Determinação de ácido ascórbico em sucos comerciais

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Débora de Azevedo Domingues – 15200017 
Determinação de ácido ascórbico em amostras de sucos comerciais utilizando eletroforese capilar
1. Objetivos 
Determinação e quantificação de ácido ascórbico em amostras de sucos Tang e Mid através de eletroforese capilar (CE) com detector de arranjo de diodos (DAD). 
2. Método
2.1 Curva de calibração 
Inicialmente foi preparada uma curva de calibração a partir de uma solução estoque padrão 1000 ppm de ácido ascórbico (AA) e uma solução 1000 ppm de ácido sorbico (AS) (padrão interno). 
As soluções 1000 ppm de ácido ascórbico e sorbico foram diluídas dez vezes a fim de ser obter uma solução 100 ppm para preparo da curva de calibração. 
Foram preparadas cinco soluções de 1 mL de concentração entre 10 a 50 ppm de ácido ascórbico. A concentração do padrão interno foi constante para todas as soluções. Os volumes usados em cada solução estão expressos na tabela 1. 
Tabela 1. Volume de AA e AS utilizados para construção da curva de calibração
	Concentração AA (ppm)
	Volume AA (L)
	Volume AS (L)
	10
	100
	300
	20
	200
	300
	30
	300
	300
	40
	400
	300
	50
	500
	300
750 L de cada uma das soluções foram levados a um vial e analisados no CE. 
2.2 Amostra
Como amostra foram usadas dois sucos em pó: Tang e Mid. 
Para o suco Tang foi pesado 508 mg de suco, que foi solubilizado em água e posteriormente avolumado em um balão de 10 mL. Uma alíquota de 350 L da amostra foi passada para um eppendorf, contendo 300 L de padrão interno e 350 L de água. O eppendorf foi centrifugado e 750 L do sobrenadante foi passado para um vial e analisado no CE. 
O mesmo procedimento foi realizado para o suco Mid, porém a massa pesada foi de 503,2 mg. 
2.3 Método CE 
Para a análise em eletroforese capilar com detecção UV foi utilizado um capilar de sílica fundida de 32 cm de comprimento e 50 m de diâmetro interno. As condições de separação foram: injeção hidrodinâmica com 50 mBar por 4 s de pressão pelo outlet, voltagem aplicada de -30 kV. Lavagem com 1 minuto de eletrólito entre corridas. Como eletrólito foi utilizada uma solução contendo 20 mmol.L-¹ de TRIS e 10 mmol.L-¹ de MES pH 8,1. O comprimento de onda monitorado para o analito foi de 266 nm e para o padrão interno 254 nm. 
3. Resultados 
Observou-se que o AA e AS obtiveram uma separação rápida, onde o ácido ascórbico saiu em 0,77 segundos ácido sorbico em 0,8 segundos (Figura 1). Isto ocorre devida a diferença de mobilidade das duas moléculas no pH em que a separação foi realizada. Em pH 8 o ácido ascórbico apresenta uma maior mobilidade que o ácido ascórbico, como pode ser observado na figura 2. 
Figura 1. Eletroferograma obtida para a solução contendo 20 ppm de AA e 30 ppm de AS. Sendo o primeiro pico referente ao AA e o segundo ao AS. 
Figura 2. Mobilidade efetiva vs. curva de pH para ácido ascórbico, ácido sórbico (padrão interno) e ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES, co-íon). A área fechada representa a melhor região para escolher o pH ideal.
Fonte: Spudeit et at. (2016)
A partir da figura mostrada acima pode-se também justificar o uso do pH 8,1, já que a área fechada na figura mostra a melhor faixa de pH para a separação dos dois ácidos. Em pH 8 a diferença de mobilidade dos ácidos é maior, o que indica uma melhor separação entre os analitos. 
Os dados obtidos para a curva de calibração estão expressos na tabela 2 abaixo. 
Tabela 2. Área de pico obtidas para as diferentes concentrações de AA. 
	Concentração AA (ppm)
	Área AA
	Área AS
	10
	21,9
	114,9
	20
	39,9
	115,2
	30
	60,8
	115,5
	40
	78,8
	111,1
	50
	102,2
	113,9
Dividindo a área obtida para o ácido ascórbico pela área obtida pelo ácido sorbico em cada concentração de ácido ascórbico se tem os dados para construção da curva de calibração (Figura 3). 
Figura 3. Curva de calibração para o AA. 
A partir de dados da curva de calibração consegue-se calcular os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) a partir das seguintes equações: 
Onde: s é o coeficiente linear da curva analítica e S é a inclinação da curva analítica.
Assim se obtêm um LD = 1,44 ppm e LQ = 4,36 ppm. 
	Para as amostras não se observou uma separação boa entre os picos do ácido ascórbico e ácido sórbico. Os valores obtidos estão expressos na tabela 3. 
Tabela 3. Área obtida para o AA nas amostras de suco. 
	Amostra
	Área
	Tang
	129,422
	Mid
	180,4
Assim a partir da curva de calibração obtida consegue-se calcular a concentração de AA nas amostras de suco. 
Para o suco Tang: 
129,422 = 1,995x + 0,87
x = 64,44 ppm
Como a amostra tinha 350 L da solução inicialmente preparada de suco: 
m1v1 = m2v2
64,44 ppm x 1 mL = m2 x 0,350 mL 
m2 = 184 ppm 
Para descobrir quanto se tinha na amostra contendo 10 mL 
184 mg – 1L
X – 10 mL
X = 1,84 mg em 508 mg
Para descobrir quanto se tem em 5 g: 
1,84 mg – 0,508 g
X – 5 g
X = 18 mg 
A embalagem dizia conter 7 mg de AA em 5 g de suco. A quantidade encontrada foi de 18 mg de AA em 5g de suco. Apresentando um erro percentual de 157%. 
Para o suco Mid: 
180,4 = 1,995x + 0,87
X = 90 ppm 
Como a amostra tinha 350 L da solução inicialmente preparada de suco: 
m1v1 = m2v2
90 ppm x 1 mL = m2 x 0,350 mL 
m2 = 257 ppm 
Para descobrir quanto se tinha na amostra contendo 10 mL 
257 mg – 1L
X – 10 mL
X = 2,57 mg em 508 mg
Para descobrir quanto se tem em 5 g: 
2,57 mg – 0,503 g
X – 5 g
X = 25,5 mg 
A embalagem dizia conter 7 mg de AA em 5 g de suco. A quantidade encontrada foi de 25,5 mg de AA em 5g de suco. Apresentando um erro percentual de 264%.
Para ambas as amostras os erros foram muito altos. Isto se deu devido ao fato de os picos do ácido ascórbico e ácido sorbico não apresentarem boa separação, se sobrepondo, desta forma a concentração encontrada é de ácido ascórbico e sorbico que foi adicionado como padrão interno na amostra.
4. Conclusões
Foi possível construir uma curva de calibração para a determinação de ácido ascórbico por eletroforese capilar, porém, ao analisar as amostras os picos do analito e do padrão interno não apresentaram boa separação, se sobrepondo, o que fez com que a concentração de ácido ascórbico encontrada na amostra fosse bastante acima da dita na embalagem do produto. Isto ocorreu provavelmente, devida a complexidade da matriz da amostra, que apresenta diversos componentes que podem interferir na separação dos picos de interesse. 
5. Referências 
Spudeit, D. A., Gonçalves, S., Bretanha, L. C., Claumann, C. A., Machado, R. A. F., & Micke, G. A. (2016). A systematic procedure to develop a capillary electrophoresis method using a minimal experimental data. Journal of the Brazilian Chemical Society, 27(11), 1974–1979. https://doi.org/10.5935/0103-5053.20160087.
10	20	30	40	50	21.9	39.9	60.8	78.8	102.2	Concentração / ppm
Área pico
min
0.50.60.70.80.911.1
mAU
0
20
40
60
80
100
 DAD1 G, Sig=270,4 Ref=off (GRUPO DUDA\19NOV19_000003.D)
 Area: 39.9348
 0.772
 Area: 115.24
 0.808