pratica - coloração de gram

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Aula Prática: Coloração de Gram
Desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram, é um dos métodos de coloração mais aplicados em Bacteriologia. Trata-se de um método de coloração diferencial, dado que permite dividir as bactérias em duas classes - Gram negativas e Gram positivas. É uma ferramenta essencial na classificação e diferenciação de bactérias. 
Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor lipídico, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. 
A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lípidos elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática. Em consequência, durante o passo de diferenciação pelo alcool, parte dos lípidos são dissolvidas pelo alcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (violeta de cristal) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina). 
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Aula Prática: Coloração de Gram
Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor lipídico, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. 
A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lípidos elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática. Em consequência, durante o passo de diferenciação pelo alcool, parte dos lípidos são dissolvidas pelo alcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (violeta de cristal) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina). 
A parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lípidos é nulo ou muito baixo (em poucas espécies bacterianas). A camada de peptidoglicano actua, assim, como uma barreira impedindo a saída do corante primário e estas células ficam coradas de violeta escuro. 
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Aula Prática: Coloração de Gram
Coloração de Gram de células E. coli
Procedimento experimental
 
Passo 1
Preparar suspensões de células de E. coli em água destilada: transferir, com uma alça esterilizada na chama do bico de Bunsen, uma porção de cada uma das culturas fornecidas, para lâminas contendo uma gota de água destilada. Preparar um esfregaço de cada uma das culturas, espalhando uma gota de cada uma das suspensões celulares preparadas acima sobre uma lâmina de vidro desengordurada, recorrendo a uma alça esterilizada. Secar ao ar; 
 
Passo 2
Fixar cada esfregaço pelo calor, passando rapidamente a lâmina contendo o esfregaço sobre a chama do bico de Bunsen. Repetir este procedimento mais duas vezes; 
 
Passo 3
Corar a preparação pelo método de Gram; 
 
Passo 5
Observar no microscópio óptico de campo claro com objetiva de imersão (x 100), não esquecendo colocar uma gota de óleo de imersão entre a preparação e a objetiva. 
Analisar os resultados
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Coloração de células pelo método de Gram
 
Procedimento experimental
1- Cobrir o esfregaço da cultura em estudo (previamente fixado à lâmina de vidro) com uma solução de Violeta de cristal (VC). Deixar actuar durante 1 minuto. 
Nota: Após este passo, todas as células ficam coradas com o violeta de cristal (corante primário). 
2- Escorrer o corante e lavar com água. Secar com papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação com reagente de Lugol e deixar actuar durante 1 minuto. 
 
3- Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e secar. 
Nota: O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo violeta de cristal-iodo (VC-I) tem uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre e é mais díficil de remover das células.
 
4- Diferenciar pelo álcool a 90°, deixando cair a solução de álcool gota a gota sobre a preparação até que não saia mais corante. 
Nota: Este é o passo de diferenciação entre bactérias Gram negativas e Gram positivas. As primeiras perdem o complexo VC-I e as últimas retêm-no. As células de bactérias Gram positivas ficam, pois, coradas de violeta-escuro e as Gram negativas ficam incolores.
 
5- Lavar com água, escorrer e secar com papel de filtro. 
6-Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos, com uma solução de safranina. 
Nota: As células incolores de bactérias Gram negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do contra-corante safranina).
 
7- Escorrer o corante, lavar com água e secar com papel de filtro. 
 
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E. coli
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Figura 1. Bacillus subtilis Figura 2. Streptococcus oralis 
Figura 3. Escherichia coli Figura 4. Neisseria gonorrhoeae