Relatório da prática 2 de Microbiologia - MÉTODO DE GRAM

Prévia do material em texto

Microbiologia 
 
 Assunto: Relatório de prática 2 
COLORAÇÃO DE ESFREGAÇO DE MATERIAL BIOLÓGICO PELO MÉTODO DE GRAM
INTRODUÇÃO:
O método de Gram, é uma técnica de coloração utilizada para diferenciar microorganismos através das cores, para que possam ser observados em microscópio óptico. 
Hans Gram observou que as bactérias, se diferenciavam quando submetidas ao tratamento com corantes de diversas cores. Ele fez essa observação em 1884 e em 1885 publicou um método de coloração de bactérias, o qual continua sendo utilizado até hoje em diversos laboratórios, pois se tornou fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias. 
Nessa técnica as bactérias são submetidas primeiramente ao corante de cor violeta, fixadas com lugol, depois sofrem descoloração com álcool. 
O método é fundamentado no coeficiente de participação do composto iodopararosanilina -IPRA - que é formado pela reação do cristal violeta com o lugol na coloração da primeira fase.
A prática foi dividida em visualizar no microscópio o método Gram feito na lâmina e observar os princípios físico-químicos que reagem à participação de cada corante nos procedimentos do método no tubo.
O método de Gram foi assim denominado em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram, que foi quem fez o experimento.
OBJETIVOS:
- Demonstrar na prática todas as etapas que são utilizadas no método Gram. 
- Explicar por que bactérias com componentes diferentes podem ficam diferentes quando coradas pelo método de Gram.
- Descrever a sequência dos procedimentos da coloração de Gram e os princípios físico-químicos de reação de cada um desses procedimentos.
- Comprovar a existência de micróbios que estão presentes nos tecidos de nosso corpo.
MATERIAIS:
- Lâminas de vidro; - 1 tubo de ensaio;
- Papel toalha; - Hastes flexíveis;
- Solução de cristal violeta - Solução de lugol;
- Álcool a 95º GL; - Solução de fucsina, 
- Óleo para imersão. - 1 Becker com água;
- 1 lamparina; - 2 Beckers para recolher os resíduos de corante;
- Microscópio óptico com lente objetiva com capacidade de aumento de 1000 vezes; 
PROCEDIMENTOS
1ª Parte - Demonstração dos mecanismos da coloração de Gram
- Colocar água no tubo de ensaio, 1/3 do vidro mais ou menos;
- Adicionar óleo até formar uma camada fina sobre a camada de água;
- Coloque gotas da solução de cristal violeta e observe até o corante atingir a fase aquosa;
 - Vede o tubo para impedir a saída dos líquidos, agite fortemente, segurando a tampa, e espere o processo de separação dos componentes água e óleo; 
- Adicionar gotas de lugol, fechar o tubo e observá-las até atingirem a fase aquosa;
- Agitar o tubo e esperar o processo de separação dos componentes água e óleo;
- Adicionar álcool. 
OBS.: Esta ação foi realizada pela tutora
2ª Parte – Esfregaço: no sulco gengival
- Lavar a lâmina de vidro com álcool.
- Coletar o material biológico, esfregando a haste flexível entre o dente e a gengiva;
- Passar a haste flexível com o material coletado, na lâmina de vidro; 
- Deixar o esfregaço secar. 
- Passar a lâmina do lado contrário de onde está o esfregaço, na chama para fixação do material colhido, com cuidado para não matar os micróbios. 
- Colocar a lâmina nivelada sobre um suporte, para que recolha qualquer líquido que seja depositado sobre ela. O material fixado deverá estar voltado para cima.
- Colocar gotas de cristal violeta no esfregaço e deixar por um minuto; 
- Lavar a lâmina com H2O, escorrendo o corante para dentro do Becker. 
- Colocar gotas de lugol sobre o esfregaço e deixar reagir durante um minuto;
- Lavar a lâmina com H2 O escorrendo o corante para dentro do Becker; 
- Lavar a lâmina com água por 05 segundos;
- Colocar gotas da fucsina sobre a lâmina e deixar reagir durante 30 segundos;
- Lavar a lâmina com H2O, escorrendo o corante para dentro do Becker. 
- Deixar secar
- Observar no microscópio, nas objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x.
RESULTADOS
Na primeira parte dos procedimentos, (realizada pela tutora), observamos que na mistura de água, óleo e o cristal violeta, a parte da água ficou corada conforme a parte oleosa ia se descorando gradualmente. Quando se colocou o lugol, observou-se que a parte oleosa ficou corada à medida que a parte da água ia descorando. As Gram negativas apresentam paredes pouco espessas, o que 
permite que a IPRA, alcance a membrana lipídica, onde o álcool consegue atravessar alcançando a membrana plasmática, descorando as bactérias, mas 
com a fucsina, são coradas novamente onde há a fixação do tom rosado. Esse procedimento pôde ser visualizado por todos.
 
Na segunda parte dos procedimentos, observou-se células da gengiva coradas em rosa e bactérias coradas nos tons de roxo (pareciam pontinhos). As Gram positivas possuem paredes espessas formadas por peptideoglicano, retendo o IPRA, na membrana impedindo a descoloração feita com álcool, permanecendo coradas de violeta. Após a execução do método foi possível classificar as bactérias em Gram-positivas que apresentam a coloração arroxeada e Gram negativas aquelas que adquirem a coloração avermelhada.
O álcool e o cristal violeta são hidrofílicos, porém quando se juntam formam o composto iodopararosalina (IPRA), que é hidrofóbico.
 1- Jorgiana 2- Walma 
Material coletado de Jorgiana e Walma (dividimos a mesma lâmina).
- Visualizamos nossas amostras no microscópio, com as objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x. -Meu ângulo de visualização foi 63, em todas as objetivas.
Os fragmentos da minha amostra, ficaram roxos e espaçados em relação à amostra da Jorgiana, que ficaram num tom roxos mais escuro e unidos.
Percebemos que nossas amostras depois de todo procedimento, eram gram-positivas.
Na objetiva de 100x foi usado óleo de imersão, para que os raios luminosos não se dispersem ao atravessarem o conjunto lâmina-óleo, isto concentra o trajeto da luz e o aumento da definição da imagem. 
DISCUSSÃO
Com esses experimentos observamos que tanto as bactérias Gram-positivas quanto as Gram-negativas, absorvem de maneira igual o corante cristal violeta e o mordente lugol, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, que é insolúvel. As Gram positivas por terem uma parede celular muito espessa, que é formada por peptídeoglicano, retém o cristal violeta-iodo, impedindo que o álcool as descolorissem e as mesmas permaneceram no tom violeta, mesmo após a segunda coloração. 
Já as Gram negativas, sofrem descoloração com o álcool, mas com a adição da fucsina, fixam o tom rosado.
CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos podemos perceber a importância e as vantagens do método de Gram e entendermos como as bactérias agem dentro do nosso organismo e que a coloração ou não das membranas das bactérias, está diretamente relacionada com as propriedades físicas e químicas delas, tais como espessura, integridade, porosidade e densidade. Com a identificação das bactérias Gram positivas e negativas, pode-se optar por tratamentos e medicamentos mais adequados aos pacientes. 
 
 
 FONTES: 
LIBERTO, Maria Izabel Madeira.Microbiologia. v. 1/ Maria Isabel Madeira Liberto; Ulisses Garcia Casado Lins; Maulori Curié Cabral. 
Microbiologia. V.1. 2. ed.
Rio de Janeiro: Fundação CECIERJ, 2014. 151 páginas.
Fundação Centro de Ciências e Educação Superior a Distância do Estado do Rio de Janeiro - Fundação CECIERJ/Consórcio CEDERJ. 
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html 
www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm
www.biomedicinabrasil.com › Metodologia › Microscopia
.