Relatório ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA 
 
 
 
 
 
 
 
PRÁTICA IV - ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 
 
 
 
 
 
GABRIELA ALVES VALENTIM 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
DEZEMBRO DE 2017 
 
1. INTRODUÇÃO 
A eletroforese consiste na migração de partículas livres carregadas em 
um meio sob a ação de uma diferença de potencial (SILVA-JUNIOR, 2001). Vários 
grupos como aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos possuem grupos ionizáveis 
e que, portanto, existem em soluções, em qualquer pH, como espécies carregadas 
eletricamente, positiva ou negativamente (WILSON & WALKER, 2010). 
Sob a influência de um campo elétrico essas partículas migram, de 
acordo com a lei de Coulomb, para o ânodo ou cátodo do sistema, dependendo da 
sua carga líquida. Assim, componentes de carga líquida negativa migram para o 
polo positivo e componentes de carga negativa migram para o polo positivo. A 
eletroforese é capaz de separar também partículas de mesma carga, mas com 
quantidades diferentes dessas cargas, o que reflete no tamanho molecular das 
moléculas (HENEIDE, 2010; WILSON & WALKER, 2010). 
Diversos fatores condicionam a migração e velocidade de corrida das 
moléculas no gel, como, por exemplo, o pH do meio, pI ou pK da molécula, 
temperatura e condições elétricas. As proteínas, por exemplo, são anfíons e sua 
carga elétrica depende do pH do meio. Assim, se o pH do sistema é superior ao pI 
da proteína, ela tem carga negativa e migra para o polo positivo. Se o pH do sistema 
é inferior ao pI da proteína ela tem carga positiva e migra para o polo negativo. Se o 
pH do sistema é igual ao pI da proteína, a carga efetiva é zero e a proteína fica em 
estado estacionário (HENEIDE, 2010). A manipulação do pH já é capaz de separar 
proteínas, o que torna a eletroforese um método simples e bastante útil. No entanto, 
o uso de substâncias anfipáticas que podem atribuir carga elétrica específica a 
essas moléculas, a migração vai ser condicionada pela natureza da carga da 
substância adicionada ao sistema (WILSON & WALKER, 2010). 
A capacidade de separação da eletroforese é determinada pela 
porosidade da fase fixa utilizada na corrida, sendo comum a utilização de géis, 
geralmente produtos de polimerização entre monômeros. Dois tipos comuns de gel 
utilizados em analises eletroforéticas são os géis de agarose e de poliacrilamida. A 
agarose é um polissacarídeo constituído por repetições de unidades de agarobiose. 
A propriedade gelificante é atribuída a formação de pontes de hidrogênio entre 
cadeias de agarose. O gel de poliacrilamida é formado na polimerização de 
monômero de acrilamida (WILSON & WALKER, 2010). Apesar dos dois géis 
poderem ser utilizados para separação de várias moléculas, se sua concentração for 
ajustada, comumente os géis de agarose são utilizados na análise de ácidos 
nucléicos por conterem uma malha mais espessa. A separação de proteínas 
costuma ser realizada no gel de poliacrilamida, que possui uma malha com poros de 
tamanho menor. 
A eletroforese é amplamente utilizada na pesquisa e na indústria pois 
permite a análise de enzimas, proteínas e ácidos nucleicos, auxilia na identificação 
de espécies, identifica linhagens e existência de parentesco, está presente em 
estudos de resistência à doenças e relação de patógenos e hospedeiros, entre 
outras aplicações. Dessa forma ela é uma técnica utilizada em todo o mundo e 
essencial para o desenvolvimento de estudos na área de biologia molecular. 
 
2. OBJETIVOS 
 Observar a migração de proteínas a partir da criação de um campo elétrico; 
 Calcular a massa molecular de proteínas por PAGE-SDS, após corrida 
eletroforética. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
No dia 16 de setembro de 2017, a prática aqui relatada foi realizada no 
Laboratório N1, localizado no bloco 907, Departamento de Bioquímica e Biologia 
Molecular, na Universidade Federal do Ceará (UFC), durante as aulas da disciplina 
de Biofísica, lecionadas pelo Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira. 
Os materiais utilizados na prática aqui relatada foram extrato de sementes 
de Luetzelburgia auriculata, placas de vidro, espaçadores e moldes de plástico, 
acrilamida, bis-acrilamida (N,N-Metileno bis-acrilamida), TRIS (Tris hidroximetil 
aminometano), ácido clorídrico, SDS 10% (dodecil sulfato de sódio), persulfato de 
amônio 10%, TEMED 99% (N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamino), Tris-Glicina (pH 8,6), 
tampão Tris-HCl 1M (pH 6,8), DTT (ditiotreitol), glicerol 12%, EDTA (ácido 
etilenodiamino tetra-acético), EGTA, solução corante de Coomassie Blue R250, 
nitrato de prata, metanol, ácido acético, álcool etílico, cubas verticais para 
eletroforese, fonte de corrente contínua, água destilada, detergente, álcool 70% e 
tubos Eppendorf. 
As placas foram previamente preparadas, sendo lavadas com detergente 
e água corrente, e secas com álcool 70%. Espaçadores de plástico de 1cm de 
espessura foram dispostos entre as placas de vidro, de modo a receber a mistura 
líquida de poliacrilamida. Foi colocada água nas placas para verificar se haviam 
vazamentos no sistema. 
Para preparação do gel de separação foram preparadas duas soluções. A 
primeira solução (A) continha 30g de acrilamida e 0,8g de bis-acrilamida em 100mL 
de água. A segunda solução (B) continha 36,3g de TRIS e 48mL de ácido clorídrico 
(HCl) 1M em 100mL de água pH 8,8. O gel de separação com concentração final de 
12,5% e volume total de 8mL foi preparado com 2545µL de água, 3333µL da 
solução A, 2000µL da solução B, 80µL de SDS 10%, 36µL de persulfato de amônio 
10% e 6µL de TEMED 99%. O gel de separação foi então aplicado entre as placas 
de vidro e aguardou-se a polimerização. 
Para preparação do gel de empilhamento foi preparada mais uma solução 
(C) que continha 6g de TRIS e 48mL de HCl 1N em 40ml de água pH 6,8. O gel de 
empilhamento com concentração final de 3,5% e volume final de 3ml foi preparado 
com 2216,5µL, 350µL da solução A, 375µL da solução C, 30µL de SDS 10%, 22,5µL 
de persulfato de amônio 10% e 9µL de TEMED 99%. O gel de empilhamento então 
foi aplicado sobre o gel de separação e um molde de plástico em forma de pente 
com 10 dentes foi introduzido para formação dos poços para aplicação das 
amostras. Por fim, aguardou-se a polimerização desse gel. 
O tampão de corrida foi preparado com Tris-Glicina, pH 8,6, diluída em 
uma proporção de 1:10 com H2O ultrapura. Após a preparação dos géis de 
separação e de empilhamento, as placas foram fixadas em cubas verticais e o 
tampão de corrida foi derramado sobre os géis e colocado também nos reservatórios 
das cubas. 
O tampão de amostra foi preparado 4x concentrado com tampão Tris-HCl 
1M pH 6,8, contendo SDS (10%), 100Mm DTT, glicerol 12%, 50mM EDTA e 50mM 
EGTA. Foi inserido no tampão de amostra também o corante azul de bromofenol, 
para que a corrida das proteínas nos géis pudesse ser visualizada. As amostras 
então foram tratadas com o tampão de amostra, aquecidas por 5 minutos e 
centrifugadas por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo 
Eppendorf e aplicado nos poços do gel de empilhamento. 
Todas as amostras utilizadas na prática foram oriundas da farinha de 
semestres de Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke, conhecida popularmente 
como pau-mocó, da família Fabaceae. A descrição das amostras pode ser 
encontrada na tabela 01. 
Tabela 1 - Caracterização das amostras preparadas a partir da farinha de sementes de Luetzelburgia auriculata. 
Amostras Caracterização das amostras 
1 Extrato bruto de sementes de Luetzelburgia auriculata 
2 
Fraçãoproteica retida a partir de cromatografia de afinidade (anidrotripsina-
sepharose 4B) 
3 Fração proteica exsudada de sementes de Luetzelburgia auriculata 
 
Após a aplicação das amostras no gel de empilhamento a cuba foi 
conectada a uma fonte de corrente contínua e a corrida foi realizada utilizando uma 
corrente de 20mA e diferença de potencial de 180V. 
Após a corrida, o gel foi retirado do molde de vidro e imerso em solução 
fixadora, preparada a partir metanol, ácido acético e água em uma proporção de 
400:70:530, por 40 minutos. Em seguida, o gel foi colocado em uma solução corante 
de Coomassie Blue R250 por um período entre 3 e 4 horas. Por fim, foi deixado em 
solução descorante preparada com álcool etílico, ácido acético e água em uma 
proporção de 200:50:250, até que as bandas fossem evidenciadas. Adicionalmente 
o gel foi revelado utilizando nitrato de prata. 
 
 
4. RESULTADOS 
Após a coloração com Coomassie Blue R250 e revelação do gel por 
nitrato de prata, o gel foi escaneado. Os resultados de cada tratamento podem ser 
observados na figura 01. 
Na amostra 01 foi possível observar a presença de três bandas de 
proteínas entre 97 e 66kDa nos dois tratamentos. No entanto, as bandas abaixo de 
45kDa apareceram de forma destacada apenas após o gel ser revelado com nitrato 
de prata. A amostra 02 não apresentou a formação de bandas em nenhum dos 
tratamentos. Na amostra 03 foram evidenciadas diversas bandas indistintas no gel 
somente depois de tratado com nitrato de prata, enquanto após a coloração com 
Coomassie Blue R250 nenhuma banda foi destacada. 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Eletroforese SDS-PAGE de amostras preparadas a partir da farinha de 
sementes de Luetzelburgia auriculata: (M) Marcador molecular; (1) Extrato bruto de 
sementes de Luetzelburgia auriculata; (2) Fração proteica retida a partir de cromatografia 
de afinidade; (3) Fração proteica exsudada de sementes de Luetzelburgia auriculata, 
corada com Coomassie Blue R250 à esquerda e reveladas com nitrato de prata a direita. 
5. DISCUSSÃO 
Os géis de poliacrilamida são formados a partir na polimerização de 
acrilamida na presença de pequenas quantidades de bis-acrilamida. A bis-acrilamida 
é formada por duas moléculas de acrilamida ligadas por um grupo metileno e é o 
agente que confere a reticulação ao gel, o que permite a corrida das proteínas. No 
entanto, essa a ligação entre os dois reagentes leva bastante tempo. Essa 
polimerização é uma catálise de radicais livres, e é iniciada pela adição do persulfato 
de amônio e de TEMED. Este último é responsável pela catalisação da 
decomposição do íon persulfato, acelerando assim a polimerização do gel (WILSON 
& WALKER, 2010). 
O tamanho do poro do gel de poliacrilamida é definido pela porcentagem 
de acrilamida presente. Assim, variando as concentrações, podemos alterar a 
densidade da malha. Os géis de porcentagem de acrilamida baixa têm tamanhos de 
poros grandes, enquanto os géis de porcentagem alta têm poros menores e 
introduzem um efeito de peneiramento, o que contribui para a separação das 
proteínas pelo seu tamanho molecular. Após a polimerização do gel de separação, 
que possui um tamanho de poro adequado para que as proteínas sejam capazes de 
correr, mas onde ainda há o efeito de peneiramento, um gel de empilhamento é 
aplicado. O gel de empilhamento tem um tamanho de poro muito grande e permite 
que as proteínas se movam de forma livre e se concentrem ou se empilhem após o 
efeito do campo elétrico. O objetivo do carregamento das proteínas no gel de 
empilhamento é concentrar a amostra em um uma faixa antes desta entrar no gel de 
separação (WILSON & WALKER, 2010). 
A concentração da amostra no gel de empilhamento é conseguida através 
de diferenças na força iônica e pH entre o tampão do gel empilhamento e do gel de 
separação, fenômeno conhecido como isotacoforese. O gel de empilhamento é 
preparado com um tampão diferente de modo que seu pH é mais baixo que o gel de 
separação, além de também possui uma força iônica mais baixa. Esta é uma técnica 
de separação eletroforética onde as cadeias migram de acordo com suas 
mobilidades eletroforéticas, através de um sistema descontínuo de eletrólitos (SILVA 
et al., 2007). O primeiro eletrólito apresenta maior mobilidade eletroforética que 
todos os componentes da amostra, sendo chamado de eletrólito líder. O segundo 
eletrólito, apresenta menor mobilidade comparado a todos os componentes da 
amostra, e é conhecido como eletrólito terminador. Quando o potencial elétrico é 
aplicado as zonas dos analitos migram em ordem decrescente de mobilidade, mas 
em uma mesma velocidade constante. Assim é possível separar as proteínas no gel 
de acordo com seu tamanho (SPUDEIT et al., 2012). 
Supondo que estivéssemos analisando uma proteína de massa molecular 
de 50kDa, o gel de poliacrilamida mais apropriado para a visualização da proteína 
possuiria uma malha de 12,5%, já que uma malha com tamanhos de poros menores 
poderia impedir a corrida da proteína. Dessa forma ela não correria bem pelo gel, 
ficando agrupada na parte superior do gel ou mesmo poderia ficar retida no gel de 
empilhamento e não entrar no gel de separação. Assim, não seria possível realizar a 
análise das massas moleculares. 
A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS é geralmente 
utilizada na presença de proteínas formadas por mais de uma cadeia polipeptídica. 
Quando desejamos que a separação das cadeias proteicas ocorra unicamente 
influenciada por sua massa molecular, as cargas nativas dessa proteína devem ser 
eliminadas. Para isso, a proteína é misturada com SDS, um tipo de detergente 
anfipático cuja função é desnaturar, converter em uma estrutura linear e fornecer a 
ela uma densidade de carga uniforme. O SDS possui uma carga negativa e uma 
cauda hidrofóbica que interage com as cadeias polipeptídicas, tornando-as 
carregadas negativamente. Em alguns casos, as proteínas são fervidas na presença 
de um agente redutor, como o DTT ou o β-mercaptoetanol, que rompes as pontes de 
dissulfeto, auxiliando na mudança estrutural de polipeptídeos (ROCHA et al., 2005). 
Dessa forma, em uma corrida eletroforética uma amostra tratada com SDS e β-
mercaptoetanol ou DTT possuirá um número maior de bandas proteicas que uma 
amostra tratada apenas com SDS, pois o β-mercaptoetanol quebras as pontes 
dissulfeto e divide as cadeias em suas subunidades, podendo ser igual ou maior a 
duas, enquanto o SDS apenas confere carga negativa e desnatura a molécula, sem 
romper as ligações das cadeias, dividindo-as em subunidades. 
Como a técnica utilizada na prática foi o SDS-PAGE, as proteínas 
analisadas adquiriram carga negativa em função do SDS. Assim, sobre a ação do 
potencial elétrico elas migraram do ânodo para o cátodo por atração eletrostática. 
Após a realização do SDS-PAGE é necessário realizar a detecção e 
estimativa das proteínas no gel. A detecção é realizada através da produção de 
manchas nas bandas de proteínas. Dois corantes comumente utilizados são o 
Coomassie Blue R250 e o Nitrato de Prata. A mancha de Coomassie é bastante 
sensível, sendo utilizada para detectar faixas maiores que 100ng de proteína. Este 
corante possui uma grande solubilidade em géis de agarose e poliacrilamida, 
capacidade de distinção entre proteínas e aminoácidos e fácil manuseio. Apesar da 
grande sensibilidade, alguns trabalhos requerem uma sensibilidade ainda mais 
apurada, como a fornecida pelo nitrato de prata. As manchas de prata podem ser 
produzidas logo após a eletroforese ou após a coloração pelo Coomassie Blue. A 
mancha de prato é cerca de 100 vezes mais sensível que o Coomassie Blue, 
detectando proteína até quantidadede 1ng. No entanto, esses métodos também 
possuem suas desvantagens. O Coomassie Blue possui uma reprodutibilidade muito 
baixa, mas que ainda é maior que a do nitrato de prata, que possui uma 
reprodutibilidade extremamente problemática. Além disso, o nitrato de prata 
emprega em sua metodologia alguns compostos que podem trazer riscos à saúde e 
o manuseio exige cuidados (PATTON, 2002; WILSON & WALKER, 2010). 
A massa molecular de uma proteína pode ser determinada por meio da 
eletroforese, comparando-se a distância que o peptídeo estudado percorreu a partir 
do poço de aplicação no gel de empilhamento com a distância percorrida pelo 
marcador com massas moleculares conhecidas no mesmo gel. Podemos traçar um 
gráfico da distância percorrida no gel contra o logaritmo da massa molecular para 
cada uma das proteínas padrão do marcador. Assim, uma curva de calibração pode 
ser construída. A distância percorrida pela proteína de massa desconhecida é 
medida e determinada a partir da curva de calibração (WILSON & WALKER, 2010). 
 
6. CONCLUSÃO 
A técnica de eletroforese SDS-PAGE permitiu a observação da migração 
de proteínas a partir da criação de um campo elétrico no gel de poliacrilamida e 
mostrou-se uma técnica eficiente para a separação de proteínas da amostra extraída 
de sementes de Luetzelburgia auriculata. A partir do experimento foi possível 
demonstrar que a eletroforese é uma técnica eficiente para a separação de 
proteínas e inferir a massa molecular de proteínas por meio da mesma. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
HENEIDE, I. F. Biofísica básica. São Paulo: Editora Atheneu, 2010. 
PATTON, W. F. Detection Technologies in Proteome Analysis. Journal of 
Chromatography B, n. 771, p. 03-31, 2002. 
ROCHA, T. L., COSTA, P. H. A., MAGALHÃES, J. C. C., EVARISTO, R. G. S., 
VASCONCELOS, E. A. R., COUTINHO, M. V., PAES, N. S., SILVA, M. C. M., 
GROSSI-DE-SÁ, M. F. Comunicado Técnico. Eletroforese Bidimensional e 
Análise de Proteomas. Brasília: Embrapa, 2005. 
SILVA, J. A. F., COLTRO, W. K. T., CARRILHO, E., TAVARES, M. F. M. 
Terminologia para as Técnicas Analíticas de Eletromigração em Capilares. Química 
Nova, n. 30, p. 740-744, 2007. 
SILVA-JÚNIOR, J. G. Eletroforese de Proteína: guia teórico e prático. Rio de 
Janeiro: Interciência, 2001. 
SPUTEID, D. A., DOLZAN, M. D., MICKE, G. A. Conceitos Básicos em Eletroforese 
Capilar. Scientia Chromatographica, n. 4, p. 287-297, 2012. 
WILSON, K., WALKER, J. Principies and Techniques of Biochemistry and 
Molecular Biology. 7. Ed. Cambridge University Press, 2010.