CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) editado2nn

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CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE/HPLC)
PRINCÍPIO BÁSICO
• Definição:
É um processo pelo qual diferentes solutos são separados por uma
dinâmica diferencial do processo migratório em um sistema contendo uma
ou mais fases, das quais uma desloca-se continuamente em uma dada
direção e no qual as substâncias exibem mobilidades distintas devido a
diferenças de adsorção, partição, solubilidade, pressão de vapor, tamanho
da molecular ou densidade de carga iônica.
FASES MÓVEL E ESTACIONÁRIA
Fase móvel: 
• A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características
impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel
dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter
alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de
alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por
ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e,
também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente
dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais
utilizados: água, metanol e acetonitrila.
Fase estacionária:
• Fase fixa onde a substância que está sendo separada ou identificada fixa-
se na superfície de outro material;
• Se a fase estacionária for mais polar que a fase móvel ela é chamada de
fase normal ((nessa fase é muito utilizada a sílica gel, alumina e celite).
• Se a fase estacionária for mais apolar que a fase móvel é chamada de fase
reversa (fase estacionária quimicamente ligada).
• Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser
• classificados de acordo com os seguintes aspectos:
• a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos;
• b) Partículas porosas ou peliculares;
• c) Partículas esféricas ou irregulares;
• d) Partículas com diferentes diâmetros.
• Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual
contém a amostra na forma de uma mistura de solutos.
INSTRUMENTAÇÃO 
Cromatografia líquida moderna: 
• Altas pressões de bombeamento: velocidades razoáveis por recheios de
partículas muito pequenas (3 – 10 µm).
• Equipamentos mais complexos.
• Equipamentos mais caros.
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA: 
COMO É UM HPLC COMERCIAL?
Diagrama de blocos mostrando os componentes típicos 
de um sistema para CLAE
Reservatório de 
solvente 
• Filtro do reservatório:
Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam os 
capilares ou contaminem a bomba. 
• Filtros de 10 a 40 um
Reservatório para a fase móvel
MÉTODO DE DEGASEIFICAÇÃO
• Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o 
pior método quando usado sozinho
• Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.
• Purga com Hélio: Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva ao 
aumento de vazamentos, maior custo operacional.
• Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar 
na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo).
Bomba 
SISTEMA DE BOMBEAMENTO
Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o 
sistema cromatográfico.
• REQUISITOS
- Habilidade de gerar pressões altas (até 6.000 psi)
- Saída livre de pulsação
- Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min
- Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor
- Resistência a corrosão
Tipos de bomba:
- Bomba de seringa
- Bomba recíproca
- Bomba pneumática de pressão
• Bomba de seringa (rosca):
– Saída livre de pulsação
– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL)
– Troca de solventes: difícil
• Bomba recíproca:
– Fluxo pulsado que deve ser atenuado
– Pequeno volume interno
– Alta pressão de saída (10.000 spi)
– Vazões constantes
• Bomba pneumática de pressão
– Barata
– Simples
– Livres de pulsação
Eluição Isocrática :
• A composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise. 
• Capaz de separar um número limitado de analitos. 
Eluição Gradiente:
• A composição da fase móvel varia durante a análise. 
• aumento da polaridade da fase móvel – devido a retenção da amostra 
pela fase estacionária. 
• Separação de amostras complexas.
SISTEMA DE BOMBEAMENTO
• A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou
mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma
eluição suficientemente rápida de todos os componentes,
então pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
Injetor
SISTEMA DE INJEÇÃO
• INJEÇÃO MANUAL
As amostras são introduzidas com seringas.
Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início da 
coluna.
• AMOSTRADOR AUTOMÁTICO
As amostras são postas em um frasco localizado dentro do amostrador.
O amostrador automático :
1. Mede o volume correto para injeção.
2. Injeta a amostra.
3. Prepara o injetor para uma próxima amostra
Coluna
• Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão)
-Comprimento: 10 a 30 cm 
- Diâmetro: 2 a 5 mm 
-Recheio: partículas porosas de 1,8 – 5 µm
--Preço: > US$ 200.00 
VANTAGENS: 
• Maior eficiência da coluna 
• Menor consumo de solventes
• Maior velocidade de eluição
• Recheio
- Sílica (suporte): partículas com diâmetros altamente uniformes;
- Fase estacionário: composto orgânico química ou fisicamente ligados a
superfície do suporte.
• Colunas de proteção (guarda)
-Posicionada a frente da coluna analítica – Função: aumentar a vida útil da
coluna analítica – Composição semelhante a composição da coluna analítica
Detector
CARACTERÍSTICAS DE UM DETECTOR
• Sensibilidade e seletividade adequada 
• Ampla faixa linear
• Baixo volume interno
• Resposta Rápida 
• Boa estabilidade e reprodutibilidade 
• Não destruir a amostra
• Baixo volume interno 
-O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde. 
- Grande volume: alargamento dos picos registrados. 
• Resposta Rápida 
-O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente 
um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector). 
-Detector lento: picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
• Boa estabilidade e reprodutibilidade 
- Alta confiabilidade e facilidade de uso 
PRINCIPAIS DETECTORES
• Espectrofotometria UV e Visível (mais popular em HPLC)
• Fluorescência (FD)
• Índice de Refração (RI)
• Espectrometria de Massas (MS)
DETECTOR ESPECTROFOTOMÉTRICO
Mede as variações na absorção da luz na região de 190 a 370 nm (UV) e de
370 a 700 nm
Aplicações: Compostos que absorvem no UV-Vis
Vantagens: Alta sensibilidade; Não é destrutivo. Responde a larga faixa de
concentração; Relativamente insensível a variação de T e vazão da FM
Desvantagens: Detecta somente substâncias que absorvem no UV-Vis
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA
Baseia-se na medida da luz emitida pelas substâncias previamente irradiadas
com luz UV
Aplicação: Na detecção de compostos fluorescentes, (vitaminas (ex.
riboflavina), micotoxinas, HPAs, etc) e compostos derivatizados (ex. aminas).
Vantagens: Muito sensível ; Não é destrutivo ; Permite gradiente
Desvantagens: Poucas substâncias são naturalmente fluorescentes
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRAÇÃO
Baseia-se na medida da diferença do índice de refração da FM na presença 
das substâncias. Para aplicações gerais. 
Vantagens: Praticamente todas as substâncias são detectáveis ; Não é 
destrutivo
Desvantagens: Sensibilidade menor que UV ; Sensível a diferenças de T, vazão 
e pressão da FM ; Não permite fazer gradiente 
DETECTOR DE MASSAS (LC-MSE LC-MS/MS)
• Fornece o registro da separação cromatográfica e informações a respeito 
da identidade dos analitos. 
• Os analitos, após separação, são fragmentados no detector permitindo a 
identificação e quantificação. 
Vantagens: Fornece massa molecular dos analitos ; Identifica os fragmentos 
Desvantagens: Requer operador experiente ; São caros 
HPLC
Adsorção Partição Iônica Exclusão Afinidade Quiral
MODOS DE HPLC
ADSORÇÃO
• CLAE por adsorção – Os analitos são adsorvidos sobre uma superfície de um
sólido polar finamente dividido (recheio).
• O mecanismo de separação: competição entre moléculas da amostra e da
fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária, sólido.
• A FM é constituída por um solvente orgânico ou por uma mistura de solventes
orgânicos.
• A FE é composta por partículas de sílica ou alumina.
• A atividade da superfície de muitos sólidos se encontra com frequência 
afetada pela retenção de certas moléculas de alta polaridade como 
álcoois, fenóis, água, etc. 
• Na maioria das separações o adsorção (CLS) usa-se partículas porosas, na 
faixa de 5-10µm, além de empregar, às vezes, materiais maiores, 30-40µm.
PARTIÇÃO
• A cromatografia líquido-líquido (CLL) foi desenvolvida por Martin e Synge
em 1941 para separação de vários aminoácidos, usando fase estacionária
de água em sílica e clorofórmio como fase móvel.
• os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos
por ela, enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente
pela fase móvel.
• 0 maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária 
na fase móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não 
reprodutibilidade nas separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas 
maneiras. 
• A primeira é saturando a fase móvel com a fase estacionária por meio de 
uma pré-coluna, colocada antes do injetor, que contenha uma alta 
percentagem de fase estacionaria. 
• A segunda é utilizando materiais que contenham a fase estacionária, 
quimicamente ligada a um suporte sólido.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA COM FASE LIGADA
• A fase estacionária para a cromatografia líquida com fase ligada
(CLFL) surgiu como resposta aos problemas com a CLL.
• Como a fase estacionária é quimicamente ligada à superfície do
suporte, não há mais solubilidade da fase estacionária na fase móvel.
• O mecanismo principal desta técnica baseia-se na partição. Por
outro lado, como esta fase estacionária também apresenta
influência de grupos ativos (polares) da superfície (isto é, também
ocorre o mecanismo de adsorção), a maioria dos pesquisadores
considera esta técnica um método separado.
FE - diferentes polaridades
Características:
– Maior estabilidade
– Pequena capacidade de amostra
Recheios de Fase Normal e Reversa
– Fase normal - A FE é polar e a fase móvel é apolar
– Fase reversa - A FE é apolar e a fase móvel é polar
Regra geral:
- Iguala-se a polaridade do analito com a da FE
- Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE.
- Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso.
- Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é vantajoso.
APLICAÇÕES
TROCA IÔNICA
Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária possui grupamentos iônicos quimicamente ligados que
podem ser trocadores de cátions ou de ânions. Esses grupamentos apresentam contra-íons que são deslocados pelos
íons da amostra. Por exemplo, admitindo uma amostra com um cátion M+ , tem-se:
𝑀+ + 𝑅 − 𝑆𝑂3
−𝑁𝑎+↔ 𝑁𝑎+ + 𝑅 − 𝑆𝑂3
−𝑀+
Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca iônica, são:
𝑆𝑂3
− -trocadores fortes de cátions
C𝑂2
− -trocadores fracos de cátions
N𝑅3
+-trocadores fortes de ânions
𝑁𝐻2𝑅
+- trocadores fracos de ânions
As catiônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de sódio (𝑁𝑎+) ou de íon hidrogênio e as
aniônicas na forma de cloreto (𝐶𝑙−). Os materiais usados como recheio para CLAE.
• Os materiais usados como recheio para CLAE por troca iônica tem grupos
(cátions ou ânions) quimicamente ligados a partículas porosas de resinas
poliméricas, a sílica com camada pelicular, as micropartículas porosas de
sílica e as micropartículas porosas de resinas poliméricas.
• Os processos de troca iônica dependem muito da temperatura, é
conveniente ter algum sistema de controle térmico quando for empregado
este tipo de fase estacionária, pois mudanças normais na temperatura
ambiente podem afetar os resultados.
EXCLUSÃO
• A cromatografia por exclusão tem sua resolução baseada no tamanho
efetivo das moléculas dos componentes da amostra em solução.
• E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que um
material é útil. O primeiro é o inferior, chamado de limite de permeação,
abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente
difundidas dentro dos poros do material e o segundo é o superior, chamado
limite de exclusão, acima do qual todas as moléculas são muito grandes
para penetrar nos poros.
• Quanto à rigidez existem três tipos de materiais. Os primeiros são os materiais
fracos 11 (não rígidos), constituídos de géis de polidextrano (Sephadex),
poliacrilamidas (Bio-Gel P ) e poliagaroses (Sepharose e Bio Gel A), usados quase
sempre com fases móveis aquosas. Sua capacidade é elevada mas eles não
resistem a pressões superiores a 3 bars; então, são usados somente na CE
clássica.
• Os segundos são os materiais semi-rígidos que normalmente resistem a pressões
da ordem de 100 a 150 bars. Estes materiais são constituídos de microesferas de
algum copolímero, como o poliestireno-divinilbenzeno. Podem ser empregados
com fases móveis aquosas ou não aquosas e existem em uma grande
variedade de porosidade. São usados em CLAE e também em CE clássica
• Os terceiros são os materiais rígidos que resistem a qualquer pressão e são
geralmente constituídos de partículas de sílica porosa ou de vidro poroso.
Devido a sua rigidez podem-se obter separações muito rápidas com fluxo de
fase móvel muito alto, o que produz pressões elevadas, para o uso de CLAE.
• Os materiais à base de sílica ou vidro podem ter a superfície muito ativa e
apresentar adsorção ou degradação de certos materiais (por exemplo,
desnaturação de proteínas). Existem tratamentos para eliminar estes efeitos
mediante processos de desativação química, tais como silanizar a sua
superfície de modo muito similar ao tratamento químico dos suportes em
cromatografia gasosa.
AFINIDADE
A cromatografia de Afinidade é um processo da separação usado para
refinar moléculas ou um grupo de moléculas que estão em uma mistura
bioquímica. Moléculas Específicas da fase móvel ira ligar-se a fase
estacionária baseada em suas propriedades enquanto o resto da solução
que passa inerte.
Aplicações:
Utilizada na refinação de biomoléculas, como por exemplo, enzimas,
anticorpos e proteínas.
QUIRAL
As fases quirais são materiais que quando empregadas como FE ou
introduzidos na fase móvel, permitem a separação de isômeros ópticos de
misturas racêmicas ou dos compostos racêmicos em matrizes de uso geral.
Aplicações:
É o método analítico mais empregado para separação, identificação e
quantificação de enantiômeros. Tem sido amplamente aplicada na
determinação da pureza óptica e da constituição estereoisomérica de
medicamentos, matérias-primas, preparações farmacêuticas e fluídos
biológicos.
CLÁSSICA X HPLC
CLÁSSICA 
• Recheio geralmente utilizado 
apena uma vez
• Requer habilidade para aplicação 
da amostra
• Há mais desperdícios de material e 
tempo
• Vazão promovida pela ação da 
gravidade
HPLC
• Utiliza coluna fechada podendo 
reaproveitar o recheio• Amostras podem ser injetadas 
automaticamente 
• Vazão é promovida pelo auxilio de 
uma bomba 
• Pode atingir uma precisão superior 
a + 0.5%
CLÁSSICA
• As separações requerem,
geralmente, várias horas e a
detecção e a quantificação das
frações são realizadas por análise
manual.
HPLC
• Vários tipos de detectores, que
podem ser colocados na saída da
coluna, proporcionam uma
identificação e quantificação
contínua dos componentes da
amostra.
GASOSA X HPLC
GASOSA
• Amostras devem ser voláteis e 
termicamente estáveis
• Detectores mais rápidos e sensíveis
• Equipamento de fácil manipulação 
• Técnica mais barata
HPLC
• Requer somente que a amostra 
seja solúvel na fase móvel
• Maior variedade de possíveis 
mecanismos de separação
• Técnica mais cara
VANTAGENS
• FE é utilizada inúmeras vezes
• Versatilidade: Único requisito é a 
solubilidade na FM
• Tempo reduzido de análise
• Alta resolução
• Boa detectabilidade
• Versatilidade 
• Automatização
LIMITAÇÕES
• Alto custo do instrumento
• Alto custo de manutenção
• Alto custo de operação
• Falta de detector universal sensível 
• Necessidade de experiência no seu 
manuseio
A HPLC é um método ideal para a separação de espécies
iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos
naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros
compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade
térmica.
REFERÊNCIAS
[1] Cromatografia de alta eficiência CLAE. Disponível em: 
http://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula_11-CL_08_07_14.pdf
[2] Analise instrumental da cromatografia liquida de alta resolução. Disponível em: 
http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/546
[3]Cromatografia de afinidade. Disponível em: 
http://knoow.net/cienciasexactas/quimica/cromatografia-de-afinidade/
[4] Cromatografia líquida com fase quiral aplicada na separação enantiomérica de fármacos 
cardiovasculares. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/rbcf/v42n4/a11v42n4.pdf/
[5] HPLC Cromatografia liquida de alta eficiencia. Disponível em: 
http://w3.ufsm.br/larp/media/hplc_geral_colorido.pdf