aula_HPLC2

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Vantagens da HPLC
Versatilidade
Sensibilidade
Resultados quantitativos
Espécies não-voláteis e termolábeis
Automatização
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO
Resolução é baseada no tamanho efetivo dos componentes da amostra:
limite de permeação: abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material
limite de exclusão: acima do qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar os poros
somente podem ser separadas as moléculas que se encontram dentro dos dois limites
Otimização com um solvente orgânico
A primeira mistura que deve ser tentada é acetonitrila (ACN) água.
A ACN tem baixa viscosidade e permite detecção no UV baixo 190 nm.
 O metanol é a segunda escolha como solvente orgânico, maior viscosidade e UV 205 nm. 
O tetrahidrofurano (THF) é a terceira pois possui uma faixa de UV menos útil, é lentamente degradado pela oxidação e se equilibra mais lentamente com a fase estacionária. 
As condições gerais estão apresentadas na tabela a seguir:
ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espécies MM>104: cromatografia por exclusão
espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica
espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga)
espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos)
TROCA IÔNICA
PARTIÇÃO
ADSORÇÃO
fase normal
fase reversa
EXCLUSÃO
filtração em gel
permeação em gel
insolúvel em água solúvel em água
não-polar iônico 
polar não-iônico 
POLARIDADE DO SOLUTO
102
103
104
105
106
massa molecular
aplicações
Instrumentação para HPLC
Fase móvel
Injetor 
Instrumentação para HPLC
Instrumentação para HPLC
Características da fase móvel
Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação
Dissolver a amostra sem decompor seus componentes
Não decompor ou dissolver a fase estacionária
Ter baixa viscosidade
Compatível com o tipo de detector
Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.
Instrumentação para HPLC
Sistema de bombeamento
REQUISITOS:
Pressões de até 6000 psi (~400 atm)
Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas) e
Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %
Inércia química: componentes resistente à corrosão
Sistema de bombeamento
Tipos de bombas:
Pneumática
Deslocamento
Recíproca
Bomba pneumática
 Vantagens:
Baixo custo
Livre de pulsações
 Desvantagens:
Baixa pressão (até 2000 psi)
Baixo volume
Não permite gradiente
Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel
Bomba de deslocamento
Vantagens:
Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel
Livre de pulsações
Desvantagens:
Baixo volume
Não permite gradiente
Bomba recíproca
 Vantagens:
Pressão elevada (até 10 000 psi)
Pequeno volume interno (35 a 400 µL)
Permite gradiente
 Desvantagem:
Fluxo pulsado
Alto custo
Instrumentação para HPLC
Sistema de Injeção
Loop de 0,5 a 500 L
Permite operar até 7000 psi
Reprodutível
Sistema de Injeção
Instrumentação para HPLC
Coluna
 Geralmente em aço inox
Coluna de vidro reforçado (até 600 psi)
Coluna empacotada
Preço: > US$ 200.00
Pré-coluna
 Pequena e de constituição similar à da coluna analítica
 Retém:
Material particulado
Contaminantes do solvente
Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária.
 Custo reduzido
Instrumentação para HPLC
Características de um detector
Sensibilidade e seletividade adequada
Ampla faixa linear
Baixo volume interno
Resposta Rápida
Boa estabilidade e reprodutibilidade
Não destruir a amostra
Características de um detector
 Sensibilidade adequada
Nem sempre é desejável alta sensibilidade
A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra.
Características de um detector
 Seletividade adequada
 Detector seletivo:
Permite detectar uma de duas ou mais espécies que co-eluam.
 Em geral, melhor linha base.
 Detector não seletivo:
Uso universal
Características de um detector
Linearidade por várias ordens de grandeza
Faixa linear é aquela região da curva de calibração que se ajusta bem a uma reta.
	Uma ampla faixa linear permite:
maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra.
acomodar em uma mesma corrida cromatográfica picos referentes a espécies de concentrações muito diferentes.
Características de um detector
 Baixo volume interno
O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde.
 Grande volume  alargamento dos picos registrados.
Características de um detector
 Resposta Rápida
 O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector).
 Detector lento  picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
Características de um detector
 Boa estabilidade e reprodutibilidade
Alta confiabilidade e facilidade de uso
 Não destruir a amostra para:
Permite coletar o eluato
Utilizar um segundo tipo de detector
Detector por espectrofotometria UV-visível
Detector por espectrofotometria UV-visível
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
Detector por espectrofotometria UV-visível
Princípio de operação
Absorvância de luz na faixa UV-visível
tipo
Seletivo, depende de propriedades do composto
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-9
Sensib. a temperatura
Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos que absorvem no selecionado
Detector por fluorescência
Detector por fluorescência
Princípio de operação
Excitação com luz produz emissão fluorescente
tipo
Altamente seletivo
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-9(excitação a laser: 10-12)
Sensib. a temperatura
Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por índice de refração
Detector por índice de refração
Princípio de operação
Mudança no índice de refração da fase móvel
tipo
Universal, depende de propriedade da f. móvel
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-7
Sensib. a temperatura
alta
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Geral
Detector eletroquímico
Princípio de operação
Oxidação ou redução em potencial fixo
tipo
Seletivo, depende de propriedades do composto
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-12
Sensib. a temperatura
Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Espécies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade elétrica
Detector por condutividade elétrica
Princípio de operação
Condutividade elétrica devida a presença de íons
tipo
Seletivo, depende de propriedades do composto
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-8
Sensib. a temperatura
Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Soluções aquosas com compostos iônicos
 Líquido líquido: liquido depositado fisicamente sobre uma superfície sólida. Ex: água sobre sílica ou alumina.
 Fase ligada: Ligações covalentes. Ex: Si-O-(CH2)17CH3 (RP-18).
Cromatografia de partição
Cromatografia de partição
 Mais de 90% das análises atuais são realizadas com fase ligada.
Fase normal x Fase reversa
Fase normal: 
fase estacionária polar;
fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);
solutos neutros;
polaridade soluto  t. retenção;
mecanismo retenção: adsorção
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é
chamado de fase normal
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição
Polaridade do soluto: a > b > c
c
b
a
tempo
c
b
a
tempo
Polaridade da fase móvel
Partícula de sílica
Fase Normal
Si
OH
silanol livre
••
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
Ciano (-C2H4CN)
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
Amina (–C3H6NH2)
R = 
Fase normal x Fase reversa
Fase reversa: 
fase estacionária apolar;
fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);
solutos apolares, não-iônicos;
polaridade f. móvel  t. retenção;
mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.
Fase estacionária
Fase ligada
Fase estacionária
Fase ligada
CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-R3 + HCl
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
soluto
cadeias do hidrocarboneto (C18)
partição (solubilização)
Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto devido aos sítios ativos (silanóis residuais)
A sílica tem aproximadamente 8M de grupos Si-OH por m2. A cobertura superficial por silanização esta limitada a 4 M devido a efeitos estéricos. Os Si-OH restantes são prejudiciais causando alargamento das bandas devido a polarização da superfície. Principalmente na análise de analitos básicos. Reação com trimetilsilano (efeito estérico reduzido -CH3) minimiza o problema (encapados) 
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição
Polaridade do soluto: a > b > c
a
b
c
tempo
a
b
c
tempo
Polaridade da fase móvel
Separação isocrática e por gradiente
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição
Polaridade do soluto: a > b > c
a
b
c
tempo
a
b
c
tempo
Polaridade da fase móvel
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Pode haver várias formas de se separar um dado conjunto de analitos, entretanto algumas informações são essenciais para determinação do modo de operação
ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espécies MM>104: cromatografia por exclusão
espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica
espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga)
espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos)
TROCA IÔNICA
PARTIÇÃO
ADSORÇÃO
fase normal
fase reversa
EXCLUSÃO
filtração em gel
permeação em gel
insolúvel em água solúvel em água
não-polar iônico 
polar não-iônico 
POLARIDADE DO SOLUTO
102
103
104
105
106
massa molecular
Desenvolvimento de métodos para 
separações em fase reversa
A RP é adequada para separar misturas neutras de baixo peso molecular ou compostos orgânicos carregados. Se os isômeros não ficarem bem separados, é recomendada a cromatografia em fase normal, porque os solutos possuem interações mais específicas e mais fortes com a fase estacionária.
Critérios para uma separação adequada
0,5 < k < 20
Se tm (t0) não pode ser observado pode ser estimado por:
L comprimento da coluna, dc diâmetro da coluna e F vazão 
Resolução > 1,5 (para quantificação)
Otimização de dois ou três solventes orgânicos
Otimizado
30 % ACN 70 % tampão
Otimizar sistematicamente
ACN : tampão
32% de THF
Tentativa e erro
40 % MeOH
22% de THF
nomógrafo
Nomógrafo
Separação por gradiente
Volume de residência: volume no qual são misturados os solventes e o início da coluna. Variam de 0,5 a 10 ml em diferentes sistemas.
Se o volume de residência for 5 ml numa vazão de 1 ml/min o tempo de residência tD é 5 minutos. Uma mudança de solvente iniciada em 8 minutos não alcança a coluna até 13 minutos.
Medida de tD
Inicialmente vimos separação de 8 analitos que necessitou de cerca de 120 minutos. Enquanto a força do solvente foi suficientemente baixa para resolver os dois primeiros pico 2 e 3 a eluição do último pico foi muito lenta.
Para manter a resolução desejada, mas diminuir o tempo de análise foi selecionado o modo de gradiente segmentado. Os picos 1 a 3 foram separados com uma força de eluente baixa (B a 30%). Entre t = 8 e 13 min. B aumentou linearmente de 30 para 455 para eluir os picos do meio. Entre t = 28 e 30 min B aumentou de 45 para 80 % para eluir os picos finais.
Use um gradiente se
Use a eluição isocrática se
Uma mistura de 14 compostos foi submetida a uma separação por gradiente RP, indo de 5 a 100 % de ACN com um tempo de gradiente de 60 min. A amostra foi injetada em t = tempo de residência . Todos os picos foram eluídos entre 22 e 41 min.
A mistura é adequada para eluição isocrática ou por gradiente?
Se a próxima corrida for um gradiente, selecione a porcentagem inicial e final de solvente e o tempo de gradiente. 
a)
40 a 70 em 60 minutos
b)
Avaliar k, Rs para tentar reduzir o tempo
Gravity Chrom.
Tsvett, 1903
Flash Chrom.
1978
HPLC 1952
UPLC 2004
(TLC) Paper
Chrom.
E a História continua ...
CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO – sólido líquido
Si
OH
silanol livre
Si
OH
silanol germinal
HO
Si
OH
silanóis associados
Si
OH
soluto
••
adsorção
(pontes de H)
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
sítios ativos mais comuns nos trocadores de cátions:
grupo ácido sulfônico -SO3-H+ (ácido forte) e grupo ácido carboxílico –COO-H+ (ácido fraco)
sítios ativos mais comuns nos trocadores de ânions:
grupos amina terciária –N(CH3)3+OH- (base forte) e grupos amina primária –NH3+OH- (base fraca)
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
Quando um trocador iônico de ácido sulfônico é colocado em contato com uma solução aquosa contendo o cátion C, o equilíbrio de troca estabelecido é o seguinte:
x RSO3-H+ + Cx+  (RSO3-)xCx+ + x H+
 sólido solução sólido solução
analogamente, um trocador de ânions interage com o ânion A segundo a reação:
y RN(CH3)3+OH- + Ay-  (RN(CH3)3+)yAy- + y OH-
 sólido solução sólido solução
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
FASES MÓVEIS MAIS COMUNS:
soluções aquosas que podem estar tamponadas ou conter quantidades moderadas de um solvente miscível com água
força e seletividade são moduladas pelo tipo e concentração dos aditivos (sal e solvente)
FASES ESTACIONÁRIAS MAIS COMUNS:
resinas de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, na qual são ligados grupos iônicos
micropartículas porosas de sílica recobertas com filme do trocador
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
em colunas supressoras de eluente
escolha óbvia: detectores por condutividade que são altamente sensíveis, universais para espécies carregadas, respondem de forma previsível a mudanças de concentração; simples de construção e manutenção barata, fáceis de serem miniaturizados e comumente funcionam por longo tempo sem problemas
limitação séria: era necessária uma alta concentração do eletrólito (fase móvel) para eluir a maioria dos analitos
iônicos em um tempo razoável; como conseqüência, a condutividade dos componentes da fase móvel tendia a sobrepujar a dos analitos, reduzindo acentuadamente a sensibilidade do detector
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
em colunas supressoras de eluente
o problema da alta condutância do eluente foi resolvido com a introdução da chamada coluna supressora de eluente, posicionada imediatamente após a coluna analítica de troca iônica
a coluna supressora é recheada com uma segunda resina de troca iônica que efetivamente converte os íons da fase móvel a espécies moleculares de ionização limitada, sem afetar os íons do analito
REAÇÃO NA COLUNA SUPRESSORA
quando cátions (analito) estão sendo separados, freqüentemente é utilizado HCl como reagente eluente e a coluna supressora é uma resina de troca aniônica na forma de hidróxido
o produto da reação no supressor é água
H+(aq) + Cl-(aq) + Resina+OH-(s)  Resina+Cl-(s) + H2O
REAÇÃO NA COLUNA SUPRESSORA
na separação de ânions (analito), eluentes comuns são carbonato ou bicarbonato de sódio e a coluna supressora é um trocador de cátions na forma ácida
Na+(aq) + HCO3-(aq) + Resina-H+(s) 
 Resina-Na+(s) + H2CO3
O EFEITO DA SUPRESSÃO
amostra: F-, Cl-e SO42-
eluente: NaOH
coluna analítica: troca aniônica
coluna supressora: troca catiônica
NaF, NaCl e Na2SO4 em NaOH
HF, HCl e H2SO4 em H2O
Na+ (lixo)
H+ (regenerador)
tempo
S
F-
Cl-
SO42-
S
F-
Cl-
SO42-
ruído
SEM SUPRESSÃO
SUPRESSÃO
QUÍMICA
contra-íons
OH-
H+
O EFEITO DA SUPRESSÃO
condutância do eletrólito (microSiemens, S)
 (+ + -) C
G =
 1000  
concentração (mol/L)
constante da cela (cm-1)
condutância equivalente iônica (S.cm2/eq)
Supressor-H+ + NaOH 
Supressor-Na+ + H2O
exemplo
eluente: 5 mmol/L
Na+ = 50 S.cm2/eq
OH- = 198 S.cm2/eq
 = 10 cm-1
G = (50+198).5x10-3/104 = 124 S
GH2O = 0,05 S
O EFEITO DA SUPRESSÃO
 (+ + -) C
G =
 1000  
Na+ = 50 S.cm2/eq
H+ = 380 S.cm2/eq
F- = 55 S.cm2/eq
Cl- = 76,3 S.cm2/eq
1/2SO42- = 79,8 S.cm2/eq 
 = 10 cm-1
GNaCl = (50+76,3).1x10-3/104 = 12,6 S
GHCl = (380+76,3).1x10-3/104 = 45,6 S
NaF, NaCl e Na2SO4 em NaOH
HF, HCl e H2SO4 em H2O
condutância da banda do cloreto aumenta 3,6 vezes após supressão
após supressão
exemplo
analito: 1 mmol/L
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
regeneração das colunas supressoras
inconveniente do uso de colunas supressoras: necessidade de regeneração periódica (8-10h) para converter a coluna a sua forma original ácida ou básica
uso de duas colunas supressoras: enquanto uma das colunas é usada como supressora (retém Na+, supressor-Na+), a outra é condicionada pela passagem do eluente (HX, supressor-H+); quando a primeira coluna satura (7-12h), uma válvula dirige o fluxo para a segunda coluna e assim sucessivamente, e novamente o sistema pode ser usado por mais 7-12 h.
membrana supressora
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
membrana supressoras
ELUENTE
ELUENTE
RSO3H
RSO3H
RSO3H
RSO3Na
RSO3Na
RSO3Na
canal externo
membrana permeável
canal do eluente
resina de troca catiônica forte
R = alquilbenzeno de cadeia longa
tubo
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
membranas supressoras
coluna analítica
pré-coluna
injetor
reservatório do eluente
SISTEMA DE REGENERAÇÃO
coluna supressora (membrana)
bomba para regenerante
bomba para eluente
detector
RSO3Na
RSO3H
R = alquilbenzeno de cadeia longa
RSO3H
coluna de troca catiônica
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
em coluna única
equipamentos onde nenhuma coluna supressora é usada
abordagem depende de pequenas diferenças de condutividade entre íons eluídos e os íons do eluente
para amplificar essas diferenças são usados trocadores de baixa capacidade, tornando possível a eluição de espécies de baixa condutância equivalente
um pouco menos sensível e tem uma faixa mais limitada do que a cromatografia com coluna supressora
Fase estacionária
Bioafinidade:
fase estacionária: ligantes específicos;
fase móvel: tampões;
mecanismo de retenção: interações por bioafinidade (chave-fechadura);
Aplicação: proteínas, hormônios, antígenos, anticorpos, ácidos nucleicos.
Fase estacionária
Colunas quirais:
fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa;
fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais;
Fase estacionária
Colunas quirais:
Colunas para HPLC
Figura: colunas utilizadas para análise de preparações farmacêuticas segundo a 
USP XXV (n=35).
Espectrometria de massa
	Ferramenta analítica capaz de medir a massa molecular de um ou mais compostos
Composição elementar das amostras
Estruturas de moléculas inorgânicas, orgânicas e biológicas
Composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas
Estrutura e composição de superfícies sólidas
Razões isotópicas de átomos nas amostras
Watson, J.T., Introduction to mass spectrometry. 3 ed. 1997
1º espectrômetro de massa
J.J. Thomson (1913)
http://masspec.scripps.edu/MSHistory/histpers.php
PARÁBOLA ESPECTROGRÁFICA
Íons separados pelas suas diferentes trajetórias parabólicas em campos eletromagnéticos e a detecção era feita através de chapas fotográficas
Espectrômetro de massa
Introdução da amostra
Fonte 
de íons
Filtro de 
massas (m/z)
Detecção
Vácuo
Diagrama em blocos de um espectrômetro de massas.
http://www.asms.org
geração de íons na fase gasosa a partir das amostras
íons gerados na fonte são separados de acordo com sua relação m/z
Quantificação dos íons que passam pelo filtro de m/z
Diagrama em blocos de um espectrômetro de massas.
local onde a amostra é exposta à fonte de inonização
Electrospray (ESI)
Principais características
ocorre à pressão atmosférica;
transferência de uma molécula carregada em fase líquida para a fase gasosa;
técnica de ionização “suave” que permite que as interações não covalentes entre moléculas que estão em solução sejam preservadas na fase gasosa;
amostras devem ser solúveis em solventes de baixo ponto de ebulição;
[M+H]+ ou [M-H]-;
moléculas com cargas múltiplas, [M+nH]n+, podem ser formadas por este método. 
Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons, 
New York, Inc Chinchester, (1997) 
Electrospray (ESI)
Electrospray (ESI)
1- formação de um spray com gotículas altamente carregadas
2- as gotículas carregadas são liberadas através do Cone de Taylor
3- um gás nebulisador (N2) auxilia na liberação das gotículas
5- a densidade de carga superficial aumenta até atingir o “limite de Rayleigh” 
6- a gotícula explode os íons são direcionados ao contra eletrodo, que apresenta carga oposta, passam pelo analisador de massa e são detectados
http//:www.waters.com
Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons, 
New York, Inc Chinchester, (1997) 
3- as gotículas vão tendo seus raios diminuídos
http://www.acsu.buffalo.edu/~twood/nanospray.html
Electrospray (ESI)
O composto sai da coluna do HPLC, passa para a fase gasosa na fonte de ionização eletrospray e entra no espectrômetro de massas.
Então a massa molecular (m/z) da espécie é registrada.
Neste exemplo: Apigenina glicosilada (m/z = 431). 
Fragmentação
Cela de colisão
m/z 268
m/z 431
A seguir o composto é levado à cela de colisão, onde se fragmenta e gera (neste exemplo a apigenina) o restante do espectro de massas.
100
200
300
400
m/z
268
431
Apigenina Glicosilada
Apigenina
Determinação de resíduo de drogas em cédulas
3 mL de (9:1 (água: acetonitrila)), com 1% de ácido fórmico - 15 minutos de ultra-som.
Injeção no LC/MS QTrap
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
4.7e5
Intensity, cps
8.24
11.25
2.18
5.93
Nicotina
Lidocaína
Cocaína
Referências bibliográficas
http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html
SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002.
COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. 
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles and practice. 1997.
Gráf1
	5
	100
Plan1
	
	
	
	
			19
			0.3166666667
	
				0	5
				60	100
Plan1
	
Plan2
	
Plan3
	
Gráf2
	40
	70
Plan1
	
	
	
	
			19
			0.3166666667
	
				0	40
				60	70
Plan1
	
Plan2
	
Plan3
	
Plan1
	Fármacos com Metodologia de Análise por HPLC
	
	Nome	Pág. USP	Coluna	Indicação Terapêutica
	Acetaminofen	16	L1	Analgésico/Antipirético
	Aciclovir	47	L1	Antiviral
	Alprostadil	65	L3	Disfunção erétil
	Amicacina	106	L47	Antimicrobiano
	Atenolol	177	L1	Antianginoso/Antihipertensivo/Antiarritmico
	Azitromicina	188	L9	Antimicrobiano
	Bupivacaína	258	L1	Anestésico local
	Captopril	297	L1	Antihipertensivo
	Carbamazepina	301	L10	Antiepiléptico
	Cefaclor	326	L1	Antimicrobiano
	Cefalexina	364	L1	Antimicrobiano
	Clonidina	453	L7	Antihipertensivo
	Dextran	531	L38	Expansor plasmático
	Diclofenaco	553	L7	Antiinflamatório
	Dietilpropiona	560	L11	Anorexígeno
	Enalapril	649	L7	Antihipertensivo/ICC
	Ergotamina	671	L1	Analgésico
	Etinilestradiol	705	L1	Contraceptivo/Disfunção hormonal
	Fluoxetina	759	L10	Antidepressivo
	Haloperidol	831	L1	Antipsicótico
	Hidroclortiazida	847	L1	Antihipertensivo
	Hidrocortisona	858	L1	Corticóide
	Lorazepam	1021	L1	Ansiolítico/Antipsicótico/Antidepressivo
	Mebendazol	1054	L7	Antihelmíntico
	Metoclopramida	1138	L1	Antiemético
	Nifedipina	1227	L1	Antianginoso/Antihipertensivo
	Norfloxacin	1249	L1	Antimicrobiano
	Piroxicam	1388	L1	Antiinflamatório
	Prednisolona	1426	L3	Corticóide
	Propranolol	1474	L7	Antihipertensivo/Antiarritmico
	Reserpina	1517	L1	Hipotensor arterial
	Sulfadoxam	1620	L1	Antimalárico
	Tetraciclina	1672	L7	Antimicrobiano
	Ioimbina	1818	L7	Tônico
	Zidovudina	1821	L1	Antiretroviral
Gráfico tipos de coluna
	57
	5.7
	2.9
	5.7
	2.9
	2.9
	20
	2.9
tipo de coluna
tipo de coluna
(%)
Plan2
	
	
		tipo de coluna	nº. ocorrências	%
		RP-18	20	57.0
		NH2	2	5.7
		fenil	1	2.9
		FN	2	5.7
		exclusão	1	2.9
		aniônica	1	2.9
		RP-8	7	20.0
		ciclodextrina	1	2.9
		Total	35	100
Plan3