Relatório ESPECTROFOTOMETRIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA 
 
 
 
 
 
 
 
PRÁTICA III - ESPECTROFOTOMETRIA 
 
 
 
 
 
 
GABRIELA ALVES VALENTIM 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
DEZEMBRO DE 2017 
1. INTRODUÇÃO 
A espectroscopia é a ciência que estuda as interações entre a radiação e 
a matéria. Os métodos espectroscópicos baseiam-se na medição da quantidade de 
radiação produzida ou absorvida por uma substância de interesse. Um dos métodos 
espectroscópicos mais utilizados e acessíveis para análises químicas hoje é a 
espectrofotometria na faixa ultravioleta e da luz visível (SKOOG et al., 2006). 
A espectrofotometria consiste em um método onde um espectro de luz é 
utilizado para inspecionar soluções. O procedimento mais básico atravessa a 
solução com um feixe de energia e a medida quantitativa da luz absorvida permite 
identificar e quantificar biomoléculas em uma solução (DÍAZ et al., 2006; HENEIDE, 
2010). 
A radiação eletromagnética pode ser descrita como uma onda com 
propriedades como comprimento, frequência, velocidade e amplitude, não 
requerendo nenhum meio para sua transmissão, passando facilmente pelo vácuo. O 
comprimento de onda, λ, é a distância linear entre dois máximos ou dois mínimos 
sucessivos de uma onda, e é expresso em nanômetros (nm) (SKOOG et al., 2006). 
A parcela do espectro magnético que é visível ao olho humano é bastante pequena, 
sendo estas as radiações eletromagnéticas com comprimentos de onda entre 400 e 
750nm. A zona do espectro com comprimento de onda abaixo de 400nm é 
denominada ultravioleta (UV), e aquela zona acima de 750nm corresponde a zona 
infravermelha (HENEIDE, 2010). 
A medição da quantidade de luz absorvida na espectrofotometria é 
realizada por um equipamento chamado espectrofotômetro. O espectrofotômetro é 
um aparelho capaz de produzir luz monocromática e medir a quantidade de luz 
absorvida pelas soluções. Ele é composto por uma fonte de luz, que possui seu feixe 
focalizado por um colimador sobre um prisma de quartzo. O prisma decompõe a luz 
em ultravioleta, violeta, azul, verde, amarelo, laranja, vermelho e infravermelho. Uma 
fenda seletora ajuda a selecionar qual comprimento de onda (λ) será utilizado para 
realizar a absorção. A luz monocromática, então, atravessa a cubeta com solução e 
parte da luz é transmitida, enquanto outra parte é absorvida. Um galvanômetro com 
uma fotocélula capta e mensura a luz transmitida. A diferença entre a luz emitida 
pelo equipamento e a luz transmitida é a luz absorvida (HENEIDE, 2010). As 
cubetas utilizadas para conter a solução podem ter vários formatos e tamanhos, mas 
a padrão tem um trajeto óptico de 1cm. Quando desejamos estudar uma solução 
utilizando comprimento de onda entre 400 e 750nm (luz visível), a cubeta pode ser 
de vidro ou plástico. No entanto, quando estudamos uma solução utilizando 
comprimento de onda dentro do espectro do ultravioleta, a cubeta utilizada deve ser 
de quartzo (DÍAZ et al., 2006). 
Johann Heinrich Lambert e August Beer, independentemente, fizeram 
importantes descobertas no campo da óptica. Suas descobertas hoje são 
conhecidas como a lei de Lambert-Beer, que relaciona a absorbância de uma luz 
monocromática com a concentração de uma solução (DÍAZ et al., 2006). Essa lei diz 
que quando a concentração da amostra não se altera, a absorção depende do 
comprimento do trajeto óptico (lei de Lambert) e que quando o trajeto óptico é 
constante, a absorção depende da concentração (lei de Beer). Combinando a 
descoberta dos cientistas, é possível observar que a absorção é proporcional ao 
trajeto óptico e a concentração (HENEIDE, 2010). A absorbância é influenciada 
também pela constante de absortividade molar da substância, que é a capacidade 
de um mol da substância de atenuar a luz incidida em um certo comprimento de 
onda. Essa relação é expressa na equação , onde A é a absorbância, ε 
é o coeficiente de absortividade, c é a concentração e l é o caminho óptico. 
Em algumas analises, onde não é necessário possuir conhecimento sobre 
fatores absolutos das amostras, podemos determinar a concentração de substâncias 
a partir de sua absorbância, comparando sua absorbância com aquelas de amostras 
com concentrações conhecidas. A curva padrão, também chamada de curva de 
calibração, é obtida a partir da leitura de absorção de várias concentrações 
conhecidas da substância que desejamos analisar, sempre em um mesmo 
comprimento de onda onde a substância apresenta maior absorbância (HENEIDE, 
2010). A partir da criação da curva padrão, podemos determinar a concentração de 
uma substância a partir da leitura de sua absorbância, calculando o fator de 
calibração, dado pela cotangente do ângulo formado pela curva, e aplicando na 
fórmula , onde F é o fator de calibração, A é a absorbância média e D 
é a diluição da amostra. 
A espectrofotometria, principalmente a espectrofotometria de absorção no 
infravermelho, é largamente por ser uma técnica simples e confiável para controle de 
qualidade e outras análises dinâmicas. Esse método é utilizado para identificação de 
compostos desconhecidos a partir da criação de curvas espectrais, identificação de 
grupamentos químicos específicos que possuem curvas espectrais características, 
identificação de impurezas em substâncias, determinação da concentração de um 
composto a partir da criação de uma curva padrão e acompanhamento de reações 
catalisadas por enzimas, possuindo grande importância para a indústria e pesquisa 
científica (HENEIDE, 2010; SKOOG et al., 2006). 
 
2. OBJETIVOS 
 Montar e analisar o espectro de absorção e análise quantitativa por 
fotometria; 
 Calcular a concentração de amostras desconhecidas; 
 Identificar e operar um espectrofotômetro. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
No dia 14 de novembro de 2017, a prática aqui relatada foi realizada no 
Laboratório N1, localizado no bloco 907, Departamento de Bioquímica e Biologia 
Molecular, na Universidade Federal do Ceará (UFC), durante as aulas da disciplina 
de Biofísica, lecionadas pelo Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira. 
Os materiais utilizados na prática aqui relatada foram espectrofotômetro, 
cubeta de plástico com caminho óptico de 1 cm, solução de 4,0mg/mL de azul de 
bromofenol, solução com concentração de azul de bromofenol desconhecida, água 
destilada, tubos de ensaio e pipeta automática. 
A prática foi dividida em 3 etapas, sendo a primeira a definição do 
espectro de absorção do azul de bromofenol. Nessa etapa, foi preparada uma 
solução diluída utilizando-se 2mL da solução mãe de azul de bromofenol 
(concentração = 4,0 mg/mL) e 2mL de água destilada. O espectrofotômetro foi ligado 
e o comprimento de onda foi ajustado em 420nm. A cubeta de plástico foi 
preenchida com água destilada e utilizada para zerar a leitura de absorbância, 
descontando dessa forma o valor da absorbância da água e da cubeta. Assim, 
aumentamos a precisão da leitura, garantindo que o valor registrado pelo 
equipamento seja resultado do azul de bromofenol. Em seguida, a cubeta plástica foi 
retirada do equipamento e a água foi substituída pela solução diluída. A cubeta foi 
devolvida ao compartimento do aparelho e a leitura da absorbância foi registrada. O 
mesmo procedimento foi repetido na faixa de comprimento de onda que varia de 420 
a 700nm, sempre aumentando de 40 em 40nm, e certificando-se de zerar a leitura 
com a cubeta preenchida por água. Terminada a varredura dos comprimentos de 
onda, foi criado um gráfico do espectro de absorção do comprimento de onda. 
Na segunda etapa foiconstruída uma curva-padrão a partir de 
concentrações conhecidas de azul de bromofenol. Após a definição do comprimento 
e onda de maior absorção pelo corante através da etapa anterior, foram realizadas 
06 diluições da solução mãe de azul de bromofenol nos tubos de ensaio, como 
indicado na tabela 01. Em seguida, o espectrofotômetro realizou a leitura da 
absorbância da água destilada na cubeta e, por fim, foi zerado. A primeira diluição 
foi utilizada para preencher a cubeta plástica e sua absorbância foi determinada. 
Utilizando-se o mesmo procedimento foram realizadas as leituras da absorbância de 
todas as diluições preparadas. A concentração de cada diluição preparada foi 
calculada e a partir dessas informações foi criada uma curva padrão relacionando a 
absorbância com a concentração do corante. Foi calculado também o fator de 
correção da curva-padrão. 
Tabela 1 - Volumes de solução de azul de bromofenol (4 mg/mL) e água utilizados para realização de 06 
diluições empregadas na construção da curva padrão do azul de bromofenol. O tubo denominado branco 
continha apenas água e foi utilizado para zerar a absorbância no comprimento de onda estabelecido para análise. 
Tubo 
Volume de solução mãe de azul 
de bromofenol (4 mg/mL) 
Volume (mL) de água 
destilada 
[Azul de bromofenol] 
Branco 0,0 mL 4,0 mL 0 mg/mL 
1 0,5 mL 3,5 mL 0,5 mg/mL 
2 1,0 mL 3,0 mL 1,0 mg/mL 
3 1,5 mL 2,5 mL 1,5 mg/mL 
4 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mg/mL 
5 3,0 mL 1,0 mL 3,0 mg/mL 
6 4,0 mL 0,0 mL 4,0 mg/mL 
 
Na terceira etapa, a amostra com concentração de azul de bromofenol 
desconhecida foi utilizada para preencher a cubeta plástica três vezes, derramando-
se a amostra ao final de cada leitura de absorbância e preenchendo a cubeta 
novamente. Cada uma das três alíquotas teve sua absorbância analisada e a partir 
da leitura foi calculada a absorbância média da amostra. Esse valor foi utilizado 
para, de posse do fator de calibração, realizar o cálculo da concentração da 
amostra. 
 
4. RESULTADOS 
Os valores de absorbância determinados para a solução diluída, contendo 
2mL de solução mãe de azul de bromofenol (concentração = 4,0 mg/mL) e 2mL de 
água destilada, em uma faixa de comprimento de onda de 420 a 700nm podem ser 
encontrados na tabela 02. Os valores desta tabela foram plotados na figura 01 para 
construção do espectro de absorção do azul de bromofenol. 
Tabela 2 - Variação das absorbâncias da solução de azul de bromofenol na 
concentração de 2,0mg/mL em comprimentos de onda que variam na faixa de 420 a 
700nm, variando de 40 em 40nm. A absorbância do branco também foi especificada 
para comparação. 
Comprimento de 
onda (λ) 
Absorbância do branco 
(cubeta + água) 
Absorbância da 
amostra diluída 
420 nm 0,026 0,000 
460 nm 0,072 0,010 
500 nm 0,092 0,035 
540 nm 0,087 0,108 
580 nm 0,085 0,253 
620 nm 0,080 0,048 
660 nm 0,072 0,003 
700 nm 0,075 0,003 
 
 
 
O comprimento de onda de 580nm foi utilizado para determinação da 
curva padrão do corante. Na tabela 03 podem ser observados os valores de 
absorbância obtidos a partir da leitura de diferentes concentrações de azul de 
bromofenol neste comprimento de onda. Os valores presentes na tabela 03 foram 
utilizados para construção da curva padrão observada na figura 02. 
Tabela 3 - Medidas de absorbância de diferentes concentrações da solução de azul de bromofenol, 
com concentrações variando entre 0,5 e 4,0mg/mL. O tubo denominado branco continha apenas 
água e foi utilizado para zerar a absorbância no comprimento de onda estabelecido para análise. 
** A absorbância do tubo demoninado D, com concentração de azul de bromofenol desconhecida, 
foi obtida a partir da média de leituras realizadas em triplicata. 
Tubo [Azul de bromofenol] Absorbância 
Branco 0 mg/mL 0,087 
1 0,5 mg/mL 0,070 
2 1,0 mg/mL 0,143 
3 1,5 mg/mL 0,213 
4 2,0 mg/mL 0,280 
5 3,0 mg/mL 0,418 
6 4,0 mg/mL 0,540 
D - 0,267 ** 
 
 
0 
0,05 
0,1 
0,15 
0,2 
0,25 
0,3 
420 460 500 540 580 620 660 700 
A
b
s
o
rb
â
n
c
ia
 
Comprimento de onda (λ) em nm 
Figura 1 – Curva espectral do azul de bromofenol construída a partir da variação das 
absorbâncias de uma solução de azul de bromofenol na concentração de 2,0mg/mL em 
comprimentos de onda que variam na faixa de 420 a 700nm, variando de 40 em 40nm. 
 
 
5. DISCUSSÃO 
Como observado na figura 01, o pico máximo de absorção da solução de 
azul de bromofenol com concentração de 2mg/mL foi do comprimento de onda de 
580nm. Assim, este comprimento foi utilizado para determinação da curva padrão do 
corante, já que o comprimento de onda utilizado para uma dosagem colorimétrica 
deve ser aquele onde há maior absorção e menor transmissão de luz (DÍAZ et al., 
2006). 
O coeficiente de absortividade molar, também conhecido como coeficiente 
de extinção molar, pode ser calculado através da lei de Lambert-Beer, , 
onde ε é o coeficiente de absortividade molar, A é absorbância da amostra, c é a 
concentração molar e l é o caminho óptico. Considerando que na concentração de 
1,0mg/mL a absorbância foi de 0,143 e que a massa molar do azul de bromofenol é 
669,96Da, podemos encontrar a o coeficiente de extinção molar do corante azul de 
bromofenol. 
 
 
 
 
y = 0,1357x + 0,0051 
R² = 0,9992 
0 
0,1 
0,2 
0,3 
0,4 
0,5 
0,6 
0 1 2 3 4 5 
A
b
so
rb
ân
ci
a 
Concentração de Azul de Bromofenol (mg/mL) 
Figura 2 - Curva padrão do azul de bromofenol criada a partir dos valores de absorbância 
encontrados em diferentes concentrações do corante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Com o auxílio da curva padrão o fator de calibração pode ser calculado, 
dado pela cotangente do ângulo formado na reta ou o inverso da inclinação da reta. 
A curva padrão apresentou um R² de 0,992, o que indica um nível de confiança de 
99,2%. 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De posse do fator de calibração, podemos calcular a concentração de 
azul de bromofenol na amostra com concentração desconhecida desse corante. 
Para isso, utilizamos a equação , onde F é o fator de calibração, A é a 
absorbância média e D é a diluição da amostra. 
 
 
A diluição é dada pela razão entre a concentração da solução mãe de 
azul de bromofenol e da solução desconhecida. Dessa forma, é possível descobrir 
que a solução de concentração desconhecida foi obtida a partir da diluição da 
solução mãe em 2,03 vezes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. CONCLUSÃO 
A partir da leitura de uma amostra de concentração conhecida em vários 
comprimentos de onda foi possível estabelecer o espectro de absorção do azul de 
bromofenol e determinar o comprimento de onda de 580nm como aquele que 
apresenta maior absorbância no corante. Além de ensinar aos alunos como operar 
um espectrofotômetro, a prática permitiu também o cálculo da concentração de 
amostras desconhecidas a partir da determinação da curva padrão, demonstrando a 
eficiência da prática. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
DÍAZ, N. A., RUIZ, A. B., REYES, E. F., CEJUDO, A. G., NOVO, J. J., PEINADO, J. 
P., MELÉNDEZ-VALDÉS, F. T., FIÑANA, I. T. 2006. Espectrofotometría: 
Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. 
Disponível em: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf. Acesso em: 04. dez. 2017. 
HENEIDE, I. F. Biofísica básica. São Paulo: Editora Atheneu, 2010. 
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J., CROUCH, S. R. Fundamentos de 
Química Analítica. Tradução da 8ª edição norte-americana. São Paulo: Editora 
Thomson, 2006.