GD3 Biologia Molecular

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GD3 Biologia Molecular 
 
 
Parte 1: Métodos de Estudo de DNA e Genomas 
 
 
1. Descreva de forma sucinta um método de extração de DNA a partir de células 
eucarióticas em cultura. 
 
2. Escreva uma fita de DNA codificadora de 120 nucleotídeos de extensão na orientação 
5' 3' e que contenha um gene procarioto completo para uma proteína de exatamente 
15 aminoácidos, além das regiões 5’ e 3’UTR. (OBS. Você já fez isto no GD1. Pode 
copiar sua sequência se quiser). 
 
3. Escreva a sequência de bases de um oligonucleotídeo que servirá de primer para a PCR 
e que inclua os primeiros nucleotídeos da região codificadora da fita de DNA escrita no 
item 1, de modo que a temperatura de pareamento, ou temperatura de desnaturação 
(Tm) seja em torno de 55-60ºC (considere 2ºC para cada A ou T e 4ºC para cada C ou 
G componente do oligonucleotídeo). 
 
4. Escreva a sequência de bases de um outro oligonucleotídeo, que também servirá de 
primer para a PCR, correspondente à fita oposta (fita molde) à sequência do item 1. 
Este deve ser desenhado a partir do final da região codificadora e incluir o STOP 
CODON que você deve ter colocado na sequência do item 1. A Tm do oligonucleotídeo 
também de ser em torno de 55-60ºC. 
 
5. Os dois oligonucleotídeos acima podem ser utilizados para amplificar o gene descrito 
no item 1 através da técnica de PCR. Além dos oligonucleotídeos, quais reagentes são 
necessários para a PCR? 
 
6. Qual seria o tamanho da região amplificada (amplicon) e como você poderia visualizar 
o resultado da PCR? 
 
7. Como é possível avaliar a quantidade de produtos gerados pela PCR no seu tubo de 
reação? Explicar dois métodos de quantificação de DNA 
 
8. Descreva o princípio, as diferentes etapas e os reagentes necessários das seguintes 
técnicas moleculares: 
 
a) Sequenciamento de DNA – método de Sanger 
b) Southern blot 
 
9. Descreva e explique 2 diferenças e 2 semelhanças entre o Sequenciamento de DNA 
pelo método clássico de Sanger e o sequenciamento de nova geração (usando as 
plataformas HiSeq Illumina e IonTorrent Life Technologies) 
 
 
Parte II: Métodos de Estudo de RNA e Transcriptoma 
 
10. Descreva como isolar e quantificar RNAs a partir de células eucarióticas em cultura. 
 
11. Como é possível avaliar a qualidade do RNA extraído no item 10? 
 
12. Descreva um método de obtenção de mRNAs (RNAs poliadenilados) a partir da mistura 
de todos os RNAs (RNAs totais) das células do item 10. 
 
13. Num dado experimento foram obtidas duas populações de células, uma respondia a uma 
determinada droga, a outra não. Explique como o Northern blot poderia ser utilizado 
para testar a hipótese de que essa diferença se deve a expressão ou não (nas duas 
diferentes populações celulares) do gene que codifica para receptores dessa droga. 
Descreva como esse experimento seria realizado. 
 
14. Para produzir uma sonda “radioativa” para ser usada nos experimentos de Northern Blot 
acima, qual componente da sonda poderia ter um átomo substituído por um isótopo 
radioativo? Como você produziria esta sonda radioativa? 
 
15. Elabore uma tabela comparando as principais características (princípio, vantagens e 
desvantagens) dos seguintes métodos de análise de transcriptoma; 
 
a) qRT-PCR (PCR em tempo real ou quantitativo, após transcrição reversa) 
b) Microarrays 
c) RNAseq