aula 3 clonagegenômica

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Clonagem Gênica 
Utilização da Clonagem Gênica 
Genes sem o conhecimento da seqüência 
Utilização de fragmento superiores a 40 Kb 
 
 Aplicação: 
- Obtenção de DNA em grande quantidade 
- Separação de fragmentos de DNA em uma mistura 
Clonagem Gênica 
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Clonagem Gênica 
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Clonagem Gênica 
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Clonagem Gênica 
Produtos de ligação 
Clonagem Gênica 
- Moléculas de vetor que não foram ligadas 
 
- Fragmentos de DNA que não foram ligados 
 
- Moléculas do vetor recircularizadas sem a 
inserção do DNA 
 
- Moléculas de DNA recombinante portadoras 
de outros fragmentos 
Clonagem Gênica 
Todas as moléculas circulares serão clonadas 
Clonagem Gênica 
- Transformação: incorporação de DNA por 
células bacterianas e fúngicas (leveduras) 
- Células competentes: células submetidas 
ao processo de incorporação do DNA 
- Células transformadas: células contendo o 
plasmídeo 
 
Transformação 
Como identificar a célula com 
vetor da sem vetor? 
Marcador de Seleção 
Marcador de Seleção 
Como identificar o vetor 
recircularizado contendo a 
inserção do DNA? 
Identificação do Recombinante 
pBR322 
Pbr322 como Recombinante 
Seleção de Recombinante 
Plaqueamento em réplica 
Colônias em meio com ampicilina 
pUC8 Plasmídeo LacZ’ 
pUC8 Sítio de Restrição 
pUC8 como Recombinante 
lactose glicose + galactose 
β-galactosidase 
Gene Lac Z‘ 
A função do gene LacZ’ 
Identificação do Recombinante 
(Seleção Lac) 
5-bromo-4cloro-3’indolil-β-D-galactopiranosídeo 
isopropiltiogalactosídeo 
meio com ampicilina 
Seleção de recombinantes de pUC8 
Como identificar o clone desejado? 
Estratégias para obtenção 
do clone desejado 
- Seleção direta do gene desejado. 
 
 
- Identificação do clone a partir de uma 
biblioteca genômica. 
pBR322 
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Introdução de fagos em bactérias 
- Transfecção: equivalente a transformação 
 
- Infecção (empacotamento in vitro): 
montagem do bacteriófago in vitro com a 
inserção do DNA 
Obtenção das proteínas do fago λ 
Empacotamento em linhagem única 
Replicação do fago λ 
3’ 
5’ 
X X X 
X 
Obtenção das proteínas do fago λ 
Empacotamento em duas linhagens 
Fago λ 
 componentes do capsídeo integração do profago replicação 
Empacotamento do fago λ 
Empacotamento in vitro 
Visualização da infecção 
 
Placas líticas Placas de M13 
Identificação de fagos 
recombinantes 
 componentes do capsídeo integração do profago replicação 
Lac Z’ 
Identificação de fagos recombinantes 
Inativação por inserção do gene Lac Z’ 
Identificação de fagos 
recombinantes 
 componentes do capsídeo integração do profago replicação 
Identificação de fagos recombinantes 
Inativação por inserção do gene cI de λ (posição 38)