Relatório de aula prática de microbiologia (técnica de gram)

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Bacharel em Farmácia
 
Jéssica do Nascimento Cunha
2018104518
MICROBIOLOGIA
Relatório de aula prática de Coloração de Gram
Data da realização da prática: 27/09/2018
Orientação: Prof. Dr. Jefferson Pessoa Hemerly
São Mateus/ES
2018/2
INTRODUÇÃO
A técnica de coloração de gram é um importante teste realizados em laboratórios de microbiologia e muito usado na bacteriologia com o objetivo de triagem de bactérias, sendo assim auxiliando nos resultados de exames e diagnósticos de doenças bacterianas. Essa técnica tintorial consiste em diferenciar bactérias gram-positivas de gram-negativas, conforme fixação do corante cristal violeta e fucsina. Essa técnica foi desenvolvida (publicada em 1884) por um médico dinamarquês chamado Hans Christian Gram, e devido ao seu sobrenome “Gram”, esse método recebeu esse nome.
OBJETIVOS:
Diferenciar e classificar bactérias em gram-negativas e gram-positivas, sendo observado a coloração no microscópio.
MATERIAIS:
Lâminas de vidro;
Bico de Bunsen; 
Pinça;
Pipeta de Pasteur;
Alça de inoculação;
Estante para tubos;
Placa de Petri;
Papel toalha;
Béquer;
Solução salina;
Semeadura de Escherichia coli (placa de Petri);
Semeadura de Staphylococcus aureus (placa de Petri);
Cristal violeta;
Lugol;
Álcool-cetona;
Álcool 70%
Fucsina;
Água;
Óleo de imersão;
Caneta para identificar lâminas;
Microscópio.
METODOLOGIA
- Esfregaço
Inicialmente desinfetamos a bancada e as lâminas com álcool com o auxilio de papel toalha para que seja retirada qualquer tipo de microrganismo diferente da minha semeadura na placa de Petri. 
Todo meu manuseio deve ser feito com o bico de Bunsen aceso para que não haja proliferação ou contaminação do microrganismo ao meu redor. Identifiquei a lâmina escrevendo o microrganismo que estava preparando em cada lâmina. Colocamos uma gota de solução salina na lâmina para que o material do esfregaço seja melhor espalhado pela lâmina. Ainda com o bico de Bunsen aceso, flambamos a alça de inoculação até que ela fique em brasa (para eliminar qualquer tipo de microrganismo) e esperamos esfriar próximo da chama, para fazer a colheita do material na placa de Pétri. Não podendo esquecer de flambar sempre a alça de inoculação após o seu uso.
Assim que o material esta na lâmina, começamos o esfregaço para espalhar e misturar melhor o material e depois de bem dissolvido, flambamos a lâmina na chama do bico de Bunsen para secar mais rápido.
- Método Coloração de Gram (Tab.1)
Usando uma pia como auxilio, seguimos para ela para iniciar a coloração. 
Cobrindo o esfregaço com cristal violeta por 30s a 1min. Após esse tempo escorrer o excesso de corante. Cubra com o esfregaço com lugol por cerca de 1min, logo após vertendo o excesso de solução (descorar). 
Cubra novamente o esfregaço com alcool-cetona e lave em um filete de agua até que a cor roxa pare de sair da lâmina.
Core com fucsina fenicada por 30seg, e deixe escorrer o corante para que em seguida lave novamente utilizando somente um filete de água. Com a lâmina já corada, deixei secar para que possa ser visualizada no microscópio.
Por fim, analisamos as lâminas no microscópio óptico, nas lentes objetivas de 100x com o auxilio do óleo de imersão. Observando a diferença entre os materiais biológicos utilizados na amostra.
Observação: Esses métodos foi utilizado da mesma forma para a lâmina de Escherichia coli quanto para a lâmina de Staphylococcus aureus.
	Tab.1. Método de Coloração de Gram
	Material
	Semeadura 1
	Semeadura 2
	
	Staphylococcus aureus
	Escherichia coli
	Cristal Violeta
	1 minuto
	1 minuto
	Verter Excesso
	Sim
	Sim
	Lugol
	1 minuto
	1 minuto
	Verter Excesso
	Sim
	Sim
	Álcool-cetona
	Sim*
	Sim*
	H2O
	Sim**
	Sim**
	Fucsina
	30 segundos
	30 segundos
	Verter Excesso
	Sim
	Sim
	H2O
	Sim**
	Sim**
	Microscópio
	Visualização na lente objetiva de 100x
	Visualização na lente objetiva de 100x
*Despejar o álcool-cetona com a pipeta de Pasteur até que toda cor roxa do cristal violeta se desprenda da lâmina. 
**Pequeno filete de água para que não haja perca material.
RESULTADO
As duas lâminas foram visualizadas no microscópio óptico, na lente objetiva de aumento 100x. Houve um erro na contagem de tempo na hora de fixação do cristal violeta na lâmina com o material Staphylococcus aureus. O material ficou muito corado e quase não se percebe a diferença de cores. Mas com o auxilio do professor Jefferson, que nos orienta em aula do Laboratório, foi identificada como cocos gram-positivo. (fig.1.)
Na lâmina de Escherichia coli houve coloração correta podendo ser visualizada na cor rosa, com bacilos gram-negativo. (fig.2.)
Figura 1. Lâmina de Staphylococcus aureus. Cocos de Gram-negativos (Jéssica do Nascimento, tirada em 27/09/2018)
 
Figura 2. Lâmina de Escherichia coli. Bacilos de gram-negativos. (Jéssica do Nascimento, tirada em 27/09/2018)
CONCLUSÃO
Ao concluir as observações e os estudos sobre métodos de coloração de gram e esfregaço, deve-se seguir a risca as orientações e métodos de sua prática em questão. Assim nos desvencilhamos de erros e alterações nos resultados. 
Todo método contribui para um importante estudo e conhecimento de diferenciação de tipos de bactérias, sendo dividas em 2 grandes grupos: gram-negativas e gram-positivas. Podendo ser observadas ao microscópio onde as negativas se colorem em cor roxa e as positivas em cor rosa.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Marques, Mara. Biografia de Gram, Hans Christian. Disponível em <http://knoow.net/ciencterravida/biologia/gram-hans-christian/>. Knoow Enciclopédia temática. Artigos Ciência Terra e Vida. 15/07/2016. Acesso em 01/10/2018
T. Madigan, Michael/ M. Martinko, John/ Parker, Jack. Microbiologia de Brock. 10ªedição. São Paulo: Prentice Hall, 2004.
Ministério da Saúde, Técnica de Coloração de Gram. Brasília: 2001.
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