CQ Microbiológico

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CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
 
Prof.MSc Vicente Senna Jr
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Conteúdo
Contaminação e comportamento
O mundo dos minúsculos seres
Boas práticas de Laboratório Micro
Análise de não estéreis ( produtos e matérias-primas)
Análise de Monitoramento Ambiental
Análise de estéreis / endotoxina bacteriana
Estudo de caso
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Contaminação e Comportamento
Você sabia que ao mesmo tempo em que você pode causar uma contaminação microbiológica, você pode prevení-la?
Sabe onde está a diferença? Nas suas atitudes e nas suas ações. 
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Minúsculos seres - Vírus
São microorganismos com capacidade de permanecer inativos durante muito tempo e se reativar ao contaminar uma pessoa. 
Ao entrar no corpo o vírus invade as células e se divide formando centenas de novos vírus.
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Minúsculos seres - Bactérias
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Salmonella
Gastroenterite: salmonelose mais frequente, a sua sintomatologia surge 6 a 48h após ingestão de alimentos ou água contaminados; os sintomas mais comuns são: diarréia não sanguinolenta, náuseas, dores abdominais tipo cólica e cefaleias. 
Febre entérica: vulgarmente conhecida por febre tifóide (diferente do tifo), infecção sistémica febril caracterizada por febre gradual constante 10 a 14 dias após a infecção.
Septicemia: Todas as espécies de Salmonella podem causar bacteremia- Infecção generalizada.
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Pseudomonas
	Patogênico de indivíduos com sistema imunológico comprometido, a P. aeruginosa normalmente infecta o aparelho respiratório, aparelho urinário, queimaduras, e também causa outras infecções sanguíneas. 
	Em raras circunstâncias pode causar pneumonia por contágio entre humanos.É a causa mais comum de infecções no ouvido e por queimaduras, e é o mais frequente colonizador de equipamentos médicos. Se a infecção ocorrer em áreas vitais ela pode ser fatal.
Estafilococos
Foliculite: é uma infecção com pus de um folículo piloso. Pode progredir para furúnculo com nódulo grande e vermelho e depois para carbúnculo e estender-se para o tecido cutâneo. 
Em feridas pode causar infecções se houver material estranho onde esteja em reserva alimentando-se do sangue da hemorragia. 
Endocardite: infecção no coração após circulação pelo sangue (bacteremia). Mortalidade de 50%. Febre, dores no tórax. 
Osteomielite: infecção da matriz interna óssea.
 
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Minúsculos seres Fungos e Leveduras
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Prevenção
Contaminantes principais de uma área limpa: Operador, Superfícies (piso, paredes, maquinários) e o Ar
 Vestimentas adequadas:
PROTEGEM O AMBIENTE DAS PARTÍCULAS GERADAS PELO OPERADOR
PROTEGEM O PROCESSO DAS PARTÍCULAS GERADAS PELO OPERADOR
PROTEGEM O OPERADOR DAS PARTÍCULAS GERADAS PELO AMBIENTE E PROCESSO
 Higienização dos operadores
Lavagem das mãos:
Microbiota normal = 10.000 a 100.000 bactérias / cm2
Microbiota após lavagem = 100 a 1000 bactérias / cm2
 Higienização dos equipamentos e do ambiente
Sanitização das áreas ( piso/paredes), assepsia de bancadas e utensilios que fiquem dentro de uma área limpa/produtiva.
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Gráf1
		500		191		7		0
		500		98		3		0
		500		154		2		1
		500		101		6		0
		500		119		2		0
mãos
mãos com assepsia
luvas
luvas com assepsia
Plan1
		
		
		
		
		
		
		
		
		Operador		mãos		mãos com assepsia		luvas		luvas com assepsia
		
		A		500		191		7		0
		B		500		98		3		0
		C		500		154		2		1
		D		500		101		6		0
		E		500		119		2		0
Plan1
		
mãos
mãos com assepsia
luvas
luvas com assepsia
Plan2
		
Plan3
		
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Boas Práticas
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Lavando as mãos coretamente
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A higienização se divide em 2 etapas:
Limpeza
Remoção de resíduos, sujidades, detritos e outras substâncias através da utilização de água e detergentes.
Desinfecção
Redução ou eliminação de microrganismos ( exceto os esporulados) por método físico e/ou agentes químicos (sanitizantes).
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Boas Práticas de Microbiologia
Técnicas assépticas
Uso de luvas estéreis e uniformes apropriados
Fluxo laminar e/ou bico de bunsen
Materiais estéreis ou descartáveis
Uso de Alcool 70%
Desinfecção do ambiente de trabalho antes e após o uso.
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Instrumentos
Calibrações
Qualificações e validações
Manutenções preventivas
Plano de calibrações / qualificações
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Treinamento de Pessoal
As atividades realizadas devem estar descritas em procedimentos e todos os colaboradores devem estar treinados eos treinamentos registrados.
Aptidão para técnicas assépticas, concentração e paciência são habilidades requeridas
O treinamento e a capacitação “on the job” são importantes para garantir a confiabilidade dos resultados.
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Rastreabilidade e Registros
Os boletins de análise devem conter:
Material analisado
Data
Analista responsável
Material utilizado
Resultado
Duplo check / revisão
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Meios de Cultura
Meios Líquidos
Meios Sólidos
Utilizados para verificação qualitativa de crescimento microbiológico.
Possuem Agar. Utilizados para verificação quantitativa de crescimento microbiológico.
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Controle e Registros de preparo de meios de cultura
Meios devem ser liberados por lote de preparo quanto a esterilidade e Fertilidade
Capítulo 1117 da USP 35:
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Meios de cultura – controle
Marcas confiáveis: Merck, Difco, Oxoid ou marca validada
Utilizar água purificada para seu preparo
Volume de água e peso do meio devem ser registrados
O meio deve ser identificado com nome, data de preparo e validade.
A vidraria deve estar bem limpa e livre de resíduos
A medição de pH é importante
Os meios devem ser liberados frente ao resultado de esterilidade e fertilidade.
A estabilidade dos meios de cultura deve ser validada.
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Cultivo de cepas padrões
Fatores importantes para o cultivo: nutrientes, temperatura, pH, umidade
O fornecedor deve ser confiável e enviar o certificado de controle de qualidade da cepa incluindo a origem ( ATCC) e a passagem
O máximo de 5 passagens ( repiques) são aceitas
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Preparação do inóculo
Utilizar solução tampão de cloreto de sódio peptona pH 7.0 ou tampão fosfato de sódio pH 7.2
Para suspensão de esporos de A.brasiliensis adicionar 0,05% de polissorbato 80 ( tween).
Utilizar dentro de 2 horas ou em até 24 horas se armazenado entre 2ºC -8ºC
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Preparação e uso dos microrganismos teste
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Padronização do inóculo
Solução tampão
 10 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
 1:10
1:100
1:1.000
1:10.000
1:100.000
1:1.000.000
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Fertilidade em meios de cultura
Pipetar 1 mL da diluição que contemple até 100 UFC/mL
Para líquidos verificar a turvação
Para sólidos verificar a recuperação (> 70%) e a morfologia característica
OBS.: Para meios seletivos realizar o controle negativo com as cepas não indicativas de crescimento no meio específico.
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Análise de Não estéreis
Contagem de Microrganismos aeróbicos
Preparo da Amostra
Utilizar solução tampão de cloreto de sódio peptona pH 7.0 ou tampão
fosfato de sódio pH 7.2 ou Caldo Caseina Soja.
Diluição / preparo da amostra precisa ser validado
No mínimo 10 g ou 10 mL da amostra são requeridos para preparo inicial
Cap. 61 USP
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Agentes neutralizantes podem ser usados para neutralizar agentes antimicrobianos. Indicações USP:
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1- Filtração por membrana
Utilizar membrana de 0,45µm
Para contagem de bactérias ( TAMC) inocular em Agar Soja
Para contagem de fungos e leveduras ( TYMC) inocular em Agar Sabouraud
2 – Pour Plate ou Método em Profundidade
 Utilizar placas de 9 cm de diâmetro
Adicionar 1 mL em duplicata
Para contagem de bactérias (TAMC) adicionar 15 a 20 mL de Agar Soja
Para contagem de fungos e leveduras ( TYMC) adicionar 15 a 20 mL de Agar Sabouraud
Homogenizar em forma de 8.
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Incubação
e Leitura dos Resultados
 30ºC a 35ºC – bactérias de 3 a 5 dias
20ºC a 25ºC – fungos e leveduras de 5 a 7 dias
Resultados em UFC / g ou mL = média aritmética das contagens das placas x fator de diluição do preparo da amostra
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Análise de Não estéreis
Pesquisa de Patógenos – E.coli
Pode ser utilizado o mesmo preparo da amostra para contagem total diluição 1:10 ( não menos que 1 grama da amostra)
10 g ou 10 mL da amostra diluída em 90 mL de TSB
30º a 35º 18 a 24 hrs
1mL do TSB em 90 mL de Caldo MacConkey
42º a 44º 18 a 24 hrs
Repicar em Agar MacConkey 
30º a 35º 18 a 72 hrs
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Análise de Não estéreis
Pesquisa de Patógenos – Salmonella
Pode ser utilizado o mesmo preparo da amostra para contagem total – 
10 g ou 10 mL da amostra original em 90 mL de TSB
30º a 35º 18 a 24 hrs
0,1mL do TSB em 10 mL de Caldo Rappaport
30º a 35º 18 a 24 hrs
Repicar em Agar XLD 
30º a 35º 18 a 48 hrs
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Análise de Não estéreis
Pesquisa de Patógenos – Pseudomonas aeruginosa
Pode ser utilizado o mesmo preparo da amostra para contagem total diluição 1:10 ( não menos que 1 grama da amostra).
10 g ou 10 mL da amostra diluída em 90 mL de TSB
30º a 35º 18 a 24 hrs
Repicar em Agar Cetrimide 
30º a 35º 18 a 72 hrs
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Análise de Não estéreis
Pesquisa de Patógenos – S.aureus
Pode ser utilizado o mesmo preparo da amostra para contagem total diluição 1:10 ( não menos que 1 grama da amostra)
10 g ou 10 mL da amostra diluída em 90 mL de TSB
30º a 35º 18 a 24 hrs
Repicar em Agar Manitol Salgado 
30º a 35º 18 a 72 hrs
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USP 1111 - Especificações
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Análise de Água
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USP 1231
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Monitoramento ambiental
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Pessoas e vestimentas
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Microrganismos comumente encontrados em áreas limpas
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Referências limites microbiológicos
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Procedimento que defina pontos, frequência e especificação + Estipulação de limite de alerta + avaliação anual de dados = TREND ANALYSIS
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Teste de esterilidade
Conceito
	
	O teste de esterilidade visa verificar com mais segurança e qualidade o processo esterilizante, empregado durante a fabricação de medicamentos estéreis
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Fonte: www.millipore.com
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Condições de Trabalho
		Controle e cuidados do ambiente de trabalho
		Parâmetros: temperatura e pressão
		Limpeza da sala limpa e dependências do laboratório
		Monitoramento Ambiental: viáveis e não viáveis	 
		Vidraria e materiais auxiliares
		Pessoal: treinamento
		Equipamentos: calibração, qualificação, manutenção
FALSO POSITIVO
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 Métodos de Inoculação
	 
		Direta
	 
 		
	 Indireta
Oficial 1932 – largo histórico
Simples e fácil
Recursos intermediários para amostras
Introdução em 1957
Sistema aberto ou fechado
Membrana 0,22 µm e 0,45 µm
Treinamento Técnico
Limitação no uso natureza da amostra
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1936
Inoculação
direta
1938
1940
1942
1944
1946
1948
1950
1960
1970
1980
Inoculação
indireta
Inoculação
Indireta em 
sistema fechado
Caldo peptonado 
+ gelatina 
+ solução de Litmus
Meio Tioglicolato
Caldo peptonado + mel
Caldo Sabouraud
5 dias
07 dias
14 dias
10 dias
A partir de 2000, 14 dias
14 dias
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Interpretação dos Resultados
	 1932 BP - Observação de meio de cultura com turvação, característica de contaminação
 1961 USP – Contaminação cumulativa (até 10% tubos) teste e reteste erro técnico
	
	 1977 FDA – 1 tubo contaminado reteste 
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Liberação Paramétrica 
	A liberação paramétrica é definida como a liberação de cargas ou lotes de produtos submetidos à esterilização terminal através do cumprimento de parâmetros críticos do processo de esterilização, sem a necessidade de realização do teste de esterilidade.
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Interesses econômicos
Interesses políticos
Tradição
				 
		 
Há contrapontos???
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Validação ampla e criteriosa
Qualificação das áreas e equipamentos
Pessoal qualificado
Contaminação do produto antes da esterilização, além do todo o processo
Uma vez concedida a liberação paramétrica,não poderá lançar mão do teste de
	esterilidade para reteste.		 
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Teste de endotoxina
Detecção de endotoxinas bacterianas de bactérias gram negativas utilizando um lisado do amebócito (Limulus)
Gel clot
Turbidimétrica
Colorimétrica
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 Gel clot
Material despirogenizado no mínimo por 30 minutos a 250ºC
Descartáveis apirógenos
MVD (máxima diluição do produto) = LE / λ
λ = sensibilidade do lisado utilizada
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USP < 85>
Resultado esperado: 
B e C – positivos
D – negativo
A – negativo ( satisfatório); positivo ( não atende aos padrões)
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Curiosidades
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Crescimento de colônias de bactérias após toque de mão com luva suja.
Mesmo uma luva não estéril ou suja oferece contaminação aos nossos processos.
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EUROPEAN Pharmacopeia 7, 2010.
Farmacopéia Brasileira 5 ed., 2010.
UNITED States Pharmacopeia 35, 2011.
PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 3. ed., São Paulo: Atheneu , 2010.
ISO 14644 – 2000
WHO Thecnical report series - 2002
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