Via Glicolítica

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A via glicolítica, glicólise ou via de Embden-Meyerhoff
Glicólise é a sequência de reações que metabolizam uma molécula de glicose a duas de piruvato com a produção líquida de 2 ATP. É um processo anaeróbico. É um processo citosólico (enzimas dissolvidas no citoplasma). Em condições aeróbicas a glicose pode ser oxidada a CO2 e H2O, liberando muito mais ATP. Foi a primeira via metabólica elucidada. 
Outras contribuições dessas pesquisas:
•Desenvolvimento de métodos de purificação de proteínas. 
•Descoberta e reconhecimento da importância de coenzimas como NAD+ 
•Descoberta do papel essencial do ATP e outros compostos fosforilados. 
A glicose é o único combustível para: células sanguíneas, a medula renal, o sistema nervoso central, espermatozoides, tecidos anaeróbicos facultativos, tecidos vegetais modificados para a estocagem de glicose, algumas plantas aquáticas, muitos microrganismos anaeróbicos obrigatórios, etc. 
Em condições aeróbicas, a glicose pode fornecer 2840 kJ/mol.
Por que a glicose? 
Tem baixa tendência a reagir com aminoácidos para glicosilar proteínas (a glicosilação de proteínas altera a sua função).
Principais vias de utilização da glicose: 
Estocagem de energia na forma de amido, glicogênio e sacarose; presente na matriz extracelular e polissacarídeos da parede celular; oxidação pela via glicolítica: Piruvato; oxidação pela via das pentoses fosfato: Ribose 5 fosfato.
A entrada de glicose na célula pode ser por Transporte facilitado por GLUT (glucose transporters): 12 isoformas (funções iguais ou muito semelhantes, porém com estruturas diferentes):
•GLUT-1: eritrócitos e sistema nervoso central 
•GLUT-3: neurônios 
•GLUT-4: tec. adiposo e músculo esquelético (influência da INSULINA) 
Ou por Cotransporte (contra o gradiente; a entrada é acoplada à do Na+): enterócitos, túbulos renais, etc. 
	O transporte de glicose pode ser descrito por uma equação semelhante a de Michaelis-Menten:
V0 = Vmax [S]fora
 Kt + [S]fora
[S]fora = concentração extracelular de transporte
Kt = concentração de transporte – concentração de glicose fora da célula que leva a 50% da Vmax.
Os intermediários da glicólise são fosforilados para impedir a passagem pela membrana, pois a fosforilação dos intermediários da célula dificulta a sua saída, o que é uma vantagem (a célula não gasta energia para manter esses metabólitos no citoplasma). Também não existem transportadores de membrana para monossacarídeos fosforilados.
A fosforilação dos intermediários da glicose facilita o reconhecimento E-S e portanto a eficiência catalítica (os grupos fosfato interagem com Mg2+ e a maioria das enzimas da glicose liga favoravelmente o complexo P-Mg2+, alterando a velocidade e Km, com efeito positivo sobre a eficiência catalítica). 
Além disso, ajuda a conservar energia. 
4. A estratégia química da glicólise 
Adicionar grupos fosfato à glicose ; criar intermediários fosforilados com alto PTG (Potencial de Transferência de Grupo) = molécula de alta energia; acoplamento dos compostos de alta energia à síntese de ATP.
5. As fases da glicólise 
•Reações de 1 a 5: investimento de energia 
•Reações de 6 a 10: obtenção de energia 
	Primeira fase: investimento de 2 ATP;
	Segunda fase (primeira fosforilação): recupera os dois ATP’s investidos;
Segunda fase (segunda fosforilação): lucro de 2 ATP’s.
6. Reações da glicólise e regulação da atividade enzimática 
•Estágio preparatório ou de investimento 
Reação da hexocinase (primeiro investimento de energia)
A hexocinase é uma transferase e é a primeira enzima regulada da via (é regulada pelo próprio produto).
A reação da hexocinase é um ajuste induzido que tem como finalidade expulsar a água, pois se houver água ocorre a hidrólise do ATP, porém não ocorre a transferência do fosfato para a glicose.
A hexocinase tem 2 domínios, uma extremidade N-terminal e uma, C-terminal, ambas se relacionam entre si.
Isoenzimas da hexocinase: tem sítios catalíticos nas 2 extremidades; sítio catalítico apenas na porção C-terminal; o sítio catalítico que não funciona na catálise funciona na regulação.
A reação da hexocinase aceita outras hexoses (manose, frutose); a regulação (inibição) é feita pelo produto G6P; Km ~ 0,1 mM; nos eritrócitos, sua deficiência causa anemia hemolítica e aumento da afinidade por oxigênio. 
Reação da glicocinase ou hexocinase IV (enzima hepática, pancreática) 
Seu substrato preferido é a glicose, porém aceita outros.
A GK não tem regulação pelo produto G6P. 
Km ~ 10 mM (~100x maior do que da HK) – gera G6P na entrada da glicólise, possibilitando a síntese de glicogênio.
h = 1,7 (cooperatividade, mas é monomérica).
	A diminuição da concentração de glicose no sangue aumenta a velocidade da reação da hexocinase, enquanto a glicocinase só reage quando a glicose ultrapassa o normal, a última apresenta uma curva sigmoidal.
Nas células β do pâncreas, o aumento da sua atividade (velocidade da glicocinase) eleva a secreção de insulina.
Síntese: (+) insulina, frutose 2,6 bifosfato 
Defeitos congênitos: carência da GK ou atividade excessiva.
Mutações da GK; Diabetes tipo MODY 2 (Maturity-Onset Diabetes of the Young) – diminui a atividade, aumenta a glicemia, pois a insulina depende do sinal da glicocinase.
Regulação da glicocinase: a glicocinase é ligada a uma proteína reguladora e levada ao núcleo (sequestrada) quando há acúmulo de metabólitos do passo a frente da via glicosídica. Para voltar ao citoplasma deve haver queda da concentração de frutose-6-fosfato.
↑ [glicose]: dissociação da GK da proteína reguladora e a GK retorna ao citoplasma.
↑ [frutose 6P]: leva a GK a se ligar à proteína reguladora e migrar para o núcleo.
Nessa reação ocorre a segunda transferência de fosfato. Essa reação facilita a 2ª fosforilação que é feita para um álcool primário.
Fosfofrutocinase-1: o segundo investimento de ATP
É a mais regulada e mais importante enzima da via glicolítica.
A insulina estimula a síntese dessa enzima; o glucagon inibe a síntese dessa enzima; ocorre regulação alostérica: AMP, F2,6BP estimulam e ATP* e citrato inibem.
*o ATP pode se ligar ao sítio ativo (maior afinidade pelo ATP) ou ao sítio alostérico (menor afinidade pelo ATP). 
A relação da [ATP] com a [ ] dos seus produtos de hidrólise sinaliza “carga negativa”. Se aumenta [ATP], há a inibição da glicólise, enquanto se aumentar a [ADP] e/ou [AMP], ocorre o estímulo.
	A frutose-1,6-bifosfato é o principal regulador da fosfofrutocinase-1. A F26BP (frutose-2,6-bifosfato) é produzida e degradada por uma enzima bifuncional com 2 domínios:
PFK-2 (fosfofrutocinase-2) forma F26BP;
FBP-2 (frutose-bifosfatase-2) degrada F26BP.
	Quando uma dessas enzimas é ativada, a outra é inibida. O controle é feito por fosforilação (é reversível).
	Enzima bifuncional fosforilada: (-) PFH-2, (+) FBP-2, essa condição responde a elevação do glucagon.
	Enzima bifuncional desfosforilada: (+) PFH-2, (-) FBP-2, essa condição responde a elevação da insulina.
 Aldolase: a clivagem em duas trioses
Triose fosfato isomerase
Ao final da fase de investimento temos um saldo de -2 ATP / glicose
7. Estágio de obtenção de energia 
Lembrete: cada reação (f a j) acontece 2x por glicose, em virtude de termos 2 moléculas de gliceraldeído-3-fosfato
G3P desidrogenase: geração do primeiro composto de alta energia 
O NADH formado na reação da gliceraoldeído-3-fosfato desidrogenase tem 3 possíveis destinos:
- formar ATP na fosforilação na mitocôndria (até 2,5 ATP/NADH) – aeróbica;
- reduzir o piruvato a lactato na fermentação lática – anaeróbica;
- reduzir o acetaldeído a etanol na fermentação alcólica.
Intoxicação por arsênio
A reação da G3P desidrogenase é o local de ação do arsenato (AsO43-), análogo do fosfato. Participa como substrato (a própria enzima faz e não há participação de mitocôndria) formando 1-arseno-3-fosfoglicerato. 
A molécula é instável e hidrolisa rapidamente produzindo 3PG, produto da sétima reação e assim evitando a formaçãode ATP nessa reação, impedindo a formação líquida de ATP.
Fosfoglicerato cinase: geração do primeiro ATP
Síntese de 2,3-bifosfoglicerato (2,3-BPG): molécula regulatória do transporte de oxigênio
Fosfoglicerato mutase: a preparação do próximo composto de alta energia
Enolase: a síntese do segundo composto de alta energia.
A enolase produz fosfoenolpiruvato.
Inibição por fluoreto.
A última enzima também é regulada – diminuição da afinidade por O2 da hemoglobina; 
Piruvato cinase (segunda fosforilação) –enorme variação da energia devido a tautomerização (enol ↔ cetona).
Terceira enzima regulada da glicólise.
Regulação alostérica: 
Estimulado por AMP, F1,6BP* 
Inibido por ATP, Acetil-CoA, Alanina, AGCL 
*ativação por antecipação.
Regulação covalente por fosforilação (enzima do fígado = hepática): 
-fosforilada = inativa
- desfosofrilada = ativa
Saldo de ATP:
•2 ATP gastos na fase inicial 
•2 ATP formados na fase final x 2 = 4 
•Saldo = 2 ATP na condição anaeróbica 
A elevada taxa da glicólise em tumores facilita o diagnóstico e sugere alvos para quimioterapia. 
Aumento de ~10 x na captação e utilização de glicose em tumores.
8. Os destinos do piruvato
Efeito Pasteur 
Leveduras produzem mais etanol e consomem mais glicose em condições anaeróbicas, e ocorre a diminuição da taxa de consumo de glicose em condições aeróbicas.
Fermentação láctica
O lactato também influencia o transporte de Oxigênio.
No músculo: diminui a afinidade da mioglobina por O2.
No sangue: diminui e afinidade da hemoglobina por O2 = Efeito Bohr (pela liberação de prótons, H+).
E em peixes teleósteos = Efeito Root (para encher a bexiga natatória e com O2 e também oxigenar a retina).
“reciclagem” de NADH para NAD+
Fermentação alcoólica
Importante para a produção de bioetanol.
III. Metabolismo Aeróbico
Uma via de fermentação alcoólica alternativa: Entner-Doudoroff 
Exemplos: bactérias Gram negativas (Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium, etc,) e poucas Gram positivas. 
Na maioria dos casos os organismos que a usam são aeróbicos.
Outras fermentações: 
Clostridium acetobutyricum 
Amido → butanol e acetona 
Ex: produção de metanol, ácidos fórmico, acético, propiônico, butírico e succínico, glicerol, isopropanol, butanol, etc.
9. A entrada de monossacarídeos
Testes:
1. Qual das seguintes afirmações sobre a glicólise é correta? 
A) a conversão de glicose a lactato requer a presença de oxigênio – errado, não precisa de oxigênio.
B) a hexocinase é importante no metabolismo hepático somente após uma refeição – errado, sempre é importante.
C) a frutose 2,6 bifosfato é um importante inibidor da fosfofrutocinase-1 – errado, estimula.
D) as reações reguladas são aquelas irreversíveis – CORRETA.
E) a conversão de glicose a lactato fornece 2 ATP e 2 NADH – errada, 2 ATP e 2NAD+
 
2. a reação catalisada pela piruvato cinase: 
A) é ativada por concentrações elevadas de ATP e citrato – errado, não é ativado por ATP e citrato também não é.
B) usa frutose 1 fosfato como substrato – errado, não é intermediário da mesma via.
C) é uma reação limitante da velocidade da glicólise – CORRETA, pois é uma enzima regulada.
D) se encontra próxima do equilíbrio na maioria dos tecidos - errada, pois se estivesse em equilíbrio não teria ATP.
E) é inibida por frutose 2,6 bifosfato – errado, essa enzima regula a fosfofrutocinase-1.