da doença – imunidade;
O mecanismo de patogenicidade da EPEC não está completamente definido, mas acredita-se que a aderência à mucosa intestinal seja um importante fator para a colonização;
A bactéria destrói as microvilosidades sem invasão;
Destruição das vilosidades intestinais sem invasão (saída de muito liquido), com má absorção dos nutrientes e consequentes diarreias osmótica;
Têm como consequências também febre, náuseas e vómitos;
Resumindo: essas bactérias vão fazer a adesão, vão colonizar e essa adesão vai provocar a destruição dessas microvilosidades (a célula perde a capacidade de absorção, ocorre um distúrbio hidroeletrolítico e consequentemente perda de agua e eletrólitos), levando a casos de diarreia (sem presença de sangue e muco nas fezes). 
E. coli enterotoxigênica (ETEC) 
É a causa mais comum de diarreia em turistas, tendo o período de incubação variando de 8 a 44 horas;
A duração da doença é curta, aproximadamente 24 a 30 horas; 
O microrganismo deve conter o plasmídio codificante para a produção de pelo menos uma toxina; 
O hospedeiro deve ingerir um número suficiente de células bacterianas. Se ingerir pouca quantidade de bactérias, essas serão eliminadas pelo suco gástrico.
Quando infectam atuam principalmente sobre o intestino delgado;
Outros sintomas possíveis são dores violentas na zona do abdómen, vômitos, náuseas e febre baixa; 
Produz uma ou mais toxinas que vão agir no intestino delgado induzindo a liberação de fluido; 
Não ocorre invasão nem dano à camada epitelial do intestino delgado, o microrganismo apenas coloniza e liberta toxinas; 
A doença pode ser perigosa para crianças devido à desidratação.
E. coli enteroinvasora (EIEC) 
É muito semelhante à shigella, isso porque, vai fazer invasão e consequentemente ocorre a destruição do epitélio intestinal (perda do epitélio aparece nas fezes do paciente – presença de muco e muitas vezes de vasos sanguíneos);
Os sintomas são calafrio, febre, dores abdominais e disenteria; 
A dose infectante é alta, sendo necessários muitos microrganismos para que surja a doença; 
O período de incubação varia de 8 a 24 horas com média de 11 horas e a duração da doença é usualmente de vários dias;
O microrganismo invade células do epitélio intestinal, multiplica-se dentro destas células e invadem células epiteliais adjacentes provocando ulcerações do cólon, resultando finalmente em diarreia de sangue; essas bactérias dificilmente caem na corrente sanguínea;
Aproximadamente 11 sorotipos são responsáveis por infecções de EIEC e o principal deles é O:124.
E. coli enterohemorrágica (EHEC) 
Bactéria enteroenvasora;
Causa diarreia aquosa inicial que pode progredir em colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica (que ocorre em 5% das infecções por EHEC); 
Podem provocar anemia, trombocitopenia e insuficiência renal aguda potencialmente perigosa; 
Entre os grupos patogénicos de Escherichia coli, este é provavelmente o mais importante em termos de infecções alimentares, e o principal sorotipo envolvido é o O157:H7.
Salmonella spp. 
Principais agentes de gastrenterites – Espécies: 
S.entérica (leva a casos de gastrointerites) e S.bongori (antigamente sub-espécieV));
S. entérica - Seis sub-espécies (I, II, IIIa, IIIb, IV, e VI);
Sub-espécie I - Maioria dos sorotipos;
Sorotipagem - Reações sorológicas para os antígenos O (somático) e H (flagelar); 
Salmonella ser. Typhi - Características bioquímicas peculiares (principal a ser estudado)
Leva a febre tifoide, é invasora e pode se disseminar para os tecidos e cair na corrente sanguínea.
Salmonelas patogênicas - Capacidade de colonização às células M do intestino (são células inflamatória – fazem processo de defesa), e com isso o paciente pode ter sepse, febre tifóide, febre paratifóide, gastroenterites, colonização assintomática (cronicidade).
Observação: somente a salmonella do tipo typhi faz invasão.
Gastroenterites por salmonelas não-tifóides
A infecção humana é limitada ao intestino;
Essa bactéria não invade, ela apenas coloniza o epitélio intestinal;
No adulto é frequentemente chamada de intoxicação alimentar, onde terá uma diarréia aguda geralmente acompanhada de náuseas, dor de cabeça e, às vezes, febre e vômitos;
O período de incubação, em média, é de 48 horas;
Após o término da gastroenterite, a bactéria (salmonella) ainda é encontrada nas fezes durante quatro a cinco semanas.
Febre Tifóide
É causada principalmente pela S. Typhi e ocasionalmente por outros sorotipos;
Esse tipo de bactéria é enteroenvasora;
Ocorre mais comumente em crianças, apresentando geralmente uma febre prolongada (10-14 dias), dor de cabeça, desconforto abdominal e letargia generalizada;
Cerca de 10% dos casos desenvolvem uma doença severa e uma possível complicação consiste na perfuração do intestino delgado.
Shigella sp 
É um gênero de bactéria que é sempre invasora;
A pesar de ser enteroenvasora, ela dificilmente vai cair na corrente sanguínea;
São descritas 4 espécies de Shigella 
S. dysenteriae (Grupo A);
S. flexineri (Grupo B);
S. boydii (Grupo C);
S. sonnei (Grupo D).
Dentro das 4 espécies existem 43 sorotipos;
Doença clínica também conhecida como Disenteria bacilar, ou seja, vai fazer invasão, destruição do epitélio com perda deste e exposição dos vasos sanguíneos;
Microrganismode elevada capacidade invasiva;
Tem produção da toxina Shiga (toxina tipo I ou tipo A-B);
Observação: algumas e. coli também adquirem esse plasmídeo que vai conferir a produção de toxina (toxina shiga).
Dose infectante baixa (10 a 100 bactérias), levando a casos de disenteria;
O melhor método para ver se é essa bactéria é fazer o antibiograma;
Período de incubação varia de 12 a 24 horas;
Caracterizando-se por invasão e destruição da camada epitelial da mucosa, com intensa reação inflamatória;
Geralmente o paciente apresenta leucócitos, muco e sangue nas fezes;
Raramente a Shigella invade a circulação do paciente
Os 3 acimas são os principais. 
Yersinia enterocolitica 
Causa enterocolite;
Mais comum em regiões frias (Escandinávia, países europeus e nas áreas mais frias da América do Norte), mas uma vez que o indivíduo adquire essa bactéria, ela se adapta a temperatura de 35ºC – 37°C;
Diretamente associada à ingestão de carnes, frutos do mar e água contaminada; 
Período de incubação - 1 a 10 dias; 
Sintomatologia - 1 a 2 semanas.
Campylobacter Jejuni
Causa mais comum de gastrenterite bacteriana nos EUA; 
Fatores de virulência – ela vai conferir adesinas que vão provocar processo de adesão, então vai fazer a colonização e pode secretar toxinas (enzimas citotóxicas e enterotoxina); 
Os microrganismos são mortos quando expostos ao suco gástrico, de modo que condições que reduzem ou neutralizam a secreção gástrica ácida favorecem a doença.
Vibrio cholerae 
O principal fator dessa bactéria é a produção de toxinas, que podem ser do tipo A ou B;
Sub-unidade A – se liga a um receptor de membrana (possui sete domínios e é acoplado a proteína G) para que ocorra ativação da enzima adenilato ciclase, que quebra ATP em AMPc. Esse AMPc leva a ativação da PKA, fazendo com que o epitélio perca a sua capacidade de absorção, ocasionando uma hiper secreção de água e eletrólitos.
Sub-unidades B - Se ligam aos receptores GM1 nas células epiteliais intestinais.
Observação: as toxinas dessa bactéria não destroem as células, mas fazem com que percam a função. A toxina colérica acaba sendo uma exotoxina, ou seja, um produto do seu metabolismo que acaba sendo secretado.
Infecção clínica - Popularmente conhecida como água de arroz.
Outros agentes importantes 
Clostridium difficille;
Colite pseudo-membranosa;
Bacillus cereus;
Clostridium botulinum;
Staphylococcus aureus;
Etiologia viral.
Procedimento Laboratorial 
Coleta do espécime clínico 
As amostras de fezes devem ser colhidas no início da doença diarréica e antes de qualquer tratamento; 
1 a 2g de fezes (equivalente a 1 colher de sobremesa) representa uma amostra ideal;
No laboratório, as amostras devem ser semeadas o mais rápido possível. Amostras que não puderem ser semeadas logo após a colheita devem ser colocadas em solução para transporte;
Quando presentes, devemos selecionar constituintes patológicos como muco, pus ou pedaços de epitélio, isso porque nessas regiões teremos uma quantidade maior de bactérias. Principalmente se forem bactérias enteroenvasores (são liberadas juntas com a região que apresenta esses constituintes);
Meios de transporte - Glicerina tamponada, Cary-Blair e Água peptonada alcalina (APA);
Vibrio cholerae - “Swab” retal.
Amostras não-aceitáveis
Amostras sem conservantes que foram obtidas há mais de 3 horas;
Mistura de várias amostras colhidas no mesmo dia;
Fezes líquidas colhidas ou enviadas em fraldas;
Amostras de fezes contaminadas com urina;
Amostras coletadas há mais de três dias.
Meios de semeadura primária
Devemos fazer a semeadura das fezes em um meio seletivo, pois se semearmos no ágar nutriente teremos crescimento de todas as bactérias, e com isso não saberíamos quais são as bactérias potencialmente patogênicas. Dentre essas bactérias que levam a processo de gastroenterite quase todas são gram (-). 
Mac-Conkey ou BEM - Seletivo para bacilos Gram negativos e indicador da fermentação de lactose. 
Bactérias que não fermentam lactose o meio continua com a coloração ROSADA; bactérias que fermentam o produto do seu metabolismo, mudam o pH do meio fazendo com que o meio fique AMARELO.
Meio SS - Seletivo para Salmonella e Shigella;
Meio VB (verde-brilhante) - Isolamento de Salmonella;
Caldo de enriquecimento - Caldo Selenito e Tetrationato de sódio;
Meio de Skirrow - Isolamento de Campylobacter;
Meio TCBS (Ágar Tiossulfato citrato sais biliares e sacarose) - Isolamento de Vibrio;
Hektoen-Enteric (HE) - Isolamento de Salmonella e Shigella.
Observação: normalmente faz-se a semeadura no meio Mac-Conkey e no meio SS, pois são os mais comuns. 
Coloração pelo método de Gram
Não tem valor diagnóstico, isso porque termos uma grande quantidade de microrganismos nas fezes. 
Etapas iniciais de enriquecimento
Uma etapa de crioenriquecimento (pegar a amostra de fezes, semear e colocar na geladeira, a bactéria vai crescer) é indicada nos casos de suspeita de Yersinia enterocolitica (bactéria encontrada em regiões frias – é uma bactéria psicrófila).
Fazer a semeadura da amostra fecal em um meio seletivo (Mac-Conkey, SS,...);
Após a incubação, veremos se houve crescimento de colônias individualizadas;
Fazer a identificação do microrganismo e fazer o antibiograma.
Identificação dos principais patógenos
Família Enterobactérias – são bactérias fermentadoras de glicose e são oxidase negativa. As principais são: salmonella, shiguela, e. coli.
Esse quadro vai cair na prova da seguinte maneira – vai ter um texto falando sobre os testes bioquímicos e as reações ocorridas e fazer a identificação da bactéria.
Protocolos especiais 
B.1) Yersinia enterocolitica – Presente em regiões frias; 	
Fazer crioenriquecimento (podemos colocar as fezes já semeadas na geladeira ou colocar sem semear, para depois fazer a semeadura) - pode ser de 1-3 semanas;
Ver se ocorreu ou não o crescimento bacteriano. Ocorrendo crescimento devemos fazer os testes bioquímicos; 
Fazer a identificação da bactéria. Como existem vários sorotipos, podemos fazer a sorotipagem (realizada através de teste rápido) após a identificação da bactéria.
B.2) Campylobacter 
O meio mais indicado é o meio de Skirrow;
Cresce em uma baixa concentração de oxigênio, quase uma atmosfera de CO2 a 10%.
B.3) Vibrio cholerae 
Observação: as bactérias mais importantes para a prova são Salmonella, e. coli e shigella. Mas podem cair essas outras bactérias na forma e texto apresentando os testes bioquímicos para fazer a identificação da bactéria.