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CENTRO UNIVERSITÁRIO FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS - FMU FACULDADE DE FARMÁCIA Júlio Cesar Pellegrini Romano CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PARACETAMOL EM COMPRIMIDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA São Paulo, 2021 2 Júlio Cesar Pellegrini Romano CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PARACETAMOL EM COMPRIMIDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA Relatório técnico apresentado como requisito parcial para obtenção de aprovação na disciplina Química Analítica Aplicada a Farmácia, no Curso de Farmácia, na FMU. Prof. Msc. Jorge Eduardo de Menezes São Paulo, 2021 3 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 3 2 DESENVOLVIMENTO.................................................................................. 10 2.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................... 10 2.2 MATERIAIS E REAGENTES ...................................................................... 10 2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS........................................................ 10 2.4 RESULTADOS.............................................................................................. 13 3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES....................................................... 19 REFERÊNCIAS............................................................................................. 20 4 1 INTRODUÇÃO Há alguns anos, a espectroscopia é muito utilizada como método analítico quantitativo para mensurar concentração de analito em amostras desconhecidas. Esse método utiliza-se da interação entre a luz e a matéria. A identificação e mensuração dessa interação é obtida pelas luzes transmitidas no espectro eletromagnético, ou seja, a partir dessa transmissão é possível realizarmos os cálculos de concentração da substância que desejamos saber em uma determinada amostra. Entretanto, para compreensão do mecanismo da espectroscopia, é necessário entendermos inicialmente como funciona o espectro eletromagnético e, para tanto, precisamos abordar alguns aspectos físicos relacionados a emissão, absorção e transmissão da luz. A luz é composta por energia eletromagnética, que por sua vez, é definida como um tipo de energia não corpuscular, ou seja, não apresenta nenhum tipo partícula, ela existe por meio de magnetismo. A energia eletromagnética é considerada vibracional, em outras palavras, a transmissão dessa energia ocorre através da vibração entre uma molécula e a outra, que permite que a energia eletromagnética se propague no espaço existente entre as moléculas. Assim sendo, a propagação dessa energia ocorre em formato de ondas, as quais são denominadas ondas eletromagnéticas. A luz branca, por exemplo, é composta pela união de todas as outras luzes, sendo que cada uma dessas luzes possui um determinado comprimento de onda. Baseando-se nesses diferentes comprimentos e amplitudes das ondas eletromagnéticas foi possível definir-se então o espectro eletromagnético e classificar os comprimentos de onda de acordo com a luz emitida em cada espectro. Essa classificação foi dividida em grupos com base no comprimento de ondas eletromagnéticas. Dentre esses grupos de classificação, a espectroscopia atua basicamente em três deles: espectro de luz infravermelho, espectro de luz visível (perceptível ao olho humano) e espectro de luz ultravioleta. O comprimento dessas ondas é medido em nanômetros (nm), que representa bilionésima parte (10-9) de um metro (m). A classificação do espectro eletromagnético pode ser identificada na figura abaixo. 5 Figura 1 - Espectro Eletromagnético. Como é possível notar na figura acima, o espectro de luz visível varia de um comprimento de onda eletromagnética entre 400nm e 800nm. Dentro deste espectro, a luz emitida com comprimento de onda próximo aos 400nm é a luz de cor violeta e a luz emitida com comprimento de onda próximo aos 800nm é a luz de cor vermelha; fato que justifica o nome dos espectros vizinhos ao espectro visível da luz serem denominados ultravioleta e infravermelho, respectivamente. Dessa forma, a interação dessas luzes com a matéria varia de acordo com o comprimento de onda. Por exemplo, ao analisarmos uma radiografia, é possível concluir que os ossos são capazes de absorver as ondas eletromagnéticas da radiação e, por isso, aparecem brancas (radiopacas) no filme radiográfico; enquanto músculos e outros tecidos do corpo humano não absorvem esse comprimento de onda, permitindo que as mesmas transpassem o tecido e proporcionem ao filme radiográfico o aspecto escuro (radiolucidas). Metais como o chumbo (Pb) por exemplo, são metais com alta capacidade de absorção de ondas de raio-x, por isso, são muito utilizados para desenvolvimento de materiais de radioproteção. Já no espectro ultravioleta, estão as ondas capazes de penetrar as camadas mais superficiais do corpo humano, como derme e epiderme. Por isso, é muito comum encontrarmos no mercado cremes com filtro solar eficazes contra UVA, UVB e UVC, que são ondas eletromagnéticas com diferentes comprimentos dentro do espectro ultravioleta; bem 6 como presente nas películas de proteção solar dos óculos escuros, as quais garantem proteger o olho humano contra esse tipo de radiação solar. Analisando-se os espectros, é possível concluir, também, que o poder de penetração das ondas eletromagnéticas é inversamente proporcional ao comprimento da onda, ou seja, quanto menor o comprimento da onda, maior será o seu poder de penetração, como por exemplo no caso dos raios-x e raios solares citados anteriormente. O inverso também é verdadeiro, quanto maior o comprimento da onda menor será o seu poder de penetração, como por exemplo no caso das ondas de rádio e televisão, que são comprovadamente inofensivas ao corpo humano. Para utilização do espectro eletromagnéticos na espectroscopia, é utilizado um equipamento denominado espectrofotômetro. Em resumo, o espectrofotômetro dissocia a luz branca nos demais comprimentos de onda que fazem parte do espectro visível de luz através de um monocromador. As luzes incidem então na cubeta contendo a amostra com o analito o qual desejamos quantificar a concentração. Após incidir sobre a amostra, uma parte da luz é absorvida pela mesma, fenômeno que damos o nome de absorbância, e outra parte transcende a amostra e é denominada transmitância, a qual é identificada por um detector. A diferença entre a quantidade de radiação emitida e a quantidade identificada pelo detector é a absorbância da amostra, ou seja, resultado que o espectrofotômetro nos fornece. O processo de funcionamento de um espectrofotômetro está ilustrado na imagem abaixo. Figura 2 - Processo de Funcionamento do Espectrofotômetro. É possível perceber, que a absorbância trata diretamente de uma quantidade de ondas eletromagnéticas absorvidas. Como consequência dessa absorção da energia eletromagnética, as moléculas da amostra na cubeta passam de um estado 7 fundamental para um estado de excitação. Isso ocorre devido migração de elétrons dos átomos que compõem a molécula para um orbital de nível energético superior, algo que é denominado salto quântico. Em outras palavras, após receber a energia eletromagnética em forma de luz, o elétron muda para uma camada de energia maior. Esse fenômeno pode ser identificado na figura abaixo. Figura 3 - Gráfico de Excitação das Moléculas. Os gráficos acima correlacionam a absorbância de uma determinada amostra com a energia eletromagnética incidida através da luz. É possível observar que a excitação dos elétrons após a incidência da luz ocorrepassando as moléculas do momento V=0 para o momento V=1 e assim sucessivamente. Entretanto, nem todos os átomos da molécula vão participar desse fenômeno de absorção energético, ou seja, nem todos os átomos terão seus elétrons excitados ao receberem a incidência da luz. As partes das moléculas que sofrerão excitação e, consequentemente, são responsáveis pela absorbância da amostra são denominadas cromóforos; que geralmente fazem parte de compostos orgânicos insaturados, ou seja, apresentam ligações duplas ou triplas entre carbonos (C=C). No presente experimento será realizada a leitura de uma amostra através de espectroscopia. Porém, antes de realizar na prática essa leitura, é necessário determinar o comprimento de onda mais adequado para análise da amostra. Para tanto, realizam-se diluições conhecidas a partir de um padrão conhecido do analito que desejamos analisar, para que se obtenha diferentes concentrações, conforme ilustrado na figura abaixo. 8 Figura 4 - Diluição para Curva de Varredura e Curva Padrão. Geralmente, utiliza-se a amostra com concentração mediana (como por exemplo o balão volumétrico 3 da figura acima) para leitura no espectrofotômetro em diferentes comprimentos de onda; o que nos permite construir um gráfico correlacionando cada comprimento de onda com a absorbância obtida através da leitura do espectrofotômetro. O gráfico obtido através desse processo é denominado curva de varredura, sendo que o ápice da curva representa a absorbância máxima obtida na amostra e, consequentemente, determina o comprimento de onda que deve ser utilizado para a análise. Um exemplo curva de varredura pode ser ilustrado na imagem abaixo. Figura 5 - Curva de Varredura no Espectro Ultravioleta. Vale a pena ressaltar que o gráfico apresentado na figura acima representa leituras obtidas em comprimentos de ondas equivalentes ao espectro ultravioleta, ou seja, os comprimentos de onda variaram entre 200nm e 400nm; é possível perceber 9 também, que o pico da curva indicou a absorbância máxima com um comprimento de onda de 240nm. Contudo, para o presente experimento, serão utilizados comprimentos de ondas no intervalo equivalente ao espectro visível da luz, assim sendo, a curva de varredura será realizada dentro de um intervalo de 400nm e 800nm. Por esta razão, será escolhido o balão volumétrico com a concentração mediana do analito. Outro procedimento que se faz necessário antes da leitura da amostra é a construção da curva de calibração, a qual consiste na leitura dos demais balões volumétricos de diluições contendo concentrações conhecidas do analito através de leitura espectrofotométrica com comprimento de onda de absorção máxima determinado na curva de varredura. Esse processo é realizado para determinar o padrão existente nos pontos equivalentes ao intervalo da reta apresentado na curva sigmoide determinada pela lei de Lambert-Beer, a qual é utilizada em procedimentos espectrofotométricos envolvendo absorbância de amostras. Em outras palavras, a curva de calibração apresenta uma característica semelhante a uma letra “S”, porém, na região central da curva, a mesma se comporta como uma reta e, nesse intervalo, é determinado como referência a calibração da espectrofotometria conforme demonstrado na figura abaixo, onde é possível perceber a relação entre a concentração e a absorbância. Figura 6 - Exemplo de Curva de Calibração. Outro fato importante que deve ser considerado no momento da elaboração dos balões volumétricos padrões é a determinação de um ponto denominado “branco”, 10 ou seja, um recipiente onde a concentração do analito seja igual a zero, portanto, o conteúdo é equivalente apenas a água, diluentes e os demais reagentes utilizados pala coloração da amostra. Dessa forma, para obtenção do resultado da absorbância do analito presente nos demais balões volumétricos, basta subtrair-se a absorbância obtida em cada balão volumétrico pela absorbância obtida no balão volumétrico “branco”, o que nos permite construir a curva de calibração com base na absorbância do analito em diferentes concentrações. Ressalta-se que para realização da leitura espectrofotométrica, é necessário utilizar-se a cubeta, que é um recipiente padrão em formato de cubo com duas faces translúcidas e com tamanho padronizado de 1 centímetro, de forma a garantir que o caminho óptico (comprimento que a onda eletromagnética atravessa na amostra) seja sempre o mesmo. Conforme mencionado anteriormente, no presente experimento prático, se faz necessário promover uma coloração dos padrões para que a amostra possa ser analisada de modo que o espectrofotômetro possa realizar a leitura. A coloração, nesse caso, é obtida através de uma reação de oxi-redução do paracetamol (analito da amostra deste experimento) e, para tanto, serão utilizados como reagentes, o ferrocianeto de potássio e sulfato férrico. Após a realização de todos esses procedimentos será possível realizar a leitura da amostra e obtenção da respectiva absorbância, tornando assim possível a determinação da concentração do analito na amostra. A partir dos dados obtido como resultado, é possível aplicar a lei de Lambert- Beer, em que a partir do caminho óptico, comprimento de onda, concentração e absorbância é possível determinarmos o coeficiente de absortividade molar, que também define a angulação do intervalo da reta da curva padrão, pois também é representado pelo coeficiente da variável “x”. Simplificadamente, a partir da curva padrão é possível obtermos a equação de reta e, consequentemente, a partir dela, determinarmos a concentração do analito na amostra. Além disso, é possível utilizarmos o coeficiente de absortividade molar também para validação das condições do equipamento utilizado no experimento no que tange fonte de energia, estado a luz emissora, dentre outras falhas pertinentes aos materiais utilizados. 11 2 DESENVOLVIMENTO 2.1 OBJETIVO GERAL Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de: - Determinar o teor de Paracetamol através da espectroscopia por reação de oxi- redução. - Treinar as técnicas de diluição quantitativa, construção de curva de calibração, e varredura espectral para determinação de comprimento de onda utilizando espectrofotometria no visível. 2.2 MATERIAIS REAGENTES - Agitador magnético e barra - Béqueres de 100 mL - Grau de porcelana com pistilo - Bastão de Vidro - Bureta de 25 mL com suporte e garra - Pipeta volumétrica de 25 mL - Proveta de 50 mL - Erlenmeyers de 125 mL - Pera de borracha - Balões Volumétricos de 50 mL - Pipeta volumétrica de 10 mL - Espectrofotômetro - Cubeta - ÁGUA PURIFICADA - Comprimido de Paracetamol 750mg - Álcool etílico P.A - Ferricianeto de potássio 1,0mM - Sulfato férrico 97% 1,0mM - Solução de Paracetamol PA 10µg/mL. 2.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 12 2.3.1. Preparo das Soluções Padrão de Leitura 2.3.1.1. Preparar soluções, de cinco concentrações, a partir da solução padrão de paracetamol 10µg/mL. 2.3.1.2. Para preparar das diluições completar uma bureta de 25mL com a solução padrão de paracetamol 10µg/mL. 2.3.1.3 Transferir para os balões volumétricos de 50mL numerados de 1 a 4 volumes de 25; 20; 15; 10 e adicionar volumes fixos de reagentes a 6 balões volumétricos de 10mL de solução de sulfato férrico 1,0mM e 10mL de solução de ferricianeto de potássio 1,0mM, no 5º balão completar até o menisco com solução padrão e no 6º balão completar até o menisco com água. 2.3.1.4 Reservar os balões pelo tempo de 30 minutos do início da reação. 2.3.1.5 Realizar as leituras fotométricas colocando as soluções em cubeta do espectrofotômetro 2.3.2 Preparo da Amostra de Comprimido de Paracetamol 2.3.2.1 Determinar o peso médio de 5 comprimidos de um mesmo lote da amostracomercial. 2.3.2.2 Macerar os comprimidos até a obtenção de um pó fino e homogêneo. 2.3.2.3. Pesar em um béquer de 250mL e dissolvido com água destilada uma porção equivalente a 5mg do fármaco. 2.3.2.4 Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 2,5mL com o auxílio de um funil analítico e completar o volume com água deionizada. 2.3.2.5 Foi retirada uma alíquota de 2,5mL e transferida para um balão volumétrico de 50mL com o auxílio de um funil analítico e papel filtro, em seguida adicionar 10mL de solução de sulfato férrico 1,0mM e 10mL de solução de ferrocianeto de potássio 1,0mM e completar com água deionizada. 2.3.2.6 Reservar os balões pelo tempo de 30 minutos do início da reação. 2.3.2.7 Realizar as leituras fotométricas colocando as soluções em cubeta do espectrofotômetro 13 2.3.3 Determinação do Comprimento de Onda por Varredura 2.3.3.1. Das soluções padrão separar a solução do balão volumétrico de número 3 e realizar a varredura dos comprimentos de ondas do espectrofotômetro iniciando no 400 nm e finalizando 800 nm com intervalos de 50 nm entre leituras. 2.3.3.2 Determinar o comprimento de onda com maior absorbância. 2.3.4 Construção da Curva de Calibração 2.3.4.1. Das soluções padrão determinar a absorbância de cada um dos 6 balões em cada cubeta, com o espectrofotômetro fixo no comprimento de onda com maior absorbância. 2.3.4.2. Anotar a absorbância de cada solução em cada balão. 2.3.5 Determinação da Absorbância da Amostra 2.3.5.1. Das solução da amostra determinar a absorbância da cubeta, com o espectrofotômetro fixo no comprimento de onda com maior absorbância. 2.3.5.2. Anotar a absorbância. 14 2.4 RESULTADOS 1) Escreva as Equações geral, iônica da reação. Resultados Obtidos: Preparo das Soluções Padrão Resultados Concentração final do padrão no balão 1 (µg/mL) 10x25/50 = 5ug/mL Concentração final do padrão no balão 2 (µg/mL) 10x20/50 = 4ug/mL Concentração final do padrão no balão 3 (µg/mL) 10x15/50 = 3ug/mL Concentração final do padrão no balão 4 (µg/mL) 10x10/50 = 2ug/mL Concentração final do padrão no balão 5 (µg/mL) 10x30/50 = 6ug/mL Concentração final do padrão no balão 6 (µg/mL) 10x0/50 = 0ug/mL Amostra de Comprimido de Paracetamol Peso Médio dos Comprimidos de Paracetamol (mg) 1,0932g Massa de Comprimido de Paracetamol (mg) 0,0763g Determinação do Comprimento de Onda por Varredura Absorbância do balão 3 em 400 nm 0,605 Absorbância do balão 3 em 450 nm 0,440 Absorbância do balão 3 em 500 nm 0,351 Absorbância do balão 3 em 550 nm 0,300 Absorbância do balão 3 em 600 nm 0,265 Absorbância do balão 3 em 650 nm 0,235 Absorbância do balão 3 em 700 nm 0,215 Absorbância do balão 3 em 750 nm 0,205 Absorbância do balão 3 em 800 nm 0,182 Construção da Curva de Calibração Absorbância do balão 1 0,506 - 0,581 = - 0,075 Absorbância do balão 2 0,548 - 0,581 = - 0,033 Absorbância do balão 3 0,574 - 0,581 = - 0,007 Absorbância do balão 4 0,518 - 0,581 = - 0,063 Absorbância do balão 5 0,555 - 0,581 = - 0,026 Absorbância do balão 6 0,581 - 0,581 = 0 Determinação da Absorbância da Amostra Absorbância do balão da Amostra 0,674 – 0,581 = 0,093 Equação da Reta Y = 0,0052x – 0,6161 R2 = 0,1409 Concentração de Paracetamol (mg) 104,9 mg/mL Tabela 1 - Resultados Obtidos: Preparo de Soluções; Peso e Massa do Paracetamol; Leituras Espectroscópicas e Determinação de Equação da Reta e Concentração do Analito. Conforme mencionado anteriormente, foi realizada a diluição do analito a partir de um padrão conhecido de paracetamol com concentração de 10ug/L. Após a 15 adição dos reagentes de coloração, foram obtidas seis amostras com tonalidades diferentes, conforme demonstrado na figura abaixo. Os balões volumétricos numerados em sua base de 1 a 6 e o balão contendo a amostra foi identificado com a letra “A”. As concentrações de cada balão volumétrico estão discriminadas na tabela 1 acima. Figura 7 - Soluções Padrão O balão volumétrico número 3 apresentou concentração mediana e, por isso, foi escolhido para realização da curva de varredura. As absorbâncias foram medidas com ondas de comprimento entre 400nm e 800nm em um intervalo de 50nm; as absorbâncias obtidas estão descritas na tabela 1 acima. Com base nessas informações, foi possível confeccionar a curva de varredura ilustrada na imagem abaixo. Figura 8 - Gráfico Curva de Varredura 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 300 400 500 600 700 800 900 Curva de Varredura - Comprimento de Onda (nm) x Absorbância 16 Como recomendado o procedimento, foi escolhido o comprimento de onda de 400nm para leitura dos demais balões, visto que nesse comprimento de onda, o espectrofotômetro apresentou a maior absorbância da curva de varredura conforme apresentado na figura acima. A leitura espectroscópica dos demais balões apresentou valores negativos que estão inseridos na tabela 1 acima. A partir desses dados, foi possível elaborarmos a curva de calibração correlacionando a concentração de cada balão com a sua respectiva absorbância, conforme demonstrado na imagem abaixo. Figura 9 - Gráfico Curva de Calibração A partir da curva de calibração é possível obtermos a equação da reta que correlaciona a concentração do analito e a absorbância, ou seja, com o auxílio dessa equação é possível, a partir da absorbância obtida, determinarmos a concentração do paracetamol. A leitura espectroscópica da amostra está descrita na tabela 1 acima. Assim sendo, os cálculos de determinação da concentração paracetamol na amostra estão descritos na imagem abaixo, em que “Y” representa a absorbância e “x” representa a concentração do analito. Figura 10 - Cálculo da Concentração de Paracetamol na Amostra y = -0,0052x - 0,0161 R² = 0,1409 -0,08 -0,07 -0,06 -0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Curva de Calibração - Concentração (ug/mL) x Absorbância 17 Considerando-se as diluições realizadas, para obtenção da concentração de paracetamol em miligramas, é necessário multiplicar-se pelo volume diluído e dividir- se pela alíquota. A ilustração e os cálculos desse processo estão demonstrados na figura abaixo Figura 11 - Ilustração da Diluição do Paracetamol Figura 12 - Cálculo de Determinação da Concentração de Paracetamol Contudo, vale a pena salientar que a curva de calibração, além de nos fornecer a equação da reta, nos fornece também o R2 e o coeficiente de absortividade molar (equivalente ao coeficiente de “x” na equação da reta); que por sua vez, são utilizado como parâmetros de confiabilidade quando comparados com a literatura e a farmacopeia brasileira. Analisando-se os resultados obtidos é possível perceber que o experimento não se encontra compatível com as referências da literatura e tampouco com a farmacopeia, visto que absorbâncias negativas como as obtidas não são comuns. Além disso a configuração da curva de calibração, evidentemente, não está similar a curva apresentada anteriormente na introdução deste experimento. Assim sendo, a análise de possíveis erros ocorridos durante o experimento foi feita em comparação com o procedimento descrito pela farmacopeia. O diagrama ilustrado na figura abaixo demonstra a análise de causa e efeito de possíveis problemas encontrados na execução do presente experimento. 18 Figura 13 - Diagrama de Causa e Efeito para Análise de Erro de Execução do Experimento Após análise do diagrama acima é possível identificarmos que a leitura espectroscópica foi realizada com um comprimento de onda diferente daquele determinado pela farmacopeia de 257nm. O experimento, por sua vez, foi realizado utilizando-se o comprimento de maior absorbância da curva de varredura considerando-se apenas o espectro visível da luz, ou seja, 400nm. Como consequência de uma leitura com comprimento de onda inadequadopara o analito em questão, os resultados da curva de calibração não se mostraram cofiáveis, pois o coeficiente de absortividade molar obtido foi de 0,0052. Em contrapartida, o mesmo coeficiente apresentado pela farmacopeia para o paracetamol é de 715. Além disso, a farmacopeia também referencia um limite de erro (representado pelo R2) de 95% a 105%, uma variação de +/-5% em relação a 1,0; ou seja, o valor absoluto esperado do R2 deve estar entre 0,95 e 1,05. Como apresentado no gráfico de calibração e na tabela 1, o R2 obtido no experimento foi de 0,1409, representando assim, uma variação bem superior a aceitável pela farmacopeia. Consequentemente, considerando-se que o coeficiente de absortividade molar não é fidedigno a literatura e a farmacopeia, é possível concluir que os cálculos que nos permitiram chegar a concentração do analito na amostra tampouco refletem a realidade e, portanto, nos faz chegar em uma concentração falsa do analito. 19 3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES Após a realização, análise e discussão deste experimento, é possível concluir que os métodos analíticos podem mostrar-se muito eficazes para identificação analítica quantitativa de amostras, podendo ser aplicadas nas mais diversas áreas da farmácia, diagnóstica, controle de qualidade, dentre outras. Além disso, nos permite concluir, também, a importância de consultar-se previamente a literatura e referencias da farmacopeia em relação aos ensaios do fármaco em questão de modo a evitar erros durante a análise quantitativa. REFERÊNCIAS ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT. NBR 10719: apresentação de relatórios técnico-científicos. Rio de Janeiro, 1989. 9 p. bsjoi.ufsc.br/files/2010/.../Modelo_de_relatorio_tecnico-cientifico.do Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica, Guanabara Koogan, Compri-Nardy M., Stella M.B., Oliveira C. (2009), 200 págs. Silverstein, R.M.; Bassler, G. Clayton; Morrill, Terence C. Identificação Espectrométrica de Compostos Orgânicos. Tradução: Ricardo Bicca de Alancastro, Ph.D. 5a ed. Ed. Guanabara & Koogan. RJ. Brasil. D.C. Harris, Análise Química Quantitativa, 6a Ed, Rio de Janeiro, LTC, 876 pp, 2005. D.A. Skoog, F.J. Holler e T.A. Nieman. Princípios de Análise Instrumental, 5a Ed, Bookman, Porto Alegre, 836 pp, 2002.
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