Relatório - ELISA

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RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
 ELISA de captura de IgM, IgG e IgA anti-HTLV-I e anti-HTLV-II
1 – INTRODUÇÃO 
Os vírus linfotrópicos de linfócitos T humanos foram isolados em 1980 por meio de um paciente com uma rara leucemia de células T. A partir de sua descoberta foram divididos em dois tipos de vírus, HTLV-I e o HTLV-II, de origem dos retrovírus que estão relacionados com o vírus causador da AIDS, mas são diferentes, pertencendo à subfamília Oncornavirus dos retrovírus. A identificação desses vírus se dá por testes sorológicos, onde a detecção de anticorpos para o HTLV-I e o HTLV-II caracteriza a positividade para a infecção. 
O HTLV-I está muito relacionado a doenças neurológicas e leucemia; enquanto o HTLV-II está mais ligado a leucemia do linfócito piloso. A transmissão do vírus T-linfotrópico humano do tipo I ocorre de duas formas: transmissão vertical e horizontal. A transmissão vertical se dá pela infecção intra-uterina ou após o nascimento a partir da amamentação. Já a transmissão horizontal ocorre por relações sexuais, transfusões sanguíneas ou compartilhamento de agulhas. A transmissão do HTLV-II é mais predominante em usuários de drogas injetáveis e ocorre de forma semelhante ao HTLV-I, mas não está bem definida sua associação com outras doenças. Para o HTLV-II, foram identificados casos de eritrodermatite e infecções bacterianas de pele de indivíduos que sofreram coinfecção pelo HTLV-II e HIV-I.
O diagnóstico para detecção do vírus T-linfotrópicos humano ocorre por testes sorológicos específico para pesquisa de anticorpos IgM, IgG e IgA anti-HTLV I e II pelo teste de ELISA para verificar se será reativo ou não reativo, caso seja reativo deve-se fazer o teste para diferenciar os anticorpos anti-HTLV-I e anti-HTLV-II.
O kit Gold Elisa HTLV-I/II é um teste imunoenzimático qualitativo contedo anticorpos anti-HTLV-I e II que estejam presentes no soro ou plasma do indivíduo visando fazer a triagem quanto à infecção ou não pelo vírus T-linfotrópico humano. Este kit contém microcavidades contendo antígenos recombinantes de HTLV-I e II de fase sólida e, possuindo a tecnologia ELISA que tem como princípio de que os antígenos ou anticorpos que estão ligados a fase sólida possam ser reconhecidos por Ag ou Ig complementares e marcados na presença de uma enzima que reage com um substrato cromogênico.
2- OBJETIVOS
Detectar a presença de anticorpos para os vírus HTLV-I e HTLV-II no soro do paciente;
 
Observar a absorbância registrada pela amostra teste e a comparar com os valores dos controles positivo e negativo.
3- MATERIAIS USADOS
MATERIAIS:
EPI’s;
Microplaca revestida com o antígeno específico do HTLV I/II;
Pipetas com capacidades máximas de 100 e 200uL;
Ponteiras;
Solução de parada;
Substrato/Cromógeno
Conjugado enzimático;
Diluente da amostra;
Controle positivo;
Controle negativo;
Solução de lavagem; 
Espectrofotômetro;
Estufa a 37° C;
Papel alumínio;
Papel toalha absorvente.
AMOSTRA:
Amostra sorológica do paciente.
4 – METODOLOGIA
	4.1. DIVISÃO DAS PLACAS EM FILEIRAS
As placas dos kits Gold ELISA HTLV-I/II utilizadas na prática eram de fileiras destacáveis, isto é, permitia a separação das fileiras, de modo que cada grupo presente fez uso de uma fileira contendo 8 poços ou cavidades (A, B, C, D, E, F, G e H). 
	4.2. ADIÇÃO DOS CONTROLES E AMOSTRA TESTE
Inicialmente, as placas foram deixadas à temperatura ambiente e, em seguida, colocou-se 50 µL de solução diluente (tampão fosfato-salina com estabilizantes, de coloração verde) em cada poço das fileiras destacadas. Ressaltando que as placas já continham antígenos dos dois tipos de vírus – HTLV-I e HTLV-II – e estavam pré-bloqueadas de fábrica (isto é, a solução bloqueio já foi introduzida na própria confecção das placas). Na sequência, foi feita a adição de 50 µL do controle negativo (azul), 50 µL do positivo (vermelho) e 50 µL da amostra do paciente (soro) na seguinte ordem: nos 3 primeiros poços (A, B e C), o controle negativo; nos poços “D” e “E”, o controle positivo; e nos 3 últimos, a amostra teste. As fileiras foram incubadas à 37 ºC, durante 30 min. Essa etapa inicial foi feita previamente pela técnica do laboratório, a fim de antecipar o processo, concedendo tempo suficiente para finalizá-lo dentro do horário de aula (das 10:35 às 12:00). Caso esse medida não fosse adotada, não seria possível concluir a prática nesse espaço de tempo. 
	4.3. PRIMEIRA LAVAGEM
Após a primeira incubação, uma fileira de poços ficou sob a responsabilidade de cada grupo, para a execução das próximas etapas. Nessa continuidade, procedeu-se a lavagem da fileira com a solução de lavagem (solução salina tamponada contendo 0,05 % sabão biológico, normalmente, Tween) contida num béquer. Nesse feito, foram transferidos 300 µL da solução de lavagem para cada cavidade, com auxílio de duas pipetas semi-automáticas – uma de 200 e outra de 100 µL – devido ao fato de não haver uma pipeta de 300 µL. Após 20 segundos de molho, a placa foi virada sob um recipiente, para desprezar a solução de lavagem, e o excedente foi eliminado batendo-se a placa invertida sobre papéis toalhas na bancada. Esse procedimento foi realizado 5 vezes. Vale ressaltar que, normalmente, a solução lavagem vem 20 vezes concentrada, sendo necessária dilui-la 20 vezes, para que fique 1 vez concentrada. No entanto, essa preparação também já estava pronta. 
	4.4. ADIÇÃO DO CONJUGADO
Posteriormente, acrescentou-se 100 µL do conjugado (antígeno do vírus ligado à enzima peroxidase, sem comprometer o epítopo desse antígeno) em cada cavidade. Cobriu-se a placa com um papel alumínio contendo o número do grupo (no caso, grupo 1), para distinguir das placas pertencentes aos demais grupos, e a deixamos incubada na estufa à 37 ºC, por 30 min.
	4.5. SEGUNDA LAVAGEM E INTRODUÇÃO DA SOLUÇÃO ENZIMA/CROMÓGENO
Dando continuidade à prática, 5 lavagens foram novamente procedidas (da mesma forma já detalhada antes) e 100 µL da solução substrato da enzima (H2O2)/cromógeno (TMB) foram adicionados em todos os poços. As soluções formadas foram cobertas com papel alumínio durante 15 min.
	4.6. APLICAÇÃO DA SOLUÇAO DE PARADA
 
Passados os 15 minutos de incubação, colocou-se 50 µL de uma solução de parada (ácido clorídrico 1M) em todas as cavidades. Essa solução de parada é aplicada para interromper a reação enzimática da peroxidase, além de gerar uma coloração amarela importante na leitura do teste de ELISA (esse evento será melhor detalhado nos resultados).
	4.7. LEITURA DO TESTE DE ELISA
 
Finalizando a prática, as microplacas foram submetidas à leitura do espectrofotômetro. Adotou-se o comprimento de onda de 450 nm com filtro de referência 620/630 nm, visando medir a absorbância do produto originado. Os valores da absorbância registrados pelas cavidades contendo os controles positivos e negativos fornecem padrões de comparação para amostra teste, de tal modo que: I) em casos positivos para a presença de anticorpos anti-HTLV-I ou II na amostra do paciente, o valor da média da absorbância do soro teste deve estar mais próximo da média observada no controle positivo; II) em situação de negatividade, deve haver maior proximidade entre as absorbâncias registradas pelo controle negativo e a amostra do paciente. 
5 – RESULTADOS
O controle negativo utilizado no teste de ELISA apresentava a coloração azul, enquanto o controle positivo era de cor vermelha, de tal forma que, ao serem misturados com a solução diluente verde nos devidos poços, promoveram mudança de cor. Essa alteração também foi relatado em relação a amostra do paciente, que tornou o verde da solução diluente mais escuro. Embora esse procedimento não ter sido realizado pelo grupo, esses detalhes foram comentados durante as orientações da prática, onde foi destacado que essa variação na coloração é um importante indicador colorimétrico da adição de amostra, funcionando como um “controle interno” (evita possíveis “confusões”).
 
O kit Gold ELISAHTLV-I/II foi empregado para a análise qualitativa da amostra do paciente, isto é, apenas para definir a presença ou ausência de IgM, IgG e IgA específicos para os vírus HTLV-I e HTLV-II, não determinando qual destes anticorpos especificamente estariam presentes ou quantificá-los. No entanto, essa busca foi frustrada com a invalidação do teste de ELISA, pois os valores da absorbância detectados não atingiram os parâmetros esperados para a validação. Essa invalidação ocorreu com todos os grupos que realizaram a prática, cuja explicação para tal acontecimento está no fato dos kits de ELISA estarem vencidos. Após o prazo de validade ser atingido, os antígenos dos vírus fixados começam a serem perdidos (vão perdendo aderência ou se tornam inviáveis). Consequentemente, não há a captura dos anticorpos específicos para os vírus; logo, tanto os anticorpos que poderiam estar presentes na amostra do paciente serão removidos após a lavagem, bem como os controles positivos (soro humano contendo anticorpos anit-HTLV). 
Caso os anticorpos IgM, IgG e IgA anti-HTLV-I e anti-HTLV-II estivessem presentes e o kit funcionando corretamente, ocorreria a ligação do conjugado com os sítios livres destes anticorpos. Assim, a peroxidase clivaria o peróxido de hidrogênio (H2O2), gerando um produto intermediário que, por sua vez, oxidaria o cromógeno (TMB). Com a oxidação do TMB, seria originado um composto azul. A solução de parada introduzida no final do processo trata-se de uma solução de ácido clorídrico 1M, a qual torna o meio ácido. Por consequência da alteração de pH, a peroxidase perde a sua atividade, interrompendo-se a reação enzimática. Nesse meio ácido, o produto do cromógeno oxidado torna-se amarelo. Uma vez que a intensidade da cor amarela formada será proporcional à quantidade de conjugado, quanto maior a quantidade de anticorpos específicos para o antígeno maior o número de conjugados presentes. A partir disso, é medido a absorbância do produto de cor amarela, visando detectar a presença de anticorpos anti-HTLV-I e II. Porém, como o kit de ELISA estava vencido, não ocorreu ligação do conjugado com os anticorpos específicos, pois já haviam sido removidos na primeira lavagem. Por consequência, o conjugado também será descartado após a lavagem seguinte, não ocorrendo os eventos em cadeia esperados: reação enzimática, oxidação do cromógeno, mudança na coloração do cromógeno para o amarelo em meio ácido. Possivelmente, a ausência desses eventos fizeram com que não ocorre a absorbância esperada dentro do comprimento de onda de 450 nm com filtro de referência 620/630 nm, invalidando o teste.
6 – CONCLUSÃO
De acordo com a leitura dos poços no espectrofotômetro, os resultados obtidos do ensaio imunoenzimático ELISA específico para o vírus HTLV I/II apresentaram valores de absorbâncias que alcançaram os parâmetros para a invalidação. Portanto, o teste foi invalidado.
7 – REFERÊNCIAS
MATERNARE – ANTICORPOS ANTI-HTLV-I E II, 2012 [Internet]. Disponível em:<https://maternare.wordpress.com/exames-femininos/anticorpos/anticorpos-anti-htlv-i-e-ii/>. Acesso em: 08 set. 2017.
HTLV – O QUE É O VÍRUS HTLV?, 2014 [Internet]. Disponível em: <http://www.htlv.com.br/duvidas.html>. Acesso em: 08 set. 2017.
KIT GOLD ELISA HTLV I/II - INSTRUÇÕES DE USO GOLD ELISA HTLV I/II, [Internet]. Disponível em:<https://www.sigaa.ufrn.br/sigaa/portais/discente/beta/ discente.jsf>. Acesso em: 09 set. 2017.