Tecnicas de DNA Recombinante

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Prof. MsC. Moezio de Vasconcellos Costa Santos Filho
Maceió - 2014
TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
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HISTÓRICO
Watson & Crick
Estrutura do 
química do DNA 
(1953)
Tecnologia DNA recombinante
Insulina recombinante
(1978)
Ian Wilmut
clonagem de mamífero
(1997)
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HISTÓRICO
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→ DNA Polimerase;
→ RNA Polimerase;
→ DNA Helicase;
→ Endonuclease de Restrição;
 (Sítio-específicas)
→ DNA Ligase;
→ Taq DNA Polimerase;
→ Poli-A Polimerase;
→ DNAses/Nucleases.
 (sem sítios específicos)
ENZIMAS
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PCR (Polymerase Chain Reaction)
Fundamentos e objetivos
Amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro;
Resolução dos problemas da baixa quantidade e degradação;
Amplificação exponencial por alteração de temperatura.
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PCR (Polymerase Chain Reaction)
Etapas
Desnaturação: “double strand” separadas (95°C);
Anelamento: Ligação dos primers na “single strand” (56°C);
Extensão: Produção da fita complementar pela DNA-polimerase (72°C).
Vídeo
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→	Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima.
 → Descritas em 1970,
Endonucleases de Restrição
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→	Bam HI - Bacillus amyloliquefaciens 
5’ G/GATCC 3’
→	Eco RI - Escherichia coli 
5’ G/AATTC 3’
→	Hae III - Haemophilus aegyptius
5’ GG/CC 3’
→	Pst I - Providencia stuartii
5’ CTGCA/G 3’
 → Nomenclatura
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 370 C, 1 hora, com tampão adequado
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Extremos rombos
Extremos coesivos
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Clonagem Molecular
→	Utilização de bactérias;
→	Plasmídeos como alvos;
→	Endonucleases de restrição;
→	Clonagem de genes responsáveis por proteínas importantes ou escassas em determinado organismo.
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Clonagem Molecular
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→	É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA.
CLONAGEM MOLECULAR
Vídeo
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→ Nem todas as proteínas são como a insulina;
→ As membranas são impermeáveis a grandes moléculas.
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1- 	O gene deve ter sido bem caracterizado (clonado e amplificado). Deve está disponível em forma pura;
2-	Deve está disponível um método eficiente para introduzir o(s) gene(s) nos tecidos ou células desejadas;
3-	Os riscos da terapia gênica para o paciente devem ter sido cuidadosamente avaliados e demonstrados como mínimos;
4-	A doença não deve ser tratável por outras estratégias;
5-	Devem estar disponíveis dados de experimentos preliminares com modelos animais ou células humanas e deve ser indicado que a terapia gênica proposta deve ser eficaz.
Devido a morte por terapia gênica
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			 Figura 17.8
Obs.: Células Somáticas
Não cura a doença, 
somente a controla
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			 Figura 17.13
Obs.: Transgene
→ hGH
→ Fator VIII
→ Insulina
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 Microinjeção de DNA
			 Figura 17.14
			
Ocorre em células germinativas
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G0 → DNA inserido antes da fusão nuclear 			(Mosaicos Genéticos)
			
			
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G1 → Transgene em todas as células
			
			
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		 Antes da Terapia Gênica
		 → hGH
		 → Bovinos e suínos incompatíveis;
		 → Primatas e cadáveres humanos compatíveis.
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 Plantas
→ Células vegetais → Totipotência;
→ Retorno ao estado embrionário;
→ Não existe separação em linhagem germinativa e células somáticas.
 Agrobacterium tumefaciens
→ Sistema natural de Engenharia Genética;
→ Plasmídeo Ti;
→ T-DNA.
 
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17.16
 Bombardeio de microprojéteis;
 Eletroporação.
 Transformação mediada por
 Agrobacterium tumefaciens.
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→ T-DNA - Atinge cromossomos vegetais causando o tumor;
→ Células com T-DNA - sem controle de divisão;
→ Identificação dos genes tumorais em T-DNA
				Figura 17.18
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				Figura 17.17
200 kb
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