Cromatografia de Aminoácidos em papel

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INTRODUÇÃO
Os aminoácidos apresentam a menor unidade constituinte de uma proteína. Estruturalmente falando, são formados por um agrupamento carboxila (COOH), uma amina (NH2) e mais um radical.
A cromatografia e um processo físico-químico de separação de componentes baseada mas diferenças de afinidade para serem retidos ou não na fase estacionária (fase fixa). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de soluções. A cromatografia e usada para identificar compostos atendo comparações com padrões e comportamentos já existentes na literatura, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e também para a seroarão de compostos de uma mistura. A separação depender da interação dos componentes com a fase móvel e com a fase estacionária.
 
Os componentes da mistura líquida são colocados em pequenos pontos na mesma altura no papel filtro. A parte em que são colocados os compostos é imergida no solvente líquido, que constitui a fase móvel. O solvente que constitui a fase móvel vai se deslocando de uma extremidade à outra do papel de cromatografia, arrastando os diferentes componentes da mistura e os separa pela diferença de velocidades.
A análise qualitativa é feita por meio do fator de retenção (Rf) com o auxílio da expressão: Rf = distância percorrida pela susbtância / distância do solvente. 
A coincidência dos valores de Rf de uma mancha de uma amostra desconhecida fornece uma evidência de identidade com a amostra-padrão.
Frequentemente inicia-se os teste de separação empregando um solvente apolar, e gradualmente aumenta-se a polaridade. Pode-se usar mistura de solventes, e ir-se alterando a proporção de um solvente polar em um apolar, contanto que sejam miscíveis entre si.
A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar e específicos efeitos da afinidade e solubilidade. As substâncias a serem separadas costumam interagir com a celulose do papel, e por razão das suas diferentes constituições, uns migram mais e outros menos.
Este método possui, como ponto negativo, o fato de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância por vez. Por isso e um método qualitativo e não quantitativo.
Em relação a fase móvel, são três tipos de cromatografia:
 - Cromatografia gasosa: esse procedimento é baseado na análise química por separação de compostos químicos e uma amostra complexa. A amostra é transportada por uma corrente de gás através de uma coluna. Por ser simples, sensível e efetiva para separar os componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais importantes em química. É muito usada para análises qualitativas e quantitativas de espécies químicas e para determinar constantes termoquímicas tais como calotas de solução e vaporização. Sendo o nitrogênio, argônio, hidrogênio e dióxido de carbono os mais comuns a serem utilizados.
- Cromatografia líquida: a fase móvel e um líquido de baixa viscosidade. Neste procedimento existem diferentes detectores que devem ser selecionados de acordo com a mistura a ser separada. 
- Cromatografia supercrítica: neste procedimento a fase móvel é um fluido sendo o dióxido de carbono, que pode ou não ser modificado com substâncias tendentes a aumentar a sua polaridade. A cromatografia supercrítica é utilizada para ações específicas apresentando vantagens sobre as cromatografias líquida e gasosa, por tornar possível, por exemplo a separação de substâncias não voláteis em coluna aberta, visto que o fluido supercrítico reúne a vantagem de alta difusibilidade do gás e do alto poder de silváramos (fenômeno que ocorre quando um composto irônico ou polar dissolve uma substância polar, sem formar uma nova substância) de um líquido.
 Os principais mecanismos de separação utilizados em cromatografia são:
- Sorcao e dessorção: se baseia nas interações eletrostáticas, dipolares ou pontes de hidrogênio, que se fazem presentes nos grupos ativos que estão na fase estacionária sólida. Em processos de cromatografia, esse mecanismo é sempre reversível (a dessorção do soluto implica na volta deste na fase móvel).
- Partição: é baseado nas diferentes solubilidades dos componentes de amostra na fase estacionária. Neste método, a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido e inerte ou nas paredes de um tubo.
- Troca iônica: a fase móvel normalmente é uma solução jônica com poder tamponante. A fase estacionária é formada de uma matriz onde são colocados grupos funcionais ionizáveis (aniônicos ou catiônico).
- Exclusão: é basicamente um processo mecânico. A fase estacionária e uma matriz de composição inerte, com textura (superfície e distribuição de tamanhos de poros) controlada. Os componentes presentes na fase móvel podem ser separados porque os menores facilmente penetráveis em todos os poros da fase estacionária, equilibrando-se com a fase móvel que também entra nos poros, enquanto as maiores são excluídas, acompanhando a fase móvel que fica fora dos poros. As moléculas com tamanhos intermediários entre esses dois extremos migram com velocidades variáveis, sendo que possuem penetração seletiva nos poros, não entrando em todos, apenas em alguns.
- Afinidade: fazem uso de grupos funcionais, que possuem especificidade biológica, que estão ligados quimicamente á matriz estacionária. Esses grupos funcionais retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando passar todas as outras.
Esta técnica pode ser usada por ser de fácil entendimento e fácil execução e pode ser aplicada em escolas, usando material de baixo custo relativo. 
OBJETIVOS
Identificar aminoácidos de um cromatograma e calcular seu Rf.
PROCEDIMENTO
O papel whatman foi fornecido com o nome dos aminoácidos já grafados, portanto o próximo passo foi tocar com a ponta do tubo capilar, contendo a solução dos aminoácidos o meio da linha de ponto de origem, deixando escoar um pouco da solução, mas evitando que se espalhe por uma área de raio muito grande. Após colocar as amostras no papel, introduzimos o na cuba cromatográfica, atentando-se que o solvente não deve alcançar o local de aplicação das amostras e o papel não deve encostar-se à parede da cuba. 
A cuba cromatográfica foi tampada e esperou-se o tempo suficiente para frente do solvente alcançar mais ou menos 1 cm da extremidade superior do papel. Posterior a este fato, retirou-se o papel de dentro da cuba e marcou imediatamente o ponto atingido pela frente do solvente. O papel foi levado a estufa a 90-100°C para secar. Em seguida, foi levado a capela e lá nele foi pulverizado um revelador, a ninidrina e ele novamente foi para a estufa para secar e revelar as manchas. 
Os Rfs de cada amostra foram calculados.
Figura 1:Exemplo de cromatografia e calculo de Rf..A fórmula do RF é:A\B
DISCUSSÃO E RESULTADOS
A cromatografia permite a separação dos aminoácidos através do cálculo da distância de locomoção devido à reação de polaridade entre os aminoácidos e o solvente. De acordo com a ordem crescente de polaridade dos componentes do solvente segue-se: n-butanol, ácido fórmico e água. O soluto (com aminoácido) move-se na direção do fluxo do solvente a uma velocidade que dependerá de sua atração, seja pela fase aquosa estacionária (Polar) ou pela fase solvente móvel (Apolar). A atração do soluto pela fase orgânica (Apolar) implica uma velocidade maior de migração, em outras palavras, uma maior distância percorrida. Após a revelação do cromatograma, medimos a distância percorrida por cada aminoácido e o RF será o resultado da divisão entre o espaço percorrido pelo aminoácido e o espaço do solvente, na pratica não conseguimos observar a coloração obtida pelo revelador, mas em um estado normal do mesmo, após ser pulverizado na capela o mesmo marca na cor purpura os aminoácidos. Segue a reação:
	Figura 2: Reação de coloração dos aminoácidos. (Fonte Desconhecida)
	
Quando os aminoácidos são aquecidos emsolução contendo excesso de ninidrina, todos aqueles que têm grupamento amino livre produzem um composto púrpura, conhecido como Púrpura de Rüehmann. Essa reação também pode ser utilizada na detecção de peptídeos e proteínas que apresentem essa característica.Em condições apropriadas, a intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de espécies (aminoácidos, peptídeos ou proteínas) presentes. No experimento foram propostas duas amostras afim de que se descobrisse de que se tratava as mesmas e pela distancia percorrida descobriu-se que a amostra 1 se tratava de uma mistura de alanina e isoleucina e amostra 2 de aspartato e isoleucina. Os Rf foram calculados e obteve-se:
	Aminoácidos Padrão (Rf)
	Isoleucina 0,225
	Alanina 0,049
	Aspartato 0,049
Figura 3: Tabela com os valores de Rfs encontrados dos aminoácidos.
Figura 4: Estrutura dos aminoácidos envolvidos na cromatografia. (Fonte Desconhecida)
O aspartato possui um grupo R carregado com carga negativa, polar. O grupo R desses aminoácidos é mais solúvel em água, ou seja, mais hidrofílicos, quando comparados com os aminoácidos que possuem grupo Rnão-polar. A alanina é apolar(hidrofóbica e sem carga) Quando o papel de filtro com as amostras entra em contato com a solução da fase móvel, o ácido fórmico pertencente a essa solução irá protonar todos os aminoácidos .Avaliando a carga assumida pelos aminoácidos sabemos que o aspartato e a alanina, que possuem maior carga liquida positiva, irão interagir mais com a água contida no papel de filtro,fase estacionária, fazendo com que ambas tenham um deslocamento menor em comparação com a isoleucina.Ao observar o papel revelado percebemos também que embora a carga líquida positiva seja a mesma, a alanina tem um deslocamento maior em comparação a asparagina , pois a relação carga/massa da alanina é maior. O aspartato possui um grupo R não-carregado, polar, e a alanina possui um grupo R carregado positivamente, apolar, ambos em pH 7,0. O grupo R desses aminoácidos é mais solúvel em água, ou seja, mais hidrofílicos, quando comparados com os aminoácidos que possuem grupo R não-polar. Quando o papel de filtro com as amostras entra em contato com a solução da fase móvel, o ácido fórmico pertencente a essa solução irá protonar todos os aminoácidos Avaliando a carga assumida pelos aminoácidos sabemos que a isoleucina que é apolar , que possuem maior carga liquida positiva, irão interagir menos com a água contida no papel de filtro,fase estacionária, fazendo com que ambas tenham um deslocamento maior em comparação com os outros aminoácidos.Ao observar o papel revelado percebemos também que as duas amostras propostas eram misturas dos aminoácidos que participaram da cromatografia,sendo assim pelo deslocamento concluiu-se que:
Amostra 1) Alanina+Isoleucina
Amostra 2) Aspartato+Isoleucina	
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://clickeducacao.com.br/bcoresp/bcoresp_mostra/0,6674,POR-935-5077,00.html
https://quimicanet.files.wordpress.com/2010/09/cromatografia-de-aminoacidos-em-papel.pdf
http://www.explicatorium.com/CFQ7-Cromatografia.php
http://m.brasilescola.com/educacao/experimento-cromatografia-papel.htm
http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL.htm
http://hiq.linde-gas.com.br/international/web/lg/br/like35lgspgbr.nsf/docbyalias/anal_gaschrom
http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/cl.htm
http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/sfc.htm
http://www.infoescola.com/quimica/cromatografia/
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAAwEAE/cromatografia
http://www.univates.br/revistas/index.php/destaques/article/viewFile/612/410
http://www.setor1.com.br/analises/cromatografia/in_tro.htm
http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL.htm
http://www.setor1.com.br/analises/cromatografia/cro_del.htm
http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/COLUNA.htm
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradas.htm
http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_content&task=view&id=103&Itemid=451
 
EXERCÍCIOS
1) Defina cromatografia e dê um exemplo de separação.
Cromatografia é uma técnica experimental utilizada para separar misturas de substâncias numa solução. Recebe este nome por ter sido inicialmente utilizada para separar pigmentos vegetais coloridos (daí o prefixo "croma"). O princípio da cromatografia é fazer com que a solução contendo a mistura de substâncias percorra um material, geralmente poroso e com propriedades absorventes. A solução é denominada eluente, ou fase móvel, e o material absorvente, fase estacionária. A separação ocorre quando os componentes da mistura têm diferentes afinidades químicas pela fase estacionária. Assim, durante o procedimento cromatográfico, à medida que o eluente avança sobre a fase estacionária, os componentes da mistura com maior afinidade química pela fase estacionária levam mais tempo para atravessá-la que os componentes de menor afinidade, ocorrendo então separação dos componentes. O princípio da cromatografia é utilizado, em formas mais aperfeiçoadas, nas indústrias farmacêutica e química para identificar uma série de substâncias e misturas, sendo atualmente considerado uma das técnicas mais importantes de análise química. 
Um exemplo de separação cromatográfica é a de partição, que, se dá pela diferença de solubilidade das substâncias que devem ser líquidas, e sua separação se dá com o auxilio de filtros de papel ou em colunas como suporte.
2) Faça o esquema de um cromatograma dos aminoácidos aspartato e leucina usando o sistema de solvente empregado na aula prática. Para isso, pesquise as estruturas e os valores de pK (consulte a tabela 6.2 e o item 6.9). Justifique seus valores de Rf.
O sistema usado na prática foi:
Fase móvel: mistura de solventes – butanol, água e ácido acético. Fase menos polar, líquida.
Fase estacionária: celulose + água. Fase polar, “líquida”.
A cromatografia de papel com os aminoácidos Aspartato e Leucina, tem o seguinte cromatograma:
O aspartato, ou ácido aspártico, é um resíduo de aminoácido receptor de prótons, de grupo R carregado negativamente, e participa de ligações eletroestáticas. Diante dessas características, e de que o pK do seu grupo COO- é menor do que o do grupo COO- da Leucina, ele é polar. 
Sendo assim, como a fase estacionária também é polar, ele vai interagir com ela. Vai se deslocar menos sobre o papel e assim vai ter o menor valor de Rf, de acordo com a expressão abaixo:
Rf : d2 / d1 Rf e d2 são diretamente proporcionais, então se d2 é menor, Rf também é menor.
Estrutura do Aspartato e seus respectivos valores de Pk.
Já a Leucina, e do grupo dos não-polares e alifáticos, e sua cadeia lateral estabiliza as estruturas proteicas por meio de interações hidrofóbicas (interação de compostos apolares). Sendo assim, e ainda o pK do seu grupo COO- ser maior que o do grupo COO- do Aspartato, ela é apolar e reage então com a fase móvel.
Ela vai se deslocar mais sobre o papel e vai ter o maior valor de Rf, de acordo com o que já foi dito que o valor de Rf e de D2 são diretamente proporcionais.
Estrutura da Leucina e seus respectivos valores de Pk.
3)Qual é a função da ninidrina? Que grupo do aminoácido reage com a ninidrina?Quantas moléculas de ninidrina reagem com um alfa-aminoacido.
Produto químico utilizado para a detecção de aminas primárias, particularmente de aminoácidos. Ao reagir com essas aminas livres, uma cor roxa, conhecida como púrpura se forma. O grupo de aminoácido reagente com a ninidrina é o grupo amino livre sendo o numero de moléculas reagentes com um alfa aminoácido igual a dois.