Bioq - Aulas 01 e 02 (2)

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06/12/2013
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Instrumentação em Bioquímica 
Clínica
Prof. Dr. Killarney Ataide Soares
Espectrofotometria e Fotocolorimetria
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
II – Análises baseadas em propriedades da luz
2.1 – Radiações eletromagnéticas
- Luz: é uma radiação eletromagnética que se
propaga na forma de pulsos;
- A luz é uma energia que se propaga em pulsos;
- Cada cor de luz se propaga em ondas com
comprimento variável, dependendo da cor.
Figura 2: Espectro de absorção da radiação eletromagnética. Note a faixa do
vísível, ou seja, que pode ser percebida pelo olho humano.
Comprimento de 
onda (em nm)
... Lembrando que 1nm = 10-9m
Figura 3: Espectro de absorção da radiação eletromagnética da faixa do visível.
Quanto mais vermelha a luz, maior o seu comprimento de onda.
Comprimento de 
onda (em nm) ou λ
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Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
II – Análises baseadas em propriedades da luz
2.1 – Radiações eletromagnéticas
- Uso das propriedades da luz: fotometria e
espectrofotometria.
- Ambos os métodos buscam isolar partes do
espectro de luz;
- Tornam possíveis as dosagens bioquímicas.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
II – Análises baseadas em propriedades da luz
2.2 – Fotocolorimetria
- Fotometria: É um método para determinação
da quantidade de um analito por meio
intensidade da luz;
- O aparelho: fotocolorímetro;
- Para se isolar a luz usam-se filtros;
- Baseia-se na equação Lei de Lambert-Beer
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
II – Análises baseadas em propriedades da luz
2.3 – Espectrofotometria
- Fotometria: É um método para determinação
da quantidade de um analito por meio da
intensidade da luz;
- O aparelho: espectrofotômetro;
- Para se isolar a luz usa-se o prisma;
- Também baseia-se na equação Lei de
Lambert-Beer
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
- Lei de Lambert-Beer:
- Absorção: a luz que não é transmitida, é
absorvida pela solução (Absorbância)
A = a.b.c
Onde,
a = absorção; b = espessura da solução atravessada pela luz;
c = concentração da substância de interesse
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Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
- Lei de Lambert-Beer:
A = a.b.c
a e b são constantes (K). Somente c varia.
Portanto,
A = K.c
E quanto maior c, maior a sua absorbância.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
- Lei de Lambert-Beer:
“A intensidade da energia radiante
monocromática transmitida por uma solução
diminui exponencialmente com o aumento da
espessura da solução (Lambert) e com o
aumento da concentração ou intensidade de
cor da solução (Beer)”.
Figura 5: Gráfico da transmitância versus espessura de uma amostra. Quanto maior a
espessura, menor a transmitância, mas de maneira exponencial.
A relação entre a espessura com a
quantidade de luz que passa através
dessa amostra é conseguida pela
fórmula T = 2 – Log%T.
Não é uma relação direta! Ela tem de
ser convertida (por uma tabela) em
absorbância!
Figura 6: Gráfico da absorbância versus espessura de uma amostra. Quanto
maior a espessura, mais luz é absorvida, ou seja, maior a absorbância.
A relação entre a espessura
com a quantidade de luz que
é absorvida é conseguida
pela fórmula A = a.b.c
Com isso, temos uma relação
linear, direta entre a
absorbância e a
concentração de
determinada substância
numa amostra.
POR ISSO QUE NA
FOTOMETRIA/ESPECTROFO
TOMETRIA TRABALHA-SE
COM ABSORBÂNCIA
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Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
- É usada a luz monocromática (MC) de um λ
apenas. Porque?
Por 2 motivos:
1o – Razão qualitativa: O único modo de saber
quais as cores (comprimentos de onda) que
são absorvidos, é passar luz MC de vários
comprimentos de onda, uma de cada vez,
através da solução teste.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
Neste caso, quando a luz verde atinge a
solução, 90% dela é absorvida, o que fornecerá
um resultado mais sensível e confiável.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3 – Espectrofotometria/colorimetria
2.3.1 – Fundamento
2o – Razão quantitativa: Quando se está
medindo a luz absorvida, a passagem de
energia não absorvida irá
prejudicar a leitura.
A luz não absorvida chegará
à célula fotoelétrica influen-
ciando o resultado.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3.2 – Componentes de um fotômetro
a) MONOCROMADORES: FILTROS
(colorímetros) OU PRISMAS/GRADES DE
DIFRAÇÃO (espectrofotômetros)
- Têm a função de regular a transmissão da
luz, isolando um determinado comprimento de
onda.
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Figura 7: Prisma de vidro. Note a decomposição da luz branca (à esquerda) em
diversas luzes, de comprimento de onda diferente.
Figura 8: Atuação do monocromador (que pode ser um filtro ou um prisma). Note que
a luz que chega é branca (proveniente da lâmpada) e o monocromador apenas deixa
passar um único comprimento de onda (λ).
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3.2 – Componentes de um fotômetro
b) FONTE DE LUZ:
- É uma lâmpada que tem como função
fornecer uma luz (visível e invisível) que
passará através do monocromador e também
da amostra;
- Geralmente: lâmpada de tungstênio e de
iodeto.
- Duração: 2.000 – 3.000 horas.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3.2 – Componentes de um fotômetro
c) FENDA DE ENTRADA:
- Tem a função de limitar a entrada da luz
emitida pela fonte, evitando que ela se
disperse.
- Assim, o máximo de luz emitida passa pelo
monocromador e também na amostra;
- Luz desviada = erros na Lei de Beer.
Portanto, indica erro na leitura!
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Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3.2 – Componentes de um fotômetro
d) CÉLULAANALÍTICA OU CUBETA:
- É o pequeno recipiente que acomodará a
amostra no ato da passagem da luz.
- Deve ser o mais translúcido possível,
evitando interferências na passagem da luz.
- Cubetas sujas, arranhadas, manchadas = Luz
desviada = erros na Lei de Beer. Portanto,
indica erro na leitura! Figura 9: Cubetas para análise em espectrofotometria. Pode ser feita em vidro,
borossilicato, quartzo ou plástico.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
2.3.2 – Componentes de um fotômetro
e) GALVANÔMETRO:
- É um medidor da intensidade de baixa
corrente.
- Quando a luz que chega até a célula
fotoelétrica, o imã tem seu campo magnético
alterado, fazendo se mover o ponteiro.
- Quanto menos luz chega à célula fotoelétrica,
indica maior absorbância e maior concentração
da substância na solução. Figura 10: Esquema representativo de um galvanômetro e a escala do mostrador
analógico. Nos aparelho atuais de espectrofotometria, os mostradores são digitais.
Imã
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Figura 15: Espectrofotômetro da marca Klett. Praticamente o primeiro do gênero a ser
usado em laboratórios de análises clínicas no Brasil, no início dos anos 80.
Figura 16: Espectrofotômetro de feixe único (marca Coleman). Um dos primeiros
modelos utilizados no Brasil, em laboratórios de análises clínicas.
Figura 17: Outros modelos de espectrofotômetros utilizados em laboratórios de
menor porte.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
3. Fotometria de chama
Lítio (Li), Sódio (Na), Potássio (K) e Magnésio
(Mg), pois produzem luz de determinado
comprimento de onda.
- É o método de dosagem em que a excitação
de elétrons se dá pela energia na forma de
calor.
- Usado para dosagens de átomos de
elementos metálicos:
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Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
3. Fotometria de chama
3.1 – Fundamento
a)Produzir átomos a partir de uma amostra, mas na
fase gasosa;
b)Excitar os átomos queestão em estado
fundamental;
c)Medir a quantidade de luz emitida no comprimento
de onda característico.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
3. Fotometria de chama
3.1 – Fundamento
Excitação Emissão
Excitação
EmissãoÍon sódio
Íon potássio • Os átomos, quando
excitados, tendem a voltar
ao estado original (E0),
causando emissão de luz.
• Cada elemento químico
emite luz de comprimento
de onda diferente.
• A quantidade de luz é
proporcional à
quantidade de átomos na
amostra.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
3. Fotometria de chama
3.2 – Partes componentes
a) GASES: ideal é a mistura de H e O. Usam-
se também o propano, o acetileno e,
principalmente, o gás natural (GLP).
- A chama deve ser constante.
b) ATOMIZADOR: também chamado de
queimador. Tem a função de dividir a solução
em pequenas gotas para que os átomos
absorvam energia calórica e se excitem.
Instrumentação em 
Bioquímica Clínica
3. Fotometria de chama
3.2 – Partes componentes
c) MONOCROMADOR: semalhante ao do
espectrofotômetro. Tem a função de isolar o λ
de interesse da luz antes de passar no
detector.
d) DETECTORES: também funcionam como
nos espectrofotômetros. São responsáveis
pela captação da luz emitida pelos íons
pesquisados.
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Figura 18: Esquema de funcionamento de um fotômetro de chama. Figura 19: Modelos de fotômetro de chama.
Níveis de automação
em Bioquímica Clínica
Prof. Dr. Killarney Ataide Soares
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
- Automação: aplicação da tecnologia na
produção de resultados no laboratório;
- Os pioneiros: contadores de células
(hematologia) e analisadores bioquímicos;
- Câmara Neubauer x contadores;
- Evolução dos aparelhos e a evolução da
informática.
I – Introdução
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
- Escola de Medicina de Kochi (Japão): Dr.
Sasaki e colaboradores;
- Sistema com braços mecânicos que moviam
as amostras até o nível do equipamento;
- Primeiros equipamentos: década de 90;
- Variações: “hardware” e na interface do
“software”com participação de diversas
grandes empresas.
II – Histórico
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
- Ferramenta para gerenciar, armazenar,
editar e inserir dados dos pacientes e dos
exames;
- Programas (“softwares”): criam tabelas
(bancos de dados) com os dados inseridos;
- Requerem sistema operacional compatível:
Windows®, DOS, Linux (e suas variações) e
MAC-OS.
III – Sistema de informação laboratorial
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
- Aquisição:
+ Sob medida: utilizando, por exemplo
programas como o Microsoft Acces®. É mais
caro.
+ Pronto: empresas especializadas, com
pagamento único (aquisição) ou mensal
(“manutenção” da licença de uso).
Ex: X-Clinic, Labol, Esmeralda, LabPro etc.
III – Sistema de informação laboratorial
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
IV – Níveis de automação
4.2 – Semi-automática
4.3 – Automática
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
- Primeiro nível;
- Caracteriza-se pela participação do técnico
em todas as etapas.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 - Manual
- Participação do técnico em todas as etapas:
A) Separação da vidraria e organização da bancada de trabalho;
B) Pipetagem das amostras;
C) Pipetagem dos reagentes;
D) Incubação em banho-maria;
E) Pipetagem do segundo reagente;
F) Calibração do aparelho;
G) Dosagem do padrão;
H) Dosagem da amostra;
I) Cálculo da dosagem;
J) Passagem dos resultados para planilha ou caderno;
K) Inserção dos resultados no programa.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
VANTAGENS
- Menor investimento;
- Aprendizagem e familiarização com a
metodologia da dosagem;
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
DESVANTAGENS
- Repetibilidade � rotina, LER/DORT;
- Toda etapa é potencial fornecedora de erros;
- Subjetividade: cada técnico pode ter sua
forma de trabalho, ocasionando resultados
pouco homogêneos.
IV – Níveis de automação
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
DESVANTAGENS
- Mais vidraria a ser usada, suja e, portanto, a
ser lavada;
- Maior possibilidade de
contaminação/acidentes de trabalho;
- Uso de maior volume de amostras e
reagentes � maior quantidade de resíduos.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
DESVANTAGENS
- Trabalho por “batelada” (todos os exames de
um tipo apenas devem ser realizados de uma
vez);
- Repetições, se necessárias, também serão
manuais;
- Mobilização de um técnico exclusivo;
- Demora na emissão dos resultados.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
4.1.1 - Equipamentos
- Fotocolorímetros e espectrofotômetros mais
antigos.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
IV – Níveis de automação
4.2 – Semi-automática
4.3 – Automática
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
- Segundo nível;
- Intermediário: entre o manual e o totalmente
automatizado;
- Pequena redução nas etapas onde o técnico
atua diretamente;
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
- Participação do técnico na maioria das
etapas:
A) Separação da vidraria e organização da bancada de trabalho;
B) Pipetagem das amostras;
C) Pipetagem dos reagentes;
D) Incubação em banho-maria;
E) Pipetagem do segundo reagente;
F) Dosagem da amostra;
G) Passagem dos resultados para planilha ou caderno;
H) Inserção dos resultados no programa.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
- Neste nível as seguintes etapas são
realizadas pelo aparelho:
+ Calibração do aparelho;
+ Dosagem do padrão;
+ Cálculo da dosagem.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
VANTAGENS
- Baixo custo do aparelho: 5.000 – 10.000 R$;
- Maior interação com a técnica;
- Menor possibilidade de erros: a calibração é
realizada pelo próprio aparelho;
- Maior rapidez na emissão dos resultados
(quando comparado com o nível manual).
IV – Níveis de automação
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
DESVANTAGENS
- Mais vidraria a ser usada, suja e, portanto, a
ser lavada;
- Maior possibilidade de
contaminação/acidentes de trabalho;
- Uso de maior volume de amostras e
reagentes � maior quantidade de resíduos.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
DESVANTAGENS
- Trabalho por “batelada”;
- Repetições, se necessárias, também serão
manuais;
- Mobilização de um técnico exclusivo.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.2 – Semi-automático
4.2.1 - Aparelhos
- Espectrofotômetros atuais, fotômetros de
chama, “automatizadores” de urina e de
esperma.
- Praticamente todos têm pequenas
impressoras, evitando o registro instantâneo.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.1 – Manual
IV – Níveis de automação
4.2 – Semi-automática
4.3 – Automática
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
- É o terceiro nível;
- O mais complexo: automático (aparelho) e
plenamente automatizado (aparelho +
processo dos resultados).
- O técnico participa ativamente de poucas
etapas.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
- Participação do técnico em poucasetapas:
A) Processamento da amostra;
B) Inserção da amostra no aparelho (diretamente – tubo primário – ou
em cubetas de plástico);
C) Passagem dos resultados para planilha ou caderno*;
D) Inserção dos resultados no programa*.
* Etapas inexistentes do sistema plenamente automatizado.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3.1 – Automação plena
- Envolve não apenas os aparelhos, mas
também toda o sistema de informação
laboratorial;
- É a interação do sistema de informação
(programa) com os aparelhos =
INTERFACEAMENTO;
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3.1.1 - Interfaceamento
- “Os aparelhos (PC e de dosagens) conversam
entre si”;
- A linguagem: códigos binários;
- Interferência humana ocorre apenas:
1) No momento do atendimento ao paciente
(inserção dos dados);
2) Na inserção da amostra no aparelho;
3) Na liberação do resultado definitivo.
IV – Níveis de automação
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3.1.1 - Interfaceamento
Como o aparelho reconhece qual a amostra é
de quem e quais os exames a serem
realizados?
IV – Níveis de automação
R: Cada tubo é identificado com uma etiqueta
com código de barras, exclusivos para cada
paciente.
R: Os aparelhos devem possuir um leitor de
código de barras.
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3.1.1 - Interfaceamento
- Após a emissão dos resultados, o técnico
libera ou não o resultado que segue para o
programa.
IV – Níveis de automação
- A conferência dos laudos pode ser feita
digitalmente (assinatura digital).
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3.1.2 – Esteiras/Módulos
- Tecnologia de última geração;
- Único contato humano: na coleta;
- A amostra é identificada e entra num sistema
de esteira com estações de trabalho;
- A amostra é rastreada todo o tempo;
- Algumas esteiras têm centrífugas.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
VANTAGENS
- Repetibilidade;
- Diminuição das etapas manuais e, portanto,
dos erros (troca de amostras, anotação
errada, digitação errada etc.);
- Economia de reagentes;
- Requer pequeno volume de amostras;
IV – Níveis de automação
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
VANTAGENS
- Um técnico é capaz de liberar enorme
quantidade de resultados;
- Rapidez: 100 a 1.000 testes/ hora!
- Calibrações: apenas semanal,
quinzenalmente ou quando há mudanças de
lotes nos kits.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
VANTAGENS
- Menor possibilidade de
contaminações/acidentes de trabalho;
- As repetições são realizadas
automaticamente, quando necessárias;
- Aparelhos são randômicos: resultados por
paciente (e não por exames);
- Possibilitam exames de emergência.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
DESVANTAGENS
- Custo altíssimo: entre 50.000,00 e 350.000,00
R$ de um aparelho;
- Programa do laboratório: entre 70 e 100,00 R$
por computador/mês;
- Custo alto se paga apenas com grande
demanda: a partir de 60 pacientes/dia ou 300
exames/dia.
IV – Níveis de automação
Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
DESVANTAGENS
- Pouca interação com a técnica;
- Manutenção mais cara. Como saída, usa-se o
comodato*.
* Modalidade de contrato em que o contratante não adquire o
aparelho, apenas fica com o mesmo, temporariamente,
enquanto compra os kits da empresa que cedeu o aparelho.
- Necessidade de estação de tratamento água.
IV – Níveis de automação
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Níveis de automação em 
Bioquímica Clínica
4.3 – Automático
4.3.2 - Aparelhos
- São imensas as opções no mercado: marcas,
número de exames/hora, sistema fechado ou
aberto (aceita ou não qualquer kit), aceita ou
não o interfaceamento, variabilidade de
exames, de rotores ou esteiras, separados ou
em módulos etc.
IV – Níveis de automação