Relatório ELISA

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FACULDADE DOM PEDRO II 
FARMÁCIA
AMANDA NASCIMENTO
FERNANDA CAZUMBÁ
LUIZA ROCHA
TAINARA MACEDO
TAMIRES DAIANE
ELISA
 
Salvador
2018
AMANDA NASCIMENTO
FERNANDA CAZUMBÁ
LUIZA ROCHA
TAINARA MACEDO
TAMIRES DAIANE
 
ELISA
Relatório de Prática apresentado ao Curso de Farmácia da Faculdade Dom Pedro II, como requisito para aprovação na disciplina de Imunologia.
Orientador: Prof. João Cotrim
Salvador
2018
SUMÁRIO
Introdução------------------------------------------------------------------------------4
Objetivo---------------------------------------------------------------------------------5
Materiais--------------------------------------------------------------------------------5
 Procedimento experimental-------------------------------------------------------5
Resultados e discussões-----------------------------------------------------------6
Conclusão------------------------------------------------------------------------------7
Referências----------------------------------------------------------------------------8
INTRODUÇÃO
O ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), é um método quantitativo em que a reação formada pela complexo antígeno-anticorpo é verificada através de atividade enzimática. Existem vários métodos que podem ser utilizados para a detecção dos resultados a exemplo de leituras visuais, fotométricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes.
 	O ELISA é um método amplamente utilizado em laboratórios de análises clínicas para pesquisa tanto de antígenos, quanto anticorpos. No caso de pacientes positivos, ou seja, possuem o antígeno ou anticorpo pesquisado, a reação enzimática característica do método acontecerá e será observada.
Uma das aplicações do ELISA é para o diagnóstico da doença de Chagas ou tripanossomíase. Caracterizada por ser uma Infecção endêmica, causada por um protozoário, o Trypanosoma cruzi, a doença de Chagas possui diagnóstico complexo, os sintomas mudam ao longo do curso da infecção. Na fase inicial, eles podem não estar presentes ou podem ser: febre, gânglios linfáticos aumentados, dor de cabeça e inchaço no local da mordida. Na fase aguda, apresenta diversos sintomas, desde febre e inchaço do fígado ou baço até, nos casos mais graves, intensa inflamação cardíaca. Pode também ser assintomática por anos, até que o indivíduo contaminado comece a apresentar distúrbios característicos da fase crônica, como arritmia, inchaço do coração, até outras cardiopatias.
Na fase crônica, os parasitas tornam-se raros na corrente sanguínea e, então, o diagnóstico deve-se basear em método indireto, verificando se o organismo está produzindo imunoglobulinas anti-T.cruzi. Os métodos empregados são: reação de fixação do complemento, hemaglutinação, imunofluorescência e ensaios imunoenzimáticos (ELISA).
Outra aplicabilidade do método é o diagnóstico de Hepatite C que possui a estimativa de que 3% da população mundial esteja infectada pelo vírus da hepatite C. São fatores de risco para a transmissão: transfusão de sangue ou seus componentes e os usuários de drogas, procedimentos odontológicos, médicos, tatuagem ou acupuntura. A cronificação da infecção ocorre em até 85% dos indivíduos, com evolução assintomática durante anos. Para o diagnóstico, a determinação do anti-VHC através do ELISA mostra-se muito sensível e a confirmação ocorre pela determinação do RNA-VHC.
OBJETIVO
Determinação de anticorpos IgG, no soro humano, por ensaio imunoenzimático (ELISA).
 MATERIAIS
	Nº
	 Descrição
Ç.çãLKM.,.M,ooo
	1
	Micropipeta
	2
	Micropoço com antígeno 
	3
	Solução de lavagem (Tampão)
	4
	Água destilada
	5
	Conjugado
	6
	Solução ‘STOP’
	7
	Becker
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
A solução de lavagem foi diluída com água destilada, os micropoços foram identificados de A a F
1 - Foram adicionados 20 µl do controle negativo nos 4 micropoços com controle negativo e nos micropoços com controle positivo.
2 – Foram aguardados 15min da encubação. Também foi diluído 1000 µl da solução em 20 ml de água destilada.
3 – O IgG começa a se ligar aos antígenos, neste momento foram transferidos 300 µl da solução de lavagem para cada micropoço que serão descartados no béquer repetimos o processo 3 vezes.
4 – Adicionar 100 µl do conjugado (solução que possui a enzima ligada ao anticorpo), em cada micropoço. O tempo real seria de 45 minutos, porém o processo foi realizado em 5 minutos.
5 – Transferimos 300 µl da solução de lavagem para os micropoços, descartamos no béquer e repetimos o processo três vezes.
6 – Foi transferido 100 µl do substrato com o cromógeno para cada micropoço e foi aguardado 15 minutos 
7 – A reação foi parada com 100 µl da solução STOP, que foi adicionada em cada micropoço, a solução desnatura proteínas.
8 – O material foi levado para leitura. 
 RESULTADOS E DISCUSSÕES
As colorações obtidas foram:
Rosa claro do micropoço A ao D;
Amarelo do micropoço E ao F;
A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presente no soro.
A absorbância ainda foi verificada na leitora de ELISA, utilizando a absorbância e apresentou os seguintes resultados.
1 - 0,209
2 - 0,174 NEGATIVO
3 - 0,219
4 - 0,185
5 – 0,815
6 – 1,161 POSITIVO
7 – 1,288
8 – 0,713
Uma vez que a quantidade de luz absorvida por uma amostra se refere à sua concentração, a absorbância foi utilizada para a quantificação. bem como em reações colorimétricas comuns, tais como testes ELISA. 
CONCLUSÃO
O teste de ELISA é simples, porém não é um método rápido. Para o teste realizado, houve reação alguma, pois houve coloração indicativa para a amostra positiva sendo conformada e quantificada na leitora de ELISA.
REFERENCIAS
BMG labtech - Leitor de Microplaca de absorbância. Disponível em <https://www.bmglabtech.com/pt/leitor-de-microplaca-de-absorbancia/> Acesso em 05/10/2018
Imunologia seminário ELISA. Disponível em <https://www.ebah.com.br/content/ABAAABan4AA/imunologia-seminario-elisa> Acesso em 05/10/2018
Tonelli, E., Melo L.. Doenças Infecciosas na Infância, 529-542