GA Aula 3 Replicacao do DNA

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Replicação do DNA
Genética Animal
Seropédica – RJ
Ministério da Educação
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde
Departamento de Genética
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Objetivo da aula
• Como a estrutura de dupla hélice sugere um 
mecanismo para replicação do DNA?
• A replicação é conservativa ou 
semiconservativa?
• Que mecanismo especial replica as pontas do 
cromossomos?
• Quais são as consequências para a saúde se no 
final da replicação for defeituoso?
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Introdução
Usando os conhecimentos sobre DNA de
genomas inteiros, os cientistas foram capazes de
determinar o número de genes em vários
organismos.
▫ E. coli cerca de 3.200 genes;
▫ S. cerevisae cerca de 6.300 genes;
▫ D. melanogaster cerca de13.600 genes;
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Introdução
O aumento da complexidade foi suposto como 
requerendo mais genes, assim as primeiras 
estimativas foram que o genoma humano tivesse 
mais de 100.000 genes.
Conferência em 2000 enfocada em pesquisas 
genômicas, começaram uma reunião informal, 
chamada GeneSweep, que seria vencida pela 
pessoa que obtivesse a previsão mais próxima do 
número real de genes no genoma humano.
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Introdução 
Os valores variaram de 26.000 a cerca de
150.000 genes.
Quanto vocês acham seriam o número total de
genes nos humanos?
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Introdução
Após a liberação da sequência rascunho, foi 
anunciado o vencedor.
Foi o que apostou com mais baixa estimativa.
▪ 25.947 genes. 
Como o H. sapiens sapiens, com seu cérebro 
complexo e sofisticado sistema imune tem o 
dobro dos genes de um verme nematelminto e o 
mesmo número de genes que o primeiro genoma 
de planta sequenciado A. thaliana?
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Processo de Replicação
Os mecanismos celulares responsáveis pela
replicação do DNA foram descobertos
primeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através de
proteínas análogas e com processos semelhantes
à replicação do DNA de E. coli
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Replicação
Função: Para reproduzir a célula em muitas 
cópias e transmitir sua informação genética para 
sua progênie.
DNA replicado, passa por um processo de 
replicação semiconservativo.
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Replicação Semiconservativa
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• Evidência baseada em um experimento clássico 
de Meselson-Stahl em 1958.
• Eles teorizaram a possibilidade a replicação ser:
▫ Semiconservativa: a dupla hélice com uma fita 
velha e uma nova.
▫ Conservativa: molécula parental conservada, 
sendo encontrada moléculas velhas e novas.
▫ Dispersiva: as moléculas filhas conterem 
segmentos de ambos os tipos de fita (meio velha, 
meio nova).
Replicação Semiconservativa
• Células de E. Coli foram inicialmente colocadas 
em um meio para crescimento contendo sais de 
amônia preparados com 15N (nitrogênio pesado 
– “heavy”) até todo o DNA celular conter o 
isótopo.
• Nesse estudo, Meselson-Stahl confirmaram a 
teoria de Watson e Crick de que a replicação 
seguia o modelo semiconservativo.
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Replicação Semiconservativa
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Durante a replicação 
do DNA as duas fitas 
velhas ou mães
servem de molde para 
cada fita nova ou filha
complementar, que 
está sendo 
sintetizada.
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Fita nova
Fita velha
Replicação
Cada fita original age como molde da que vai ser 
sintetizada de forma complementar, seguindo a 
complementariedade das bases:
adenina (A) para timina (T) 
guanina (G) para citosina (C).
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Principais Enzimas Envolvidas 
(sistema de replicação do DNA) 
DNA Polimerase (I e III)
Helicases 
Topoisomerases (DNA girase)
Primases
Ligase
Telomerases
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Replissomo
Enzimas envolvidas no processo de 
replicação
HELICASES – constituem uma classe de 
enzimas que podem se mover ao longo da fita 
dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise 
de ATP para separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a 
cada uma das fitas impedindo que as fitas se 
ligue, enquanto o processo estiver ocorrendo.
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Enzimas envolvidas no processo de 
replicação
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza 
pequenas moléculas de RNA utilizadas como 
iniciadores (primer ou primossomo), RNA 
contendo 8 – 12 nucleotídeos, durante o 
processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por 
aliviar a torção na parte da fita que não está 
sendo replicada (DNA girase).
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DNA Polimerase
Essa enzima adiciona desoxirribonucleotídeos à 
ponta 3’ de uma cadeia crescente de 
nucleotídeos, usando como molde um único 
filamento de DNA que foi exposto pela 
deselicoidização localizada na dupla hélice.
Os substratos utilizados são as formas 
trifosfatos de desoxirribonucleotídeos dATP, 
dTTP, dCTP e dGTP.
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DNA Polimerase
São incapazes de quebrar as pontes de 
hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA,
 Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-
existente;
 Catalisam a adição de um nucleotídeo no 
radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que 
está se formando. Desta forma, as fitas só podem 
crescer no sentido 5’ → 3’.
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DNA Polimerase
principais enzimas envolvidas no processo; 
responsáveis pela adição de nucleotídeos e 
reparo; 
requerem um modelo e um primer (segmento de 
RNA sintetizado pela primase) complementares 
para início – alongamento ,
5 tipos principais : I, II, III, IV e V
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DNA Polimerase
DNA polimerase I :
▪ Atividade de polimerase (adição de 
nucleotídeo), 5’ →3’,
▪ Atividade de exonuclease (retirada de 
nucleotídeo), 3’ →5’, remove os pareamentos 
errados de bases, importante no sistema de 
reparo,
▪ Atividade de exonuclease 5’ → 3’, degrada a 
dupla hélice de DNA.
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DNA Polimerase
DNA polimerase III: 
▪ Catalisa a síntese de DNA na forquilha de 
replicação (mais de 10 subunidades).
▪ Atividade de polimerase, 5’ →3’,
▪ Atividade de exonuclease , 3’ →5’, importante 
no sistema de reparo.
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DNA Polimerase
DNA polimerase I :
▪ É considerada lenta (adiciona 20 
nucleotídeos/segundo) e muito abundante 
(~400 moléculas/célula).
▪ Se dissocia do DNA após incorporação de 20 a 
50 nucleotídeos.
▪ Remove os primossomos e substitui por DNA 
(na fita tardia).
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Adição de nucleotídeos
1
2
3
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Outras enzimas envolvidas no processo 
de replicação
DNA ligase – une as pontas dos fragmentos de 
Okazaki com a parte refeita. 
Grampo β – circunda o DNA, mantendo a 
DNA polimerase III ligada ao DNA (observado 
na replicação de E. coli)
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Processo de replicação
A replicação ocorre na forquilha onde a dupla 
hélice está se desenrolando;
A taxa de erro é de 1 em 1010 nucleotídeos 
devido as correções das DNAs polimerase I e III.
Tautomerização: imersão errada de uma 
base.
Replissomo: grande complexo núcleo 
proteico que coordena as atividades da forquilha 
de replicação.
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Processo de replicação – Montagem do 
replissomo
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Estágios da Replicação 
1. Iniciação 
2. Alongamento
3. Terminação 
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Origem da Replicação
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ORIGE
M
Sítio de 
restrição EcoRI
Cromossomo viral 
circular
EcoRI
Bolha de 
replicaçã
o
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi 
cortado com a enzima de restrição EcoRI, que 
reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma 
bolha chamada bolha de replicação 
comprovando a existência de um ponto de 
origem da replicação
• Características da origem de replicação:
▫ estrutura repetitiva
▫ sequências ricas em AT
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Origem da Replicação
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Replicação Bidirecional
• Um experimento através da autorradiografia de
moléculas de DNA marcadas de culturas de
células mamárias revelou grupos de replicons
(unidadesde replicação) com um ponto de
origem de replicação central.
OR OR
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Iniciação em bactérias
ORIGEM DA REPLICAÇÃO – OriC :
▪ 245 pb ; 
▪ 5 repetições de 13 pb; 
▪ 4 repetições de 9 pb; (A=T) 
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Iniciação em bactérias
• Inicia a deselicoidização em um grupo rico em 
AT (=);
• DNA A box liga-se a fita desenrolada, 
revestindo-a;
• Duas helicases se ligam e deslizam na direção 5’ 
→ 3’ para começar a abrir a forquilha;
• A primase e DNA polimerase III são recrutadas e 
inicia-se a síntese de DNA.
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A DNA A box é responsável por levar o 
replissomo para o lugar correto no 
cromossomo para iniciar a replicação.
Alongamento
Envolve duas operações distintas, mas 
relacionadas: 
▪ Síntese da fita líder, 
▪ Síntese da fita tardia.
Início comum na forquilha de replicação 
envolvendo: 
▪ Helicases,
▪ Topoisomerase,
▪ DNA binding proteínas (SSB).
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Iniciação em eucariotos
Apesar dos replissomo procarioto ser 
semelhante ao eucarioto, nos eucariotos, sua 
complexidade aumenta.
O replissomo eucariótico faz todas as funções do 
replissomo procariótico; em adição, ele pode 
desmontar os complexos proteína-DNA 
chamados nucleossomos.
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Síntese de DNA em Eucariontes: 
As “Bolhas de Replicação”
• Nos eucariontes, a replicação
requer “múltiplas origens”,
devido ao tamanho de seu
genoma.
• A replicação é bidirecional e,
em ambas as fitas,
simultânea.
• Este processo gera “bolhas
de replicação”.
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Iniciação em eucariotos
Em eucariotos é necessário desmontar os 
nucleossomos parentais e distribuí-los 
aleatoriamente para as moléculas filhas;
CAF-1 – proteína chamada fator 1 de montagem 
da cromatina, liga-se a versão eucariótica do 
grampo β, chamado antígeno nuclear de 
proliferação celular (PCNA).
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Origem de replicação em levedura
Possui de 100 a 200 pb, ricas em AT;
Possui muitas origens de replicação distribuídas 
nos 16 cromossomos;
A síntese de DNA ocorre na fase S do ciclo 
celular eucariótico;
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Origem de replicação em levedura
A ORC liga-se a sequência de origem e secreta a 
Cdc6 e Cdt1, que então recrutam a helicase 
(complexo MCM) e então outros componentes 
do replissomo.
A replicação é ligada ao ciclo celular e a 
disponibilidade de Cdc6 e Cdt1.
O replissomo é montado na fase S.
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Processo de replicação
O movimento da forquilha de replicação revela 
uma fita molde no sentido 3’→ 5’ e outra no 
sentido oposto 5’ → 3’.
Fita “Leading” – líder – crescimento segue a 
direção do movimento da forquilha de replicação
Fita “Lagging” – tardia – crescimento no 
sentido oposto ao movimento da forquilha de 
replicação
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Processo de replicação
Fita “Leading” – sintetizada continuadamente a 
partir de um iniciador na fita molde 3’ → 5’;
Fita “Lagging” – sintetizada de forma 
descontinua a partir de múltiplos iniciadores, na 
fita molde 5´ 3´;
 Sítios descobertos no molde da fita “lagging” 
são copiados em pequenos iniciadores de RNA 
pela primase.
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Processo de replicação
 Cada iniciador é alongado pela DNA 
polimerase resultando na formação dos 
FRAGMENTOS DE OKAZAKI (1000-2000 
nucleotídeos).
DNA polimerase remove o primer do RNA do 
fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre 
os fragmentos que, então, são unidos pela DNA 
ligase.
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Processo de replicação
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Síntese da fita líder 
1. Síntese de um RNA 
primer pela primase 
na origem de 
replicação. 
2. Desoxirribunocleotí-
deos são adicionados 
pela DNA polimerase 
III continuamente a 
partir da forquilha de 
replicação.
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Terminação
Procariotos: DNA circular, quando as duas 
forquilhas de replicação se encontram ela 
termina. 
Eucariotos: sequências de nucleotídeos 
específicas no final dos cromossomos, 
incorporadas a telômeros. 
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Telomerase
Os cromossomos de eucariotos são lineares e 
apresentam sequências repetitivas em suas 
extremidades denominadas telômeros.
 A síntese da fita “leading” continua até o 
término da fita molde de DNA, no entanto, no 
telômero a extremidade feita pela primase na 
fita “lagging” não é digerida.
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Telomerase
 Como o iniciador é instável, ele se degrada com 
o tempo diminuindo, assim, o tamanho do 
cromossomo.
 Telomerase age evitando a perda do fim do 
cromossomo. A telomerase adiciona múltiplas 
cópias de uma sequências de DNA das pontas 
dos cromossomos.
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Telomerase
 Leva uma curta molécula de RNA que atua 
como molde para a adição de uma sequência 
complementar de DNA, que é adicionado ao 
prolongamento 3’.
Síndrome de Werner – provoca envelhecimento 
prematuro.
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Telomerase
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Regulação
• única fase regulada da 
replicação, de forma que só 
ocorra uma vez por ciclo 
celular;
• afetada pela metilação de 
DNA. 
• DAM metilase na (5´) 
GATC sobre a fita parental.
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Replicação em ação
• Quando replicado o DNA, muitas proteínas 
diferentes trabalham juntas para completar os 
seguintes passos:
1. As duas fitas parentais vão ser abertas com 
ajuda da helicases.
2. As proteínas vão se ligar as fitas desenroladas, 
não permitindo que elas voltem a se ligar.
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Replicação em ação
3. As fitas são mantidas em posição, que facilite 
de ligação da DNA polimerase, que catalisa o 
alongamento, como também verifica a exatidão 
do seu trabalho.
4. DNA polimerase requer um iniciador (DNA ou 
RNA).
5. DNA polymerase opera de forma continua na 
fita líder.
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Replicação em ação
6. RNA primer é adicionado repetidas vezes na 
fita tardia, formando os fragmentos de Okazaki 
(primase auxilia a ligação do primer).
7. Cada novo fragmento de Okazaki é adicionado 
a fita tardia e posteriormente catalisado pela 
DNA ligase.
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Replicação
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vídeo
Considerações Finais
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Bibliografia
• ANTHONY JF GRIFFITHS et. al. – Introdução a 
Genética. 9ª. Ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 
2010. cap. 7. 236-248p.
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