apostila Micro geral

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�Kelly Cristina da Silva Brabes
	
	
UFGD/Universidade Federal da Grande Dourados
FAEN/Faculdade de Engenharia
Engenharia de Alimentos
Profª Dra. Kelly Brabes
kellybrabes@ufgd.edu.br
MICROBIOLOGIA GERAL
NOTAS DE AULAS PRÁTICAS
Profª Dra. Kelly Cristina da Silva Brabes
	
Nome:........................................................
Curso:.......................................................
	Foto
DOURADOS/MS
2007
Índice
41. Introdução às técnicas de microbiologia	�
41.1. Uso do Laboratório	�
81.2 Responder as seguintes perguntas:	�
92. Reconhecimento de vidrarias e equipamentos utilizados no laboratório de Microbiologia.	�
92.1 Vidrarias e utensílios	�
112.2. Identificação de equipamentos	�
133. Identificação de Placas de Petri e de Tubos de ensaio	�
143.1 Exercício: Definir seu grupo definitivo de aula e simular em uma placa de Petri e tubo de ensaio sua notificação do grupo. Demonstrar no espaço abaixo.	�
144. Presença de microrganismos no ar de ambientes	�
154.1. Objetivo	�
154.2. Procedimento	�
164.3. Resultados	�
175. Desinfecção e Esterilização	�
175.1. ESTERILIZAÇÃO	�
185.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)	�
185.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido	�
205.1.3. DESINFECÇÃO QUÍMICA	�
215.2. Objetivo	�
215.3. Procedimento	�
236. MICROSCOPIA - Reconhecimento	�
236.1. Procedimento:	�
246.2. TÉCNICA DE UTILIZAÇÃO E CUIDADOS	�
257. Microscopia a Fresco	�
257.1. Objetivo	�
257.2. Procedimento	�
267.3. Responda:	�
278. Colorações - Microscopia de Gram	�
278.1. Procedimento:	�
278.1.1. Esfregaço da cultura bacteriana líquida	�
278.1.2. Esfregaço de cultura bacteriana sólida	�
288.1.3. Adição de Corantes	�
298.2. Avaliação dos resultados e fixação de conhecimento	�
309. Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura	�
309.1. Meios de Cultivo	�
309.1.1. Classificação dos meios de cultivo:	�
329.2. Técnica de Semeadura	�
329.3. Procedimento em Meio Líquido	�
339.4. Procedimento em Meio semi-sólido	�
339.5. Procedimento em Meio sólido (ágar inclinado)	�
349.6. Procedimento em Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)	�
349.7. Responda:	�
3510. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)	�
3610.1. Procedimento	�
3710.2. Análise dos Resultados	�
3810.3. Responda:	�
3911. Contagem de Microrganismos na Escova Dental	�
3911.1. Objetivo	�
3911.2. Procedimento	�
4011.3. Análise dos Resultados	�
4011.3.1. Análise quantitativa:	�
4111.3.2. Análise dos microrganismos através do método de Gram.	�
4211.4. Responda:	�
4312. Análise de Coliformes Fecais e Staphylococcus aureus em amostras de queijo tipo frescal e mussarela fatiada	�
44Amostras positivas transferir para agar EMB através de alça de platina por estria e incubar a 45°C por 24 horas	�
�
APRESENTAÇÃO
	Este material foi preparado para preencher os requisitos da disciplina de Microbiologia Geral em seu conteúdo prático, preparando gradualmente o estudante aos diferentes aspectos da rotina de um laboratório de microbiologia, iniciando pelas técnicas básicas, regras de trabalho, procedimentos de desinfecção e esterilização, preparo de meios de cultura, dentre outros, fundamentais para o desenvolvimento de trabalhos práticos.
	A seguir, são apresentados os experimentos envolvendo aspectos aplicados a microbiologia, como microbiologia do solo, da água, do ar, dos alimentos e industrial.
	Este material foi planejado para ser uma obra versátil e de fácil utilização pelos estudantes, na qual cada aula apresenta uma base teórica, material necessário para realização da pratica e os procedimentos experimentais. Finalizando cada aula, há um espaço para anotação dos resultados, observações e conclusões sobre a abordagem de cada assunto.
1. Introdução às técnicas de microbiologia
O curso prático de microbiologia tem como principal objetivo o aprendizado de técnicas, representadas por uma série de operações executadas segundo normas padronizadas, possibilitando o conhecimento e a manipulação de microrganismos. As técnicas microbiológicas básicas e essenciais podem ser resumidas em:
Observações microscópicas: observações de microrganismos em condições adequadas à visualização em microscópio;
Cultivo artificial: multiplicação de microrganismos fora do seu habitat natural, utilizando meios de cultura;
Esterilização: eliminação das formas vivas nos meios de cultura, utensílios e instrumentos;
Prática asséptica: prevenção do contato com o material em estudo, com formas microbianas indesejáveis.
1.1. Uso do Laboratório
	Laboratórios de Microbiologia são locais onde se manipulam os microrganismos com os mais variados objetivos, tais como:
Identificar os microrganismos responsáveis por doenças em animais e vegetais;
Avaliar a microbiota do ar, do solo, da água, dos alimentos, etc;
Identificar a presença de microrganismos indesejáveis nos alimentos ou produtos industrializados;
Usar microrganismos como modelo de estudo para a compreensão dos processos vitais;
Obter substâncias tóxicas ou benéficas produzidas pelos microrganismos;
Descobrir substâncias (remédios, vacinas, antibióticos, vitaminas, hormônios, etc.) que combatam microrganismos patogênicos ou favoreçam o crescimento de plantas e animais.
Como nos laboratórios de microbiologia trabalha-se com organismos que na sua grande maioria não são visíveis a olho nu, deve-se tomar o máximo de cuidado para que não ocorra contaminação indesejável com as seguintes situações:
O manipulante;
O ambiente
O material em estudo
O sucesso de uma análise de laboratório de microbiologia depende de algumas regras pré-estabelecidas para a segurança pessoal e ambiental, evitando acidentes e no que se refere à manutenção de um laboratório rigorosamente limpo para impedir a contaminação experimental por microrganismos estranhos ao estudo.
Para isso é necessário que algumas medidas sejam tomadas e que regras de trabalho sejam estabelecidas:
O laboratório é dotado de um escaninho para a guarda de material como bolsas, pastas e mochilas. Logo ao entrar no laboratório, o aluno deverá guardar seus pertences num local desocupado, levando para a bancada de trabalho apenas o material referente à aula, como apostila, caderno e materiais para apontamento. É obrigatório desligar aparelhos telefônicos celulares. 
O uso do jaleco branco de manga comprida e limpa, roupa branca e sapato branco fechado é obrigatório. O aluno deve vesti-lo logo ao chegar ao seu local de trabalho. Após, o aluno deve lavar as mãos com sabão bactericida disponível no laboratório. Ao final da aula é obrigatória a lavagem das mãos, por motivos de segurança.
Após colocar o jaleco, é necessário colocar também toucas e máscaras descartáveis por motivo de segurança (uso de fogo, chama de bico de bunsen).
OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).
Figura 1. Esquema de um bico de bunsen�
Sobre a bancada de trabalho haverá um pulverizador com álcool etílico (70º) e papel descartável. A área de trabalho deverá ser pulverizada com álcool e limpa com o papelfornecido, sempre ao início e também ao final de cada sessão de trabalho. Ou seja, SEMPRE, no trabalho em biologia e microbiologia, a PRIMEIRA e a ÚLTIMA coisa a ser feita são a descontaminação da área de trabalho.
O aluno encontrará um conjunto de objetos de uso comum para as disciplinas de Microbiologia. Esses objetos serão usados em diversas ocasiões durante o ano, conforme a necessidade. É dever do aluno verificar a integridade do material recebido e comunicar ao Professor e ao Laboratorista qualquer irregularidade encontrada. 
Nas bancadas o aluno encontrará um microscópio binocular para uso em grupo, e nas outra bancada os conjuntos de corantes para a execução da técnica de coloração de Gram e outras, que deverá ser compartilhado com os colegas. Também encontrará um recipiente de vidro destinado à coloração de lâminas. E outro para descarte de material usado em aula (contaminado). Qualquer irregularidade deverá ser sempre comunicada ao Professor e ao Laboratorista.
Cada aluno deverá possuir uma caneta capaz de escrever em vidro (caneta de retroprojetor ou específica para vidraria de laboratório, uma caixa de lápis de cor ou giz-de-cera). 
Manter as portas e janelas fechadas durante toda a aula para evitar contaminação por corrente de ar.
Nunca colocar instrumentos contaminados, tais como alças de platina, pinças, pipetas sobre as bancadas sem antes promover a descontaminação ou coloca-las em recipiente apropriado.
Após o término da aula, colocar todo o material utilizado na aula em um local indicado pelo professor ou laboratorista.
Ao manipular estruturas fúngicas fazer de maneira de ordenada e rápida para evitar contaminação de esporos no ar.
Como segurança pessoal seguir as seguintes regras:
não comer, beber e fumar;
não aplicar maquiagem, cosméticos ou lentes de contato;
não colocar as mãos nos olhos, boca e ouvidos durante a aula;
quando necessário trabalhar na zona de segurança que compreende a área mais próxima possível do bico de bunsen;
transportar e manter tubos de ensaio em estantes para evitar acidentes;
em caso de quebra ou derramamento de culturas contaminadas, cobrir toda área com toalha de papel descartável e derramar sobre ela um desinfetante. Após 15 minutos remover as toalhas e descarta-las de forma indicada pelo professor e/ou pelo laboratorista;
relatar imediatamente ao professor e /ou ao laboratorista qualquer acidente, ferimento, cortes ocorridos durante a aula;
não pipetar com a boca culturas contaminadas;
falar calma e claramente, manter a atenção constante durante a realização das análises, evitar movimentação e conversas desnecessárias que possam causar distração e provocar acidentes.
1.2 Responder as seguintes perguntas:
O que é assepsia?
O que é anti-sepsia?
O que é desinfecção?
Qual o agente desinfetante utilizado no laboratório de Microbiologia? Descreva sobre seu princípio de ação.
2. Reconhecimento de vidrarias e equipamentos utilizados no laboratório de Microbiologia.
Alguns equipamentos e vidrarias são utilizados rotineiramente em um laboratório de microbiologia.
Identificar juntamente com o professor estes materiais e se necessário fazer um desenho e anotar as funções dos mesmos.
2.1 Vidrarias e utensílios
Placa de petri
Tubo de ensaio com e sem rosca
Alça de platina
Alça de Drigralski
Béquer
Erlenmeyer
Proveta
Tubo de Durhan
Swab
Boneca ou tampão de algodão
Pipeta graduada
Pipeta volumétrica
Pipeta de Pasteur
Lâmina
Lamínula
Bastão de vidro
Dispensador de pipeta
Pinça
Pregador ou prendedor
Estante ou grade de tubos
Caneta de identificação de materiais
Tubo tipo eppendorff
Piseta com água destilada
Pulverizador com solução desinfetante
Tripé
Tela de amianto
Frasco âmbar e conta gotas
Meios de cultura
2.2. Identificação de equipamentos
Autoclave
Estufa de esterilização
Capela de fluxo laminar
Bico de bunsen
Geladeira
Freezer
Microondas
Banho-maria
Vótex
Balança semi-analítica
3. Identificação de Placas de Petri e de Tubos de ensaio
Durante as aulas práticas todo o material deverá ser identificado utilizando caneta de retroprojetor.
A disciplina utiliza um sistema de identificação da vidraria utilizada pelos grupos durante as práticas, que consta de um código composto por duas letras e três conjuntos de números, como demonstrado a seguir.
As letras a serem escritas são “BM” – iniciais de Biologia e Microbiologia, e que diferenciará o material de seus alunos do material de alunos de outras disciplinas, que compartilhem as estufas.
É necessário colocar a data de realização da prática (10/02/05), a turma prática (P1 ou T1), e finalmente, indicar do grupo de trabalho, que será definido pelo professor.
Indicar a amostra analisada e o meio de cultura utilizado.
Se necessário indicar o Profª responsável.
Por exemplo:
O código de identificação deverá ser escrito na TAMPA ou na borda externa da TAMPA da placa de Petri. O fundo da placa deverá ser reservado para indicar divisões de setores ou para se fazer à contagem do número de colônias.
Em tubos de ensaio o procedimento será o mesmo.
Ambos estão indicados abaixo:
Figura 1. Esquema de anotação em vidrarias utilizado em material de aula prática de microbiologia.
	
	
3.1 Exercício: Definir seu grupo definitivo de aula e simular em uma placa de Petri e tubo de ensaio sua notificação do grupo. Demonstrar no espaço abaixo. 
4. Presença de microrganismos no ar de ambientes
Os microrganismos são encontrados nos mais diversos ambientes, podendo estar em suspensão ou depositados com as partículas de poeiras em várias superfícies, entre elas a pele de as mucosas do homem e animais. O meio aquático foi historicamente o ambiente primeiramente estudado. 
Nas partículas de poeira, os microrganismos estão presentes em grandes quantidades e, portanto são passíveis de entrar em nosso organismo através de diversos mecanismos. Os microrganismos presentes no ar depositam-se na superfície do nosso corpo, cabelos, pele e mucosas, bem como nos alimentos e bebidas. Vivemos, portanto, em completa interação com os microrganismos e precisamos aprender a conviver com eles. Felizmente a maioria dos microrganismos é benéfica ou inócua e uma baixa proporção de microrganismos causa prejuízos ao homem.
As atividades do laboratório de microbiologia consiste em isolar, conservar e manipular culturas de microrganismos. A prática asséptica é de fundamental importância para prevenir que microrganismos contaminantes venham crescer nos meios de cultivo. 
Através de técnicas simples é possível demonstrar a presença de microrganismos em diversos locais do ambiente onde nos encontramos.
4.1. Objetivo
	O objetivo desta prática é demonstrar a presença de microrganismos no ambiente de trabalho e outros com alta contaminação.
4.2. Procedimento
Identificar o material conforme já mencionado.
Expor uma placa de petri contendo o meio de cultivo ágar nutriente em cada uma das seguintes situações:
Manter a placa aberta durante 15 minutos nos locais determinados pelo professor;
Tocar os dedos;
Colocar fios de cabelo;
Tossir ou falar sobre o meio de cultura;
Manter a placa sem exposição para ter como testemunha.
Incubar as placas invertidas a temperatura de 32ºC/7 dias em estufa.
Na próxima aula avaliar a presença de colônias, número de colônias e diversidade.
4.3. Resultados
ANOTAR OS RESULTADOS NOS ESPAÇÕS ABAIXO.
	
	
	
	
5. Desinfecção e Esterilização
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodosfísicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local.
ANTI-SEPSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intrabucal.
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização através de detergentes ou sabões.
5.1. ESTERILIZAÇÃO
A esterilização é o processo que inativa todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente. A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infecções em seres humanos desenvolve-se em temperaturas próximas a do corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e não é destruído.
Alguns microrganismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infecção. Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, fúngicas como os esporos.
Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas definitivamente os métodos de esterilização mais empregados em microbiologia são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor.
5.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)
Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos microrganismos.
A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.
Para ser eficiente, este processo depende de:
- Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material.
- Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.
- A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas.
- O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.
5.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido
O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição.
Vapor d’água
O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco.
A autoclavagem é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido.
Funcionamento da autoclave:
- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar;
- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;
- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na qual a temperatura do vapor é de 121ºC.
- A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores: os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados; o tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida.
- A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.
- Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.
Controle da Esterilização
É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente.
O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo.
Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrário voltam a se recontaminar com microrganismos presentes no ambiente.
5.1.3. DESINFECÇÃO QUÍMICA
Este processo é realizado de forma química com o uso de soluções desinfetantes ou sanitizantes. Os agentes desinfetantes mais utilizados em microbiologia são:
Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.
Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.
Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.
Compostos Clorados: Causa a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucléicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.
Álcoois (Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílico.
Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual há 10 minutos.
Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies).
Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex.Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e, portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras.
5.2. Objetivo
O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a ação de anti-sépticos sobre a microbiota das mãos.
5.3. Procedimento
Devem ser seguidas as seguintes etapas:
1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar nutriente, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa (Fundo).
2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos:
Controle (C),
Mão Suja (MS),
Detergente (Det),
Álcool 70% (A) 
Devem ser preparadas 1 placa por grupo seguindo o esquema abaixo.
3- No quadrante identificado como “Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no ágar por 1 minuto.
4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “Detergente” por 1 minuto.
5- O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool secá-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto.
6- A placa deve ser levada para incubação, invertida a 32ºC/48horas.
7- A Leitura deverá ser realizada na próxima aula.
OBS: Nada deve encostar-se ao quadrante identificado como “Controle”.
	
	Crescimento Bacteriano
	
	-
	+
	++
	+++
	++++
	Placa I
	Controle
	
	
	
	
	
	
	Mão Suja
	
	
	
	
	
	
	Detergente
	
	
	
	
	
	
	Álcool 70%
	
	
	
	
	
Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da anti-sepsia das mãos na odontologia?
6. MICROSCOPIA - Reconhecimento
6.1. Procedimento:
Retire o microscópio de seu estojo e coloque-o sobre a mesa
Se o microscópio estiver desmontado, siga as instruções para sua montagem
Observe a figura abaixo e procure identificar todas as suas partes
6.2. TÉCNICA DE UTILIZAÇÃO E CUIDADOS
A primeira regra a ser observada é carregar corretamente o microscópio. Deve-se segurar o braço com uma das mãos e apoiar o pé sobre a outra mão, mantendo-se o aparelho na posição vertical. Fora dessa posição, partes ópticas podem soltar-se e cair, com conseqüências desastrosas. Choques devem ser evitados, pois os eixos dos sistemas ópticos podem sair de concordância inutilizando parcialmente o aparelho. Cuidados devem ser tomados para não arranhar as lentes.
Outra recomendação importante é iniciar o trabalho limpando o microscópio não só para obter bons resultados como também para aumentar a sua durabilidade; a poeira é grande inimiga dos instrumentos ópticos. As partes mecânicas podem ser limpas com um pano macio e, o aparelho e as lentes com papel absorvente macio.
Deve-se cuidar, a seguir, da iluminação. O diafragma deve ser aberto e o condensador deve ser aproximado da platina (ou prato). Agora, com a objetiva de menor aumento, e por meio do parafuso macrométrico baixa-se o tubo do microscópio (ou eleva-se à platina) até que a objetiva fique próxima da platina e, olhando através das oculares abaixar o tubo (ou elevar a platina) até obter iluminação forte e uniforme do campo.
A operação seguinte é subir o tubo (ou abaixar a platina) e colocar a lâmina com a preparação sobre a platina. Olhando por fora do aparelho, baixa-se à objetiva até alguns milímetros da preparação e, em seguida, olhando pelas oculares, sobe-se o tubo (ou abaixa-se à platina) cuidadosamente até observar uma imagem mais ou menos nítida, sempre utilizando o parafuso macrométrico. Por fim, utilizando o parafuso micrométrico, faz-se à focalização fina, isto é, procura-se maior nitidez possível da imagem.
7. Microscopia a Fresco
Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração. 
A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactérias e atividades celulares como a mobilidade bacteriana. 
A respeito da mobilidade é possível observar dois movimentos: o movimento flagelar, que é ativo e característico de bactérias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual é passivo e ocorre na direção das correntes líquidas que se formam nas preparações.
7.1. Objetivo
	Observar preparações de lâminas a fresco identificando movimentos bacterianos em microscópio ótico. 
7.2. Procedimento
Será utilizada a técnica denominada Gota Pendente, na qual o inoculo (cultura de microrganismo) fica suspenso em uma lâmina escavada (lâmina de Koch).
 Retire com uma alça esterilizada uma gotícula da cultura-teste.
 Deposite esta gotícula no centro de uma lamínula previamente limpa e seca.
 Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lâmina escavada, também limpa e seca.
 Inverta a lâmina côncava sobre a lamínula de forma que a gotícula ocupe o centro da concavidade.
 Inverta novamente a posição da lâmina, de forma que a gotícula fique pendente no centro da concavidade.
 Leve a preparação ao microscópio e focalize a gota com objetiva de 40x com luz reduzida (as bactérias possuem índice de refração próximo ao da água).
 	Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O movimento flagelar é caracterizado pelo deslocamento, pela mudança da posição da bactéria, enquanto que o browniano não acarreta mudança na posição, não há deslocamento autônomo da bactéria.	
Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. 
7.3. Responda:
Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos, exemplificando o movimento observado.
Qual é a finalidade da utilização da técnica de gota pendente?
8. Colorações - Microscopia de Gram
A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é à base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e tintoriais da bactéria em pesquisa.
A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal violeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as bactérias Gram-negativas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada às bactérias Gram-negativas, que foram descoloradas pelo álcool-acetona.
8.1. Procedimento:
8.1.1. Esfregaço da cultura bacteriana líquida
Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama.
Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina.
Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.
Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.
8.1.2. Esfregaço de cultura bacteriana sólida
Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama.
Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina.
Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida.
Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinizecom movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.
Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.
8.1.3. Adição de Corantes
Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.
Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto.
Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço.
Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina.
Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.
Cubra a lâmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lâmina.
Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama).
Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço)
�
8.2. Avaliação dos resultados e fixação de conhecimento
Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as.
Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial.
Fale sobre o fundamento da técnica de Gram.
9. Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura
9.1. Meios de Cultivo
Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos.
As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:
crescimento bacteriano;
 isolamento bacteriano;
 estudo da morfologia colonial;
 pesquisa de patogenicidade;
 pesquisa das características bioquímicas.
Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.
9.1.1. Classificação dos meios de cultivo:
Quanto à consistência:
Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja, o meio sofre uma turvação.
Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.
Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de microrganismos.
Quanto à função:
Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples.
Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar sangue.
Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.
Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar MacConkey.
Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente.
-Quanto à natureza:
Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionado.
Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos. Naturais são aqueles que possuem substâncias provenientes da natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da união dos dois anteriores.
Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.
9.2. Técnica de Semeadura
A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações:
A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.
Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen.
Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.
Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.
9.3. Procedimento em Meio Líquido
Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça.
9.4. Procedimento em Meio semi-sólido
Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida.
Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido.
9.5. Procedimento em Meio sólido (ágar inclinado)
Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfície do ágar.
9.6. Procedimento em Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)
Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa.
Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a superfície da placa.
9.7. Responda:
Cite os três tipos de meio de cultivo utilizados na aula prática e suas finalidades.
Qual a finalidade do cultivo em meio sólido em placa através de estrias de esgotamento? Explique.
Como se analisa o resultado obtido no crescimento do meio semi-sólido?
10. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)
Antibiogramas são bioensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Os testes de rotina fornecem dados acumulados, que são informações sobre os agentes para uso empírico. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration)ou MBC (minimun bactericidal concentration).
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais:
Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.
Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland).
10.1. Procedimento
Para cumprir os objetivos desta aula será utilizado o método de difusão:
Sature um swab de algodão com a suspensão bacteriana (Fig 1). Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.
Semeie a suspensão sobre a superfície estéril de uma placa contendo ágar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar ( Fig 2 ).
Distribua cinco discos de antibiótico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distância de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco.
Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação.
Incube as placas por 24 horas a 37°C.
10.2. Análise dos Resultados
Através da análise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro(Fig 4). 
No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas. 
FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade
	Antimicrobiano
	Código
	[µg]
	Halos de Inibição (mm)
	
	
	
	Resistente
	Intermediário
	Moderadamente sensível
	Sensível
	Bacitracina
	BAC
	10
	< 8
	9 a 12
	-
	> 13
	Cefotaxima
	CTX
	30
	< 14
	-
	15 a 22
	> 23
	Gentamicina
	GEN
	10
	< 12
	13 a 14
	-
	> 15
	Tetraciclina
	TET
	30
	< 14
	15 a 18
	-
	> 19
	Vancomicina
	VAN
	30
	< 9
	10 a 11
	-
	> 12
EXEMPLO: Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de 13 mm o microrganismo seria classificado como intermediário a Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o microrganismo seria considerado resistente.
10.3. Responda:
1. Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactéria utilizada, a formação ou não do halo de inibição para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificação da bactéria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.
2- Explique como se forma um halo de inibição.
11. Contagem de Microrganismos na Escova Dental 
A cavidade bucal é um ambiente densamente povoado por microrganismos. Portanto considerando o íntimo contato da escova dental com tal ambiente é de se imaginar que este objeto de higiene pessoal seja especialmente contaminado com os diversos tipos de microrganismos que habitam a cavidade bucal.
11.1. Objetivo
 
Experimento a ser realizado, tem por objetivo a verificação da presença de microrganismos na escova dental, através de procedimentos quantitativo (contagem) e qualitativo (coloração de Gram).
11.2. Procedimento
 Mergulhar a escova dental em balão ou erlenmeyer com caldo nutritivo estéril (trabalhe próximo à chama do Bico de Bunsen).
 Agite a solução por 5 minutos.
 Retire a escova.
 Faça a diluição, retirando, com auxílio de uma pipeta esterilizada, 1ml da solução e transferindo para um tubo contendo 9 ml de solução salina.
 Agite bem o tubo.
 Repita os procedimentos 4 e 5 para cada nova diluição sempre pegando uma amostra de 1 ml da última solução preparada, e não esquecendo de a cada nova diluição utilizar uma nova pipeta esterilizada.
 Retire 0,1 ml, utilizando uma pipeta esterilizada, da solução com diluição de 10-1.
 Espalhe por toda a superfície da placa de ágar, utilizando a alça de Drigalski (de vidro).
 Repita os procedimentos 7 e 8 para as diluições de 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5 , não esquecendo de identificar as placas com as diluições correspondentes a cada uma.
 10- Leve as placas para incubar.
11.3. Análise dos Resultados
11.3.1. Análise quantitativa:
O objetivo desta análise é determinar o número de bactérias por ml, para isso:
- Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colônias;
- Conte o número de colônias;
- Calcule, no espaço abaixo reservado, a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula:
* UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a contagem feita é referente às colônias e não às células presentes.
** 10 é um fator de correção.
EXEMPLO:
Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2 , o cálculo final será:
UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml
11.3.2. Análise dos microrganismos através do método de Gram.
O objetivo desta análise é verificar o tipo de microrganismos presentes segundo: forma, arranjo e reação tintorial (Gram positivo ou Gram negativo).
- Com a alça esterilizada, retire uma gota do tubo de ensaio com água destilada e deposite sobre a lâmina.
- Com a alça esterilizada, retire 2 a 3 colônias da placa com as culturas bacterianas.
- Leve a massa bacteriana até a gota previamente depositada sobre a lâmina, e misture com movimentos circulares, formando um esfregaço de forma aproximadamente oval.
- Seque a lâmina na chama do bico de Bunsen.
- Core a lâmina, através do método de Gram. (siga as instruções da Técnica de adição de corantes, pág. 16).
CÁLCULO DA UFC
11.4. Responda:
1. Calcule a quantidade de microrganismos (UFC), seguindo as instruções da Análise Quantitativa, dos cultivos feitos a partir de microrganismos da escova dental.
O que se pode concluir a respeito da quantidade de microrganismos encontrados na escova dental?
Utilizando o método de Gram, quais os tipos bacterianos foram predominantemente observados dentre os microrganismos encontrados na escova dental?
12. Análise de Coliformes Fecais e Staphylococcus aureus em amostras de queijo tipo frescal e mussarela fatiada
De acordo com a Resolução RDC de 12 de janeiro de 2001, ver verso do protocolo, as amostras de queijo devem ter os seguintes padrões oficiais.
Atentem a classificação dos tipos de queijos citados na legislação e nos tipos de queijos a serem analisados em aula. A seguir sugerir os padrões a serem abordados por este relatório.
Obs. Ao se fazer a pesagem da amostra, usar utensílio cortante esterilizado e pesar a amostra sobre papel esterilizado. A referida pesagem deverá ser feita embalança, a qual deverá ser tarada com o papel a ser colocada a amostra, e a mesma deverá estar colocada em ambiente asséptico, próximo ao bico de bunsem. Depois de pesada a amostra esta deverá ser colocada no liquidificador, juntamente com o diluente apropriado, e será triturada e homogeneizada.
Água (amostra)
Pesar 25g de queijo e colocar em 
225mL de Citrato de sódio a 2%. 
Triturar no Liquidificador
(Diluição 10-1)
 Diluições (água peptonada): 10-2 10-3 10-4
Inoculação em Caldo Lauryl
 (LST) e incubar a 35°/48hs 
Inoculação em ágar Baird Parker por superfície e incubar a 37°C/48hs.
 (Inocular 0,1 mL das respectivas diluições e após 
espalhar com alça de Drigralski )
Amostras positivas em Lauryl transferir para caldo EC através de alça de platina e inocular a 45°C/48hs em banho-maria
Amostras positivas transferir para agar EMB através de alça de platina por estria e incubar a 45°C por 24 horas
	8. B- Queijos
	Grupos alimentos
	microrganismos
	Tolerância para amostra indicativa
	n
	c
	m
	M
	  a) de baixa umidade:
	 Coliformes a 45oC/g
	 5x102
	 5
	 2
	 102
	 5x102
	 
	 Estaf.coag.positiva./g
	 103
	 5
	 2
	 102
	 103
	 
	 Salmonella sp/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	b) de média umidade: 36% (Danbo, pategrás sandwich, prato, tandil, tilsit, tybo, mussarela (mozzarella, muzzarella) curado e similares) e de queijo ralado e em pó
	 Coliformes a 45oC/g
	 103
	 5
	 2
	 5x102
	 103
	 
	 Estaf.coag.positiva./g
	 103
	 5
	 2
	 102
	 103
	 
	 Salmonella sp/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	 
	 L.monocytogenes/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	  c) quartirolo, cremoso, criollo, mussarela (mozzarella, muzzarella) e similares: 46%
	 Coliformes a 45oC/g
	 5x103
	 5
	 2
	 103
	 5x103
	 
	 Estaf.coag.positiva/g
	 103
	 5
	 2
	 102
	 103
	 
	 Salmonella sp/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	 
	 L.monocytogenes/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	  d) de alta umidade: 46% de muito alta umidade: umid 55%, com bactérias lácticas abundantes e viáveis, incluído o Minas frescal correspondente
	 Coliformes a 45oC/g
	 5x103
	 5
	 2
	 103
	 5x103
	 
	 Estaf.coag.positiva/g
	 103
	 5
	 2
	 102
	 103
	 
	 Salmonella sp/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	 
	 L.monocytogenes/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	 f) de muito alta umidade: umid 55%, incluindo os queijos de coalho com umidade correspondente, minas frescal, mussarela (mozzarella, muzzarella) e outros, elaborados por coagulação enzimática, sem a ação de bactérias lácticas
	 Coliformes a 45oC
	 5x102
	 5
	 2
	 5x10
	 5x102
	 
	 Estaf.coag.positiva/g
	 5x102
	 5
	 1
	 102
	 5x102
	 
	 Salmonella sp/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
	 
	 L.monocytogenes/25g
	 Aus
	 5
	 0
	 Aus
	 -
� EMBED PBrush ���
Eng alito
10/02/05
P1/ G3
água mineral
ágar EMB
Profª Kelly Brabes
Eng Alito
10/02/05
P1/ G3
água mineral
caldo EC
Profª Kelly Brabes
� EMBED PBrush ���
� EMBED PBrush ���
Figura 1
� EMBED PBrush ���
Figura 3
� EMBED PBrush ���
Figura 4
� EMBED PBrush ���
Figura 1
� EMBED PBrush ���
(SWAB
� EMBED PBrush ���
Figura 2
Figura 3
� EMBED PBrush ���
Figura 4
� EMBED PBrush ���
UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem)
0,1mL
1mL
1mL
�PAGE �
�PAGE �6�
�
_1113810592/ole-[42, 4D, DE, 51, 00, 00, 00, 00]
_1120050795/ole-[42, 4D, 02, 62, 05, 00, 00, 00]
_1122108721/ole-[42, 4D, F6, 00, 01, 00, 00, 00]
_1218120882.bin
_1120058079/ole-[42, 4D, B6, DF, 00, 00, 00, 00]
_1113811115/ole-[42, 4D, B6, 8E, 00, 00, 00, 00]
_1114263998/ole-[42, 4D, 6E, 55, 01, 00, 00, 00]
_1113811020/ole-[42, 4D, 22, AD, 00, 00, 00, 00]
_1111394009/ole-[42, 4D, BA, 6A, 02, 00, 00, 00]
_1111908269/ole-[42, 4D, 4E, 58, 01, 00, 00, 00]
_1111393862/ole-[42, 4D, EE, 4C, 01, 00, 00, 00]
_1111393731/ole-[42, 4D, 3A, B4, 02, 00, 00, 00]