Relatório 2 - Cromatografia Em Coluna - Extração e Fracionamento De Pigmentos Vegetais

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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA – ICEx – UFMG
QUI031 – Química Orgânica Experimental
CURSO PRÁTICO REMOTO – 1º SEMESTRE DE 2020
Título da Prática: Cromatografia Em Coluna (CC) - Extração e Fracionamento De Pigmentos Vegetais
RELATÓRIO
1) Objetivos
· Introduzir a técnica da cromatografia de adsorção em coluna;
· Extrair pigmentos vegetais e fracioná-los por meio de CC.
2) Técnicas de laboratório utilizadas.
Cromatografia
A Cromatografia é uma técnica de separação baseada na migração diferencial dos componentes de uma mistura. A coluna cromatográfica é composta por uma fase estacionária, de grande área superficial e fixa na coluna, e uma fase móvel, um fluido que se move pela coluna “através” da fase estacionária. As separações ocorrem principalmente devido a diferença de interação entre estas fases e os analitos, embora existam outros fatores que possam influenciar a separação, não sendo, no entanto, determinantes.
Para classificar os tipos de cromatografia utiliza-se vários critérios, como por exemplo, a técnica empregada, o mecanismo de separação envolvido, ou o tipo de fase utilizada. A técnica geral é definida pela forma física do sistema, podendo a fase estacionária ser disposta em uma superfície planar (cromatografia planar) ou colocada em um tubo cilíndrico (cromatografia em coluna). Considerando o estado físico da fase móvel, têm-se a cromatografia gasosa, a líquida e a supercrítica. Quanto ao estado físico da fase estacionária, este pode ser sólido ou líquido. O líquido pode estar imobilizado sobre o sólido ou apenas espalhado nele. A imobilização pode envolver somente ligações químicas entre moléculas do próprio líquido, ou ainda, ligações entre o líquido e o suporte. Quando a fase estacionária está imobilizada ao suporte, dá-se o nome de cromatografia com fase ligada.
A cromatografia líquida em coluna também possui subdivisões, sendo estas: cromatografia líquida clássica, feita em colunas de vidro, à pressão atmosférica, com fluxo de fase móvel devido a força da gravidade e cromatografia líquida de alta eficiência, feita em colunas metálicas e pressões elevadas de fase móvel. Em relação a polaridade relativa das fases na cromatografia líquida, quando a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel, têm-se a coluna clássica ou de fase normal, ao contrário, quando a fase móvel é mais polar que a fase estacionária, têm-se a coluna de fase reversa.
A forma de introdução da amostra e seu desenvolvimento ao longo da coluna cromatográfica gera outro tipo de classificação. O método mais comum, é o de eluição, onde a amostra é introduzida em uma única aplicação, e esta é arrastada ao longo da coluna pela fase móvel.
Uma última classificação, se refere ao mecanismo de separação empregado, podendo ocorrer processos químicos, físicos ou mecânicos. A cromatografia por exclusão de tamanho ocorre por um processo puramente mecânico, na qual a fase estacionária é uma matriz porosa uniforme e inerte, e as moléculas dos analitos da amostra ficam retidos ou não nos poros da fase estacionária. Por processos químicos, ocorre a cromatografia de troca iônica, com grupos funcionais ionizáveis ligados à fase estacionária, e a cromatografia por bioafinidade, com grupos de especificidade biológica ligados à fase estacionária. Por processos físicos, têm-se a adsorção e a absorção (partição), baseados em atrações eletrostáticas ou dipolares, podendo esses processos ocorrerem nas interfaces ou no interior das fases.
Neste relatório, utilizou-se a cromatografia em coluna utilizando sílica como fase estacionária, e a fase móvel utilizando-se os solventes hexano e acetona.
3) Metodologia.
Materiais
Coluna com torneira, algodão, papel absorvente, pipeta conta-gotas, erlenmeyer de 125 mL, proveta de 25 mL, bastão ou tubo de vidro, béqueres de 50 e 250 mL, almofariz com pistilo, suporte, garras e mufas, espátula, tela de amianto, aro ou tripé, bico de gás, conjunto para evaporador rotatório, funil de haste longa, bastão de vidro com borracha.
Reagentes
Folhas de espinafre, água destilada, sílica Gel 60, hexano, acetona.
Procedimentos
Preparo do Extrato
Removeu-se os nervos centrais das folhas de espinafre.
Pesou-se 10 gramas de espinafre.
Acendeu-se o bico de Bünsen e colocou-se o tripé com a tela de amianto sobre o bico.
As folhas foram lavadas em água gelada para resfriar e secas em papel adsorvente.
Adicionou-se o espinafre a água e este ferveu por 2 minutos.
Colocou-se cerca de 100 mL de água num béquer para ferver.
Adicionou-se 2 pontas de espátulas de sílica, misturou-se e levou a placa de aquecimento.
As folhas foram trituradas com a adição de 15 mL de mistura de acetona e hexano (1:1) e a mistura foi transferida para um béquer.
Preparo da Coluna
Adicionou-se hexano a 5 g sílica, misturou-se, e adicionou-se essa suspensão à coluna. 
Introduziu-se um pequeno chumaço de algodão na coluna, até próximo da torneira.
Fixou-se a coluna no suporte com as garras.
Marcou-se a linha da sílica e promoveu-se pequenas vibrações no tubo para favorecer o empacotamento.
Eluição da Coluna Cromatográfica
Adicionou-se eluente (hexano) lavando-se a parede da coluna.
Adicionou-se o extrato à coluna cromatográfica.
Abriu-se a torneira e descartou-se o solvente até este atingir o topo da coluna, quando a torneira foi fechada.
Abriu-se a torneira e quando a primeira banda (amarela) se aproxima da saída, troca-se o recipiente, e coleta-se essa banda até o eluente perder a cor.
Adicionou-se mais eluente à coluna (5 cm acima do topo), abriu-se a torneira e o solvente recolhido no mesmo frasco (3 vezes).
Substituiu-se o eluente por acetona, e repetiu-se o mesmo procedimento de eluição e descarte de solvente por 3 vezes.
Abriu-se a torneira e quando a segunda banda (verde) se aproxima da saída, troca-se o recipiente, e coleta-se essa banda até o eluente perder a cor.
Comparou-se as cores dos eluatos obtidos. Transferiu-se as frações para frascos identificados. Removeu-se o adsorvente da coluna, deixando-o no local indicado. Desprezou-se os restos de folha no lixo e lavou-se todo o material.
4) Discussões.
O extrato de folhas de espinafre foi obtido por maceração com a mistura de hexano e acetona 1:1. Antes de ser adicionado à coluna, o extrato foi misturado com sílica e a mistura de solventes foi evaporada. O hexano é um composto totalmente apolar, enquanto a acetona é um composto relativamente polar. Já o adsorvente da coluna cromatográfica, a sílica gel, é um composto polar. Portanto, como o adsorvente é polar, os analitos que possuem maior polaridade ficarão retidos na coluna por um tempo maior em comparação aos analitos que são totalmente apolares.
Com relação aos tempos de retenção dos analitos, sabendo-se que os carotenos são hidrocarbonetos insaturados conjugados de cadeias longas, portanto, totalmente apolares e que as clorofilas possuem esqueleto de hidrocarbonetos insaturados conjugados, mas possuem grupos éster, cetona, aldeído, e amina terciária, que conferem um relativo grau de polaridade à molécula, é possível prever que os carotenos serão eluidos antes das clorofilas. Em termos de interações, pode-se dizer que entre os carotenos e a fase estacionária, haverá pouca ou nenhuma interação, afinal, eles não possuem afinidade. Já no caso das clorofilas, haverá um nível de interação moderadamente forte com a fase estacionária, uma vez que a clorofila pode realizar, por exemplo, interações dipolo-dipolo com a fase estacionária.
Com relação à eluição e à fase móvel, sabendo-se que os primeiros compostos a eluir serão os carotenos, é justificável que se utilize nesta eluição uma fase móvel com a qual os carotenos possuam afinidade e sejam capazes de interagir (a interação que ocorre é do tipo interação de Van Der Waals), para que assim, possa ocorrer uma separação completa deste analito. O uso de um eluente mais polar, como a acetona, antes do uso do hexano, impediria a separação, pois, haveria afinidade e interações das clorofilas com a fase móvel, reduzindo assim seu tempo de retenção, em resumo,neste caso, os carotenos e as clorofilas teriam tempo de retenção tão próximos, que não poderiam ser separados. Após a eluição dos carotenos, a troca de eluente ocorre pois, considerando que existe interações entre as clorofilas e a fase estacionária, deve-se utilizar uma fase móvel capaz de realizar interações mais fortemente, ou no mínimo, no mesmo grau que as interações analito-fase estacionária (que são interações do tipo dipolo-dipolo). A acetona consegue fazer bem esse papel, e com a sua adição, as clorofilas podem ser eluidas e separadas de outros analitos.
Essa separação de componentes pode ser percebida de forma visual, pois os carotenos possuem cor amarelada, e as clorofilas possuem cor esverdeada. Assim, a primeira banda de eluição é uma mistura de cor amarelada e a segunda banda de eluição é uma mistura esverdeada.
QUESTIONÁRIO 
1) Consulte na literatura as estruturas dos carotenos e das clorofilas.
	Os carotenos são pigmentos orgânicos pertencentes ao grupo dos carotenóides
Abaixo, segue a estrutura do α-caroteno e do β-caroteno.
Figura 1 – Estrutura do α-Caroteno.
Fonte: (AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006).
Figura 2 – Estrutura do β-Caroteno.
Fonte: (AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006).
Figura 3 – Estrutura da Clorofila.
Fonte: (STREIT et al, 2005).
2) Considerando que os carotenos apresentam cores próximas do amarelo enquanto as clorofilas são verdes, avalie as polaridades das misturas obtidas e identifique o conteúdo das mesmas.
	A primeira banda de eluição foi a do caroteno, a banda era de cor amarelada. A segunda banda de eluição foi a da clorofila, a banda de cor esverdeada. 
Com relação à polaridade, como utilizou-se um solvente mais apolar na primeira eluição (hexano), e a fase estacionária é mais polar, os analitos apolares serão eluidos primeiro e não ficarão retidos, pois possuem mais afinidade com a fase móvel do que com a fase estacionária. Por isso, os carotenos saíram primeiro. As clorofilas são mais polares, por isso, na primeira eluição, não possuíam nenhuma afinidade com a fase móvel, portanto, ficaram retidas na coluna. Na segunda eluição, utilizando-se acetona, composto mais polar, passou a existir afinidade e interações entre as clorofilas e a fase móvel, então, este analito foi eluido.
3) Correlacione a polaridade com a estrutura química dos componentes da mistura.
	Os carotenos são longas cadeias de hidrocarbonetos insaturados conjugados, portanto, são totalmente apolares.
	As clorofilas possuem esqueleto de hidrocarbonetos insaturados conjugados, mas possuem grupos éster, cetona, aldeído, e amina terciária, conferindo um relativo grau de polaridade à molécula, uma vez que esta pode realizar interações dipolo-dipolo com compostos contendo átomos de hidrogênio e oxigênio, por exemplo.
4) Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e começou esta prática, no entanto, ao invés de utilizar inicialmente o hexano ele confundiu e começou a coluna com acetona. Discuta o que você acha desta troca de eluentes.
	Neste caso, a troca da ordem dos solventes vai impedir a separação dos analitos. Devido a falta de afinidade pela fase estacionária, os carotenos serão eluidos rapidamente, entretanto, devido à forte interação das clorofilas com a fase móvel, este analito também será eluido rapidamente. Então, embora a ordem de eluição dos analitos não mude, os tempos de retenção deles serão muito próximos, impedindo a efetiva separação de componentes.
5) Suponha que você tenha uma mistura de três substâncias orgânicas, sendo todas sólidas: um álcool, um hidrocarboneto saturado e uma cetona. Proponha uma separação cromatográfica destas substâncias utilizando sílica-gel como adsorvente e os eluentes que achar necessário.
	Neste caso, têm-se uma substância muito apolar, uma de polaridade intermediária, e uma substância muito polar. Os eluentes ideais, devem seguir o nível de polaridade próximo ao das substâncias. Sendo assim, uma proposta é utilizar um solvente apolar primeiro, a exemplo do benzeno ou do clorofórmio, depois um solvente de polaridade intermediária, como a 2-butanona, ou a 2-propanona, e por fim, utiliza-se um solvente muito polar, como água ou etanol.
6) Faça uma pesquisa sobre outros adsorventes que podem ser utilizados em métodos de separação por cromatografia em coluna.
· Alumina
· Carvão ativado
· Silicato de magnésio
· Sacarose
· Carbonato de cálcio
· Amido
5) Conclusões.
Através deste experimento, foi possível conhecer o funcionamento da técnica de cromatografia de adsorção em coluna, bem como extrair pigmentos vegetais e fracioná-los por meio de uma coluna cromatográfica de sílica como fase estacionária e hexano e acetona como eluentes.
6) Referências Bibliográficas.
AMBRÓSIO, C.L.B.; CAMPOS, F.A.C.S.; FARO, Z.P. Carotenóides como alternativa contra a hipovitaminose A. Revista Nutrição, Campinas, v. 19, n. 2, p. 233-243, março/abril, 2006.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introdução à métodos cromatográficos. 7ª Edição. Editora da UNICAMP. Campinas-SP. 1997.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia – Um breve ensaio. Revista Química Nova. n. 7, maio, 1998.
FONSECA, S. F.; GONÇALVES, C. C. S. Extração de pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar comercial. Revista Química Nova. n. 20, novembro, 2004.
STREIT et al. As clorofilas. Revista Ciência Rural, Santa Maria, v.35, n.3, p.748-755, maio/junho, 2005.