Apostila de Micologia

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APOSTILA
CURSO DE MICOLOGIA MÉDICA
1.- Introdução
Identificação dos fungos
Generalidades
	
Os fungos são organismos eucarióticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uni ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imóveis na sua maioria. Cada célula pode gerar, por si só, um novo organismo da mesma espécie. São considerados os principais biodegradradores de matéria orgânica de nosso planeta. 
	As células fúngicas apresentam morfologia variável, mostrando grande diferença em tamanho, estrutura e atividade metabólica, formando diferentes tipos de colônias quando cultivados em meios apropriados, estruturas de frutificação complexas e/ou elaborados mecanismos de propagação e dispersão.
REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberi
REINO CHROMISTA: Pythium insidiosum
Os fungos são organismos distintos das bactérias em tamanho, estrutura celular e composição química. Os fungos são eucariontes isto é possuem núcleos envolvidos por membrana própria, heterotróficos, com nutrição de absorção, uni ou pluricelulares, com parede formada de polissacarídeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem como glicoproteínas, sem celulose. A composição desses compostos é variável e depende da posição sistemática dos fungos, ergosterol é o principal componente da membrana fúngica.
A célula fúngica é constituída pelos componentes encontrados em outros organismos eucarióticos.
As organelas citoplasmáticas e inclusões são: mitocôndrias, vacúolos, vesículas, retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Os típicos aparelhos de Golgi irão estar sempre presentes. Quase todos os fungos são aeróbios e todos necessitam matéria elaborada para sua alimentação (heterotróficos).
Os fungos não ingerem seu alimento, mas possuem nutrição de absorção e parasitam seres vivos ou atacando matéria morta como sapróbios, parasitas, simbiontes ou patógenos.
Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colônias que são classificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam pela macromorfologia e micromorfologia. 
As colônias de leveduras são, em geral, de consistência cremosa de cor branca a creme, brilhantes ou opacas podendo apresentar às vezes coloração escura ou alaranjada.
As leveduras produzem células simples, arredondadas, ovais ou alongadas que se reproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na posição polar chamadas de blastoconídio. Algumas leveduras podem produzir, brotos simultaneamente em vários pontos.
Os brotamentos ou células filhas são liberados da célula mãe, formando células independentes ou continuar unidos formando células alongadas chamadas de pseudohifas que se diferenciam das hifas verdadeiras por apresentarem constrição nos septos. Além dos blastoconídios as leveduras podem apresentar artroconídios, pseudohifas e clamidoconídios típicos. 
As colônias de fungos filamentosos podem ser granulares, cotonosas, aveludadas, pulverulentas, membranosas. O seu talo consiste de hifas que podem ser contínuas ou interrompidas em intervalos irregulares por septos (septada) que dividem as hifas em células.
Um conjunto de hifas forma o micélio que pode ser vegetativo ou reprodutivo. O micélio vegetativo penetra no meio de cultivo, para absorver substâncias nutritivas para o fungo. O micélio vegetativo é o que fica na parte superior do meio e produz as estruturas de reprodução típicas para cada grupo de fungos.
Os fungos sexuados se reproduzem por esporos que podem ser formados internamente (ascoporas) ou externamente (basidiosporas).
Os fungos sexuados também se reproduzem assexuadamente.
Na reprodução assexuada, as estruturas de reprodução tomam nomes variados de acordo com o grupo a que pertencem os fungos.
Conídios são estruturas assexuadas de reprodução encontradas entre os fungos filamentosos. Podem apresentar tamanhos, formação, cores e septos diferentes (macroconídios, microconídios, ameroconídios, didimoconídios, fragmoconídios, dictioconídios, etc.). As hifas que sustentam os conídios são denominadas de conidióforos e as células que dão origem aos conídios conidiogênicas.
Os conídios podem ser claros ou hialinos – hialoconídios ou pigmentados e escuros - feoconídios.
Entre os fungos de hifas não septadas, as hifas aéreas produzem esporos assexuados (esporangiosporos) dentro de estruturas chamadas esporângios. As hifas que sustentam os esporângios são conhecidas como esporangióforos.
Columela é uma invaginação estéril do esporangióforo na área fértil do esporângio.
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2.- Coleta de Material Biológico 
	A coleta de material biológico é a primeira etapa no processo de identificação dos fungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observação, isolamento e identificação do agente causal da doença.
O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG, procedência, endereço, telefone para contato, entre outros; dados epidemiológicos: profissão, contato com animais, doença associada, estado imunológico, etc; informações clínicas: local anatômico acometido, aspecto da lesão, suspeita clínica, antibioticoterapia prévia, evolução e dados do médico responsável.
O procedimento de coleta varia segundo a região acometida, suspeita clínica e tipo de material biológico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir o procedimento de identificação laboratorial do fungo: como exame microscópico direto e cultivos em vários meios, com eventuais repetições desses exames para confirmação dos achados laboratoriais.
Procedimento da coleta
	Para efeitos práticos, a coleta de material biológico, depende da localização e do tipo da micose.
 
Amostras de micoses superficiais e cutâneas
	Também denominadas dermatomicoses acometem: pele, pêlo, unhas, provocando algumas delas alterações somente de importância estética. 
A.- Amostras de pele.
	A prévia desinfecção da lesão com algodão embebido em álcool 70% diminui a biota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micológico. 
Raspar a lesão com bisturi, cureta esterilizada ou com lâminas de vidro previamente flambadas. Nas lesões sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas da lesão, já que este é o sitio ativo da infecção. 
Quando o raspado da lesão não pode ser realizado, pode-se optar por métodos tais como o de Porto (só para pitiríase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesiva transparente (Durex) que é pressionada sobre a lesão, removida e fixada sobre uma lâmina ou a utilização de um tapetinho estéril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre a lesão, embrulhado e transportado ao laboratório (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagens são a falta do cultivo ao empregar a técnica de Porto e do exame direto, quando se usa o tapetinho.
B.- Amostras de unha.
	A lesão pode-se localizar na região subungueal distal, proximal ou lâmina superficial da unha. A tomada amostra dependerá do tipo de lesão. 
Deve-se remover a presença de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficial branca, raspa-se as áreas esbranquiçadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estéril. No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a área infectada desde a porção distal à proximal. 
Os primeiros detritos coletados da porção distal deverão ser eliminados já que são ricos em contaminantes. As escamas obtidas da porção profunda da lesão poderão ser usadas para o exame micológico. Quando as unhas são distróficas, pode-se auxiliar a coleta com tesouras limpas e desinfetadas.
C.- Amostras de cabelo e pêlo.
	Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou pêlos apresentando nódulos fúngicos (observados com auxilio de lupa).
Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pele e os pêlos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados são facilmente
arrancados, a partir das bordas das placas alopécicas com ajuda de uma pinça limpa e flambada.
Os pêlos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entre duas lâminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placas esterilizadas, sempre com a identificação da amostra.
D.- Amostras oculares.
	Material de conjuntiva é colhida da mucosa, desde a porção proximal em direção a borda, com "swab" estéril, embebido em solução salina. O "swab" pode ser colocado num tubo estéril, contendo meio semi-sólido de transporte ou 0,5ml de solução salina.
Material ocular (córnea) colhido só por oftalmologistas, raspando as áreas necróticas, ulceradas e supurativas da lesão com espátula esterilizada. Esta amostra será processada em lâmina (exame microscópico direto) e semeada imediatamente nos meios de cultivo apropriados ou tubo estéril contendo solução salina.
E.- Amostras óticas.
	Geralmente o material biológico é obtido a partir do conduto auditivo externo, com “swab” esterilizado umedecido previamente em solução salina. 
E.- Mucosas.
i- Mucosa oral.
	As amostras devem ser obtidas por raspado da superfície epitelial acometida, empregando espátula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidíase oral em que se verificam placas esbranquiçadas, o material pode ser colhido com “swab” estéril, ou alça de platina, colocar em tubo esterilizado contendo solução salina.
ii- Mucosa nasal.
	O material nasal pode ser colhido com espátula, bisturi, alça ou ¨swab¨. Nos casos de suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-se coleta do material com procedimento cirúrgico, como biópsia, etc.
iii- Mucosa vaginal.
	As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prévio da paciente, com “swab”, colocar em um tubo com solução salina esterilizada.
iv- Mucosa genital Masculina.
	A amostra pode ser colhida com swab da área da glande que apresenta pontos esbranquiçados ou pseudomembranas, ou do prepúcio em onde podem ser encontradas, vesículas.
v- Mucosa perianal.
	Pode apresentar lesões esbranquiçadas ou ulceradas de aspecto granulomatosos. As amostras são obtidas por raspado com bisturi rombo estéril ou “swab”
Micoses subcutanêas
	
A.- Lesões sugestivas de Esporotricose.
	No caso de abscessos fechados a obtenção de material purulento é feita por punção, com seringa esterilizada ou por drenagem com prévia limpeza da zona implicada. Quando o abscesso drena espontaneamente, o material purulento deve ser colhido com espátula, alça ou “swab” e transferido a um tubo estéril de tampa de rosca, com solução salina.
B.- Lesões sugestivas de Micetoma.
	O material compreende pus que deve conter grãos que podem ser visíveis a olho nu. Quando é difícil a coleta da amostra, recomenda-se colocar gaze sobre a superfície lesada por 18 a 24 h o que permitirá recuperar os grãos para o estudo micológico completo.
C.- Lesões sugestivas de Cromoblastomicose.
	Na superfície cutânea lesada, observam-se geralmente pontos negros devido à eliminação trans-epitelial do fungo. O material biológico deve ser coletado a partir dos pontos enegrecidos da lesão. Escamas e crostas com auxilio de bisturi e agulhas estéreis, biópsias podem também ser obtidas.
D.- Lesões sugestivas de Lobomicose ( Doença de Jorge Lobo).
	A amostra compreende material biológico coletado por biopsia ou secreção das lesões ulceradas colhidas com espátula, bisturi rombo, alça ou ´swab¨ e transferido a um tubo estéril contendo solução salina. O exame microscópico direto e/ou anatomopatológico confirmam o diagnóstico de lobomicose. Cultura não obtida, até o presente.
E.- Lesões sugestivas de Rinosporídiose
	O material biológico deve ser colhido da superfície de crescimento polipóide. Exame microscópico direto e cortes de tecido corados confirmam o diagnóstico.
F.- Feohifomicose subcutânea 
	Colher o material dos abscessos subcutâneos por punção ou biópsia. Fazer exame microscópico direto, cultura e cortes sem coloração.
G.- Zigomicose subcutânea
Colher uma pequena porção do material por biópsia. Fazer preparações, exame microscópico direto com KOH, anátomo patológico e cultura. 
Amostras de micoses sistêmicas
	
A.- Trato respiratório.
i- Escarro.
	Amostras de escarro são coletadas após prévia lavagem bucal preferentemente em jejum. O material deverá conter escarro profundo, livre de saliva e será colhido em frasco estéril de boca larga. No caso dos pacientes que não expectoram facilmente, podem ser usadas nebulização, com solução salina hipertônica.
ii- Lavado brônquico.
	Procedimento realizado pelo médico com broncoscópio. O material clínico é colocado em frasco estéril e enviado ao laboratório.
Aproximadamente 1 ml de escarro ou lavado brônquico, é levado a um tubo cônico de centrifuga contendo 250 ul aproximadamente de KOH 20% mais tinta, sendo incubada por 12 h a 37ºC. O material biológico é centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. A preparação microscópica é realizada a partir do sedimento.
B.- Biópsia.
	Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deve ser dividido em dois frascos estéreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outro contendo solução salina, destinados ao exame histopatológico e micológico, respectivamente.
C.- Medula óssea.
	É um procedimento médico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 ml do material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente ao laboratório micológico.
D.- Líquido cefalorraquídiano (LCR)
	Para o estudo micológico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por punção lombar, em condições de rigorosa assepsia. O LCR é normalmente, livre de microrganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patógeno potencial.
E.- Sangue
	 Realizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5 segundos e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso (adultos) e de 1 a 3 ml (crianças), para cada frasco coletado. Terminada a punção retirar a agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato ao laboratório.
Número e intervalo das amostras:
-Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalo de uma hora.
-Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se forem negativos, após 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora.
F.-Urina
	A assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa pudendo após lavar com povidine, enxugar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair o prepúcio e lavar a zona do glande e meato urinário)
 	Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandes lábios) em frasco esterilizado.
 	Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão, colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o coletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso a criança não tenha urinado)
Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente na sonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cm de distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70 %, coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório. (no caso da sonda urinária não apresentar dispositivo para coleta de urina é recomendável desligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota a gota diretamente no frasco estéril. Todo o procedimento deverá ser realizado respeitando as normas de assepsia).
G.- Fezes.
	Aproximadamente 20g de fezes recém
emitidas devem ser coletadas em frasco esterilizado e enviadas rapidamente ao laboratório. Para cultivo de vigilância, utiliza-se “swab” anal.
H.- Outros líquidos corporais.
	Todos os líquidos corpóreos são obtidos por aspirações percutânea ou drenagem, empregando procedimentos invasivos praticados pelo médico. Deve ser coletado tanto líquido quanto seja possível 2 a 10 ml ou mais, pois as concentrações dos microrganismos podem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina 1:1000.
 
	Todas as amostras de material clínico devem ser colhidas adequadamente, em condições ideais e transportadas rapidamente ao laboratório, com a solicitação do tipo de exame, suspeita clínica, dados clínicos e epidemiológicos do paciente, para processamento micológico imediato.
3.- Exame Microscópico Direto e Cultura 
	O exame microscópico direto de material clínico é um dos procedimentos mais simples e úteis para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas. Vários clarificadores podem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado. 
	 A observação de elementos fúngicos em escamas de pele, pêlos ou unhas pode proporcionar uma clara indicação do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidíase ou pitiríase versicolor. 
	O exame microscópico direto de fluidos, biópsia ou outro material clínico pode também estabelecer o diagnóstico de uma micose sistêmica, orientando a etiologia da infecção como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose, feohifomicose entre outras.
Técnica:
	Colocar parte do material biológico a ser estudado sobre lâmina limpa, adicionar uma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamínula e flambar ligeiramente.
	As lâminas previamente marcadas serão colocadas em câmara úmida, “overnight” a 4 °C e posteriormente se realizará a segunda observação microscópica.
	Nunca se deve pressionar a lamínula com os dedos, uma vez que os ácidos graxos naturais da pele dificultam a observação. Quando a amostra é muito espessa é aconselhável pressionar a lamínula com uma pinça ou outro objeto. O fungo pode ser então liberado do material biológico, o que permite sua visualização. 
	A adição de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH, permite melhor visualização e contraste dos fungos em especial das células de Malassezia furfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fúngicas.
	Outras substâncias tais como goma de Berlesse, DMSO e Chloroblack E podem ser empregadas na visualização do fungo a partir do material biológico.
	Para verificação da presença de cápsula, devem-se fazer preparações do material clínico com tinta da China, diluída 1:1 em água destilada ou salina esterilizada.
Cultura dos Fungos:
	Os fungos preferencialmente se desenvolvem à temperatura de 25(C, sendo seu crescimento mais lento que o das bactérias. Por isto há necessidade de acrescentar inibidores bacterianos aos meios de cultura ao trabalhar com material biológico contaminado. Entre os antibióticos cloranfenicol 50 a 300 mg/l é empregado para inibir o desenvolvimento de bactérias. Para inibir o crescimento de determinados fungos contaminantes do ar que têm desenvolvimento rápido deve-se usar cicloheximida.
Fungos filamentosos crescem melhor entre 24 e 28°C e os leveduriformes entre 24 e 37°C, em pH de 6,6 a 7,2.
Existe um grupo de fungos que apresenta dimorfismo térmico: uma fase saprofítica ou filamentosa à temperatura (24-28°C) e uma fase parasitária ou leveduriforme a 37°C.
	São os fungos dimórficos: S. schenckii, H. capsulatum, P. brasiliensis, B. dermatitidis. 
Técnica:
	A semeadura está na dependência do tipo de amostra e da suspeita clínica. Pêlos, escamas de pele ou de unhas, serão semeadas em 6 a 8 picadas com alça em L sobre ágar inclinado em tubo. Fluidos biológicos como LCR, lavado brônquico, etc., serão centrifugados a 3000 rpm. por 5 minutos e semeados com pipeta Pasteur estéril ou pipeta graduada sobre ágar inclinado. Material de biopsia deve ser fragmentado e semeado fazendo picadas na superfície do ágar. Amostras de hemoculturas serão semeadas acrescentando 0,5 ml do caldo na superfície do meio.
	A adequada coleta e transporte de material biológico são essenciais para se obter o diagnóstico micológico preciso.
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LISTA DE MATERIAL BIOLÓGICO, EXAMENS MICROSCÓPICOS DIRETOS E MEIOS DE CULTURA PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOSES 
	Micoses
	Amostra clínica
	Exame Microscópico Direto
	Meio de Cultura
	Agentes etiológicos
	T(e tempo de incubação
	Pitiriase Versicolor
	Escamas de Pele
	Células leveduriformes esféricas ovaladas com ou sem brotamento e filamentos curtos septados.
	Ágar bile de boi adicionado de azeite de oliva
	Malassezia furfur
	37(C durante 7 dias
	Tinha negra
	Escamas de Pele
	Hifas escuras septadas, irregulares.
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**
	Hortae werneckii
	25(C durante 20 dias
	Piedra negra
	Cabelo
	Nódulos marron - escuros, formados por artroconídios escuros; ascos com 2 a 8 ascosporos típicos
	Sabouraud-dextrose ágar**.
	Piedraia hortae
	25(C durante 30 dias. 
	Piedra branca
	Pêlos região genitais, axilares, etc.
	Nódulos claros, formados por artroconidós claros e blastocon.
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**
	Trichosporon spp
	25(C durante 7 dias
	Dermatofitose do couro cabeludo
	Cabelo com raíz
	Artroconídios refringentes ectothrix, endothrix ou ectoendothrix. Parasitismo fávico
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**. Mycosel
	Microsporum spp, Trichophyton spp.
	25(C durante 15 a 30 dias
	Dermatofitose da pele. 
	Escamas e pêlos
	Hifas septadas, ramificadas.
	Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Mycosel
	Epidermophyton spp, Microsporum spp, Trichophyton spp.
	25(C durante 15 a 30 dias
	Onicomicose borda livre espessa.
	Escamas lâmina interna da unha (raramente lâmina externa)
	Hifas septadas com artroconídios retangulares ou esféricos.
	Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Mycosel
	Trichophyton spp.
	25(C durante 15 a 30 dias
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	Onicomicose borda livre fina e de borda periungueal (candidíase)
	Escamas lâmina interna da unha e do arco periungueal
	Células leveduriformes e/ou pseudohifas
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**
	Candida albicans, Candida spp.
	25(C durante 7 a 15 dias
	Cromomicose
	Crostas, secreção ou pus.
	Estruturas globosas de cor marrom, de parede grossa, septada em dois planos (corpos escleróticos) ou talo moriforme.
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**
	Phialophora spp, Cladosporium spp, Rhinocladiella spp. Fonsecaea spp.
	25(C durante 20 dias
	Esporotricose
	Secreção ou pus
	Leveduras alongadas como charuto, o observadas raramente.
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.
	Sporothrix schenckii
	25(C e 37 (C durante 20 dias
	Eumicetoma
	Secreção ou pus
	Grânulos parasitários formados por aglomeração de hifas claras ou escuras
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.
	Madurella spp (grãos escuros), Pseudallescheria boydii (grãos claros), Acremonium spp, P. romeroi
	25(C durante 20 dias
	Rinosporidiose
	Descarga nasal ou tecido do pólipo
	Esférulas até 350 paredes espessas em diversos graus de maturação
	
	Rhinosporidium seeberi
	
	Lobomicose
	Material de lesão queloides e tumores
	Células leveduriformes tamanho uniforme 9-10 um. Uma ponte tubular une uma célula a outra
	
	Glenosporella loboi, Loboa loboi, P. loboi
	
	Feohifomicose
	Secreção ou pus
	Hifas escuras septadas, elementos leveduriformes, sem corpos escleróticos
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**
	Phialophora spp, Cladosporium spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp.
	25(C durante 20 dias
	Zigomicose subcutânea
	Nódulos subcutâneos
	Hifas largas não septadas com reação eosinofílica (corte)
	Sabouraud-dextrose ágar*;
	Conidiobolus coronatus, Basidiobolus haptosporus
	
	Paracoccidioido micose
	Escarro, pus, raspado de
mucosa, etc.
	Células esféricas de tamanho variável de membranas duplas com um ou muitos brotamentos, células esfericas isoladas, células caten., Células caliciformes.
	Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar** 
	Paracoccidioides brasiliensis
	25(C e 37(C durante 30 dias
	Histoplasmose
	Escarro, raspado das lesões.
	Células leveduriformes pequenas 2-3m, esféricas ou ovaladas no interior de macrófagos ou mononucleares (coloração com Giemsa).
	Sabourad-dextrose ágar*;Lactrimel ágar, 
	Histoplasma capsulatum
	25(C e 37(C durante 30 dias
	Criptococose
	L.C.R., escarro, pus, etc
	Células leveduriformes esféricas com cápsula grande (em observação com tinta da China)
	Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**.
	Cryptococcus neoformans
	37(C durante 15 dias
	Candidíase
	Raspado mucosa, biopsia, escarro, etc.
	Células leveduriformes ou pseudohifas
	Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**.
	Candida albicans, Candida spp.
	37(C durante 15 dias
	Otomicose
	Pseudomembrana com pontos de cores ou massa em migalha de pão
	Filamentos com ou sem cabeças aspergilares ou células leveduriformes e pseudohifas
	Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.
	Aspergillus niger, A. Fumigatus, Aspergillus spp, Candida albicans, etc..
	25(C durante 15 dias
* Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol
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Micologia médica, micoses e seus agentes 
Em micologia médica, as micoses são divididas para seu estudo em:
Micoses superficiais
Os agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogêneo de fungos que não sensibilizam o indivíduo, não provocam reações alérgicas a distancia como os agentes de micoses cutâneas.
Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae são os fungos envolvidos nessas micoses.
Malassezia furfur - Agente da pitíriase versicolor, afecção cutânea assintomática que se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas, marrons ou brancas. O papel do fungo em doenças de natureza seborreica como psoríase, dermatite seborreica, foliculite é discutível.
M. furfur tem sido isolada também de infecções sistêmicas, principalmente em neonatos.
Hortae werneckii - agente da tinha negra, lesão que se caracteriza pela formação de mancha pouca descamativas de coloração castanha a preta, principalmente nas palmas das mãos. Essas lesões vão aumentando de tamanho, durante meses ou anos.
Trichosporon spp - causa piedra branca, que consiste em nódulos castanho-claros e macios em torno de pêlos da região genital, axilar e do couro cabeludo. Os nódulos são menos aderentes que os da piedra negra. Nos pacientes com imunodeficiência, pode ocorrer invasão do sangue, dos rins, dos pulmões e da pele.
Piedraia hortae - produz piedra negra, que consiste em nódulos duros, pretos e firmes em torno dos cabelos.
Micoses cutâneas
Agrupam as dermatofitoses e as candidíase cutâneas. Os agentes das micoses cutâneas atacam a epidermes e as camadas mais profundas da córnea, chegando a produzir granulomas, se localizando na pele, pêlos, unhas e mucosas.
Os dermatófitos são fungos relacionados entre si que invadem a queratina morta. Pertencem aos gêneros Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton. As espécies geofílicas vivem principalmente no solo; as zoofílicas, em animais; as antropofílicas, nos seres humanos. 
Esses fungos infectam locais específicos do corpo, que servem de base para o diagnóstico clínico. A localização da dermatofitose pode ajudar na identificação preliminar do fungo.
	AGENTE
	PELE
	UNHAS
	PÊLO INVASÃO ECTÓTRICA
	PÊLO INVASÃO ENDÓTRICA
	Microsporum
	+
	+(raro)
	+
	-
	Epidermophyton
	+
	-
	-
	-
	T.mentagrophytes
	+
	+
	+
	-
	T.rubrum
	+
	+
	+ (raro)
	-
	T. verrucosum
	+
	+
	+
	-
	T.tonsurans
	+
	+
	-
	+
	T.shoenleinii
	+
	+
	-
	+
	T.violaceum
	+
	+
	-
	+
 
Microsporum canis - causa dermatofitose do corpo e do couro cabeludo, geralmente encontrado em crianças adquirido de animais infectados como cães e gatos.
 
Microsporum gypseum - causa dermatofitose inflamatória do corpo ou do couro cabeludo, contraído por contato com solo contaminado.
Epidermophyton floccosum - dermatofitose epidêmica (pé de atleta) em locais de veraneio, bem como dematofitose inguinal.
Trichophyton rubrum - dermatofitose do corpo, dos pés, da virilha e das unhas. Em paciente imunodeprimidos, pode causar nódulos ou abscessos subcutâneos.
Trichophyton mentagrophytes - dermatofitose inflamatória nos pés, no corpo, nas unhas, na barba e no couro cabeludo. É causa comum de pé de atleta, apresenta as variedades granular e cotonosa.
Trichophyton tonsurans - causa tinha do couro cabeludo, tinha capilar com pontos pretos e às vezes dermatofitose do corpo, dos pés e das unhas.
Trichophyton verrucosum - dermatofitose do couro cabeludo, da barba ou do corpo, geralmente adquirida por contato com o gado infectado.
Trichophyton shoenleinii: dermatofitose do couro cabeludo chamado FAVO (tinha favosa) com alopécia definitiva, raramente, dermatofitose do corpo ou das unhas. 
Candidíases
	São causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espécies de Candida estejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiológicos. A C. albicans existe como normal no trato gastrointestinal, na área vulvovaginal, na pele e fezes. Em casos de comprometimento imunológico e conseqüente queda da resistência causados por AIDS, neoplasias, lúpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esteróides ou agentes citotóxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infecções.
	As candidíases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidíase oral. broncopulmonar, vulvovaginal; candidíase mucocutânea crônica, cutânea, ungueal, etc. são algumas das manifestações que podem ocorrer.
Micoses subcutâneas
Os agentes de micoses subcutâneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micoses subcutâneas quando há traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetação ou materiais contaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infecção localizada na pele e no tecido subcutâneo e às vezes nos linfonodos da região. Raramente a infecção se se dissemina. As lesões subcutâneas caracterizam-se pela cronicidade de áreas duras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que não cicatrizam e periodicamente produzem exsudação. Os membros inferiores, sobretudo os pés, são muitas vezes comprometidos, visto que seu contato com espinhos e outros vegetais é mais freqüente.
Esporotricose – Esta infecção decorre de ferimentos cutâneos provocados por materiais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz lesões ulcerativas subcutâneas, nos membros, que podem avançar ao longo dos vasos linfáticos. A esporotricose pulmonar está sendo observada com mais freqüência, deve ser distinguida da tuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose.
O agente etiológico é Sporothrix schenckii, fungo dimórfico.
Cromoblastomicose – As lesões produzidas evoluem com grande lentidão torna-se, vão-se formando muitas protuberâncias sobrepostas, o que cria a aparência de couve-flor. Geralmente, a erupção é seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas, encontram-se corpos escleróticos.
Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C. carrionii, Rhinocadiella aquaspersa.
Micetomas – O micetoma geralmente se restringe aos pés, mas pode ser visto em outras regiões como mãos e nádegas.
Os nódulos, que periodicamente exsudam um líquido oleoso contem grãos que podem ser brancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as lesões comprometem toda a perna. A infecção causada pelos fungos superiores (micetoma eumicótico) produz lesões fistulosas, com pouca dor ou destruição óssea, enquanto a causada por bactérias fungiformes (micetoma actinomicótico) apresenta
lesões tumorosas cônicas semelhantes às erupções de acne, com grande exsudação e comprometimento ósseo com dor.
	Principais agentes de micetoma eumicótico: Scedosporium apiospermum, Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurella mycetomatis, Madurella grisea.
	Principais agentes de micetoma actinomicótico: Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii, Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis. 
	Rinosporidiose – doença que se caracteriza pela formação de granuloma vegetante, poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar e saco lacrimal). Já foram verificados casos de localização vaginal, retal e peniana, assim como no conduto auditivo externo.
	Agente etiológico Rhinosporidium seeberi que não tem sido cultivado.
	Entomoftoromicose ou zigomicose subcutânea – Granuloma eosinofilico causados por zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutâneo. É comum em crianças, traduzindo-se pelo aparecimento de um nódulo subcutâneo que aumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento. Geralmente o paciente não apresenta imunodepressão
	Agentes envolvidos pertencentes aos gêneros Conidiobolus e Basidiobolus.
	Doença de Jorge Lobo – dermatose que provoca lesões tipo quelóides com ausência de comprometimento visceral, ausência de adenopatia satélite, longa evolução do processo. Nem sempre as lesões cutâneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e lesões papulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer.
	Agente etiológico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda não cultivado.
Micoses sistêmicas
Os fungos que causam micoses sistêmicas vivem em forma sapróbia no solo. Alguns animais de vida silvestre são reservatórios importantes. Os indivíduos podem desenvolver a doença principalmente por inalação de propágulos.
Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo térmico. Na natureza e nos cultivos a 25(C, formam colônias filamentosas com reprodução assexuada. Nos tecidos e cultivos a 37(C eles apresentam sua forma leveduriforme.
Estes fungos são taxonomicamente heterogêneos: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis.
Histoplasma capsulatum – é agente de infecção relacionada a indivíduos que visitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos são assintomáticos ou sub-clínicos e os sintomas respiratórios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamente algum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doença, com suores noturnos, tosse, febre e emagrecimento. É fulminante em pacientes com imunodeficiência.
Paracococcidioides brasiliensis – a infecção geralmente se caracteriza por lesões pulmonares semelhantes às da tuberculose e de outras micoses. Lesões nas mucosas nasais, oral, pele e outros órgãos podem ocorrer.
Blastomyces dermatitidis – O microrganismo ao ser inalado, produz infecção respiratória crônica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses. Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratória da doença tem semelhanças com tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Pode provocar lesões subcutâneas, ósseas, etc.
Coccidioides immitis – Por inalação dos conídios após 14 dias, 60% dos pacientes apresentam infecção respiratória assintomática. O restante 40% apresenta sintomas da doença respiratória gripal leve ou raramente grave. Complicações pulmonares, na forma de cavidades ou de pneumonia ocorrem em 5%. Pode ocorrer disseminação por via hematogênica dos pulmões para os ossos, as articulações, a pele, os tecidos subcutâneos, etc.
	Micoses oportunísticas
	A maioria dos fungos que produzem micoses oportunísticas são saprófitos do meio ambiente, de crescimento rápido, normalmente inalado. Esses organismos geralmente não são patogênicos, mais atuam como patógenos oportunistas. O indivíduo que apresenta algum tipo de depressão imunitária em decorrência de doença ou em especial, do uso de medicamentos imunossupressores, antibioticoterapia por longo tempo, pode ser alvo de infecções oportunísticas.
	Zigomicose – infecção fúngica aguda causada por fungos da divisão Zigomycota, os esporos desses fungos podem infectar os seios paranasais e a área peri-orbital. A infecção rapidamente se dissemina para os vasos sanguíneos vizinhos, causando necrose e trombose, vascular (CID). A partir daí se difunde para o encéfalo e para as meninges, produzindo meningoencefalíte, rapidamente fatal. Essa doença pode se disseminar para os pulmões e para o tubo digestivo.
	Principais agentes envolvidos: Absidia sp., Apophysomyces sp., Mucor sp., Rhizopus sp., Saksenaea sp., Cunninghamella sp.. 
Feohifomicoses – Infecções causadas por fungos demáceos que apresentam hifas escuras nos tecidos. O número de agentes envolvidas é, em geral, muito grande e tende a aumentar.
Alternaria spp. – produz quadros como ceratomicose, infecções cutâneas, osteomielite, doenças pulmonares e infecção do septo nasal.
 Bipolaris spp. – causam ceratomicose e sinusite fúngica, abscessos subcutâneos, meningite, alergias e peritonite.
Cladosporium spp., Epicoccum spp. e Nigrospora spp. – causa ceratomicose e alergias.
Curvularia spp. – causam ceratomicoses, micetoma, endocardite, infecção pulmonar, alergias e infecção do septo nasal.
Exserohilum spp. – sinusite fúngica, embolia aórtica, úlcera de córnea e meningite.
Hialohifomicoses – Infecção causada por fungos hialinos (hifas hialinas)
Acremonium sp. - pode causar ceratomicose, lesões do palato duro, meningite, artrite e doenças sistêmicas.
Aspergillus sp. - o Aspergillus fumigatus é o patógeno oportunista mais comum do gênero. Aspergilose disseminada, doenças pulmonares, broncopneumonia alérgica, ceratomicose, otomicose e infecção dos seios paranasais.
Fusarium spp. - causa mais comum de ceratomicoses, onicomicoses, otomicoses, úlceras varicosas, micetoma, osteomielite. Tem sido identificado também em lesões sistêmicas em transplantados de medula óssea.
Paecilomyces spp. – implicados em casos de peniciliose, endoftalmite, endocardite, derrame pleural e lesões cutâneas.
Penicillium spp. – causam ceratomicose, peniciliose, otomicose, onicomicose e, raramente, infecções profundas. Penicillium marnefei produz uma forma disseminada de peniciliose, é o único agente dimórfico do grupo.
Scopulariopsis sp. – ceratomicose, otomicose e onicomicose.
Criptococose – Em geral produz infecções pulmonares brandas muitas vezes subclínicas. Em pacientes sintomáticos manifesta-se como tosse e febre, radiografias demonstra nódulos isolados ou múltiplos nos campos pulmonares médio e inferior que podem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Na disseminação ocorre infecção hepato-esplênica, osteomelite, comprometimento subcutâneo e nódulos cutâneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites é a forma grave da doença foi atinge grande parte de indivíduos com AIDS.
Agente etiológico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D.
Candidíse, Trichosporonose e Malasseziose – descritos anteriormente.
Leveduroses por:
Geotrichum candidum – Produz infecções orais com placas brancas semelhantes às de candidíase, ao passo que a forma intestinal da doença provoca colite e fezes sanguinolentas. As manifestações bronquiais são as mais comuns; tosse crônica e o escarro mucóide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. Já foram documentadas infecções vaginais.
Toluropsis glabrata – patógeno oportunista que geralmente provoca doenças em pacientes debilitados. Os pulmões e os rins são os órgãos mais afetados, embora esse fungo possa disseminar-se para o restante do corpo através do sangue, causando fungemia
e choque séptico.
Pneumocystis carinii – Pneumocystis se adere às células epiteliais e penetram ao citoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvéolo, produzido danos na membrana basal do alvéolo formando exudado alveolar eosinofílico. O agente não tem sido cultivado.
4.- Identificação dos Fungos
PRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS
4.a- Identificação dos Fungos
Os caracteres macromorfológicos da colônia fúngica podem variar consideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituição nutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubação. Conseqüentemente é fundamental em que meio e condições foi incubado o agente.
A análise macroscópica dos cultivos visa caracterizar.
Textura: serosa, cremosa, mucóide, membranosa, pulverulenta, granular, camurça, cotonosa.
Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme.
Aspecto: brilhante, opaco, seco, úmido.
Superfície: lisa, fissurada, rugosa.
Bordas: regulares, irregulares, radiadas.
Cor da colônia: branco, preto, verde, vermelho, etc.
Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia.
Tempo de crescimento.
Diâmetro da colônia.
Técnica de esgarçamento:
	Utilizada para identificação micromorfológica de fungos filamentosos. Com alça de platina em L, retirar um fragmento da colônia, colocar em lâmina com una gota de lactofenol azul de algodão e com auxilio de agulhas esgarçar bem. Cobrir com lamínula, comprimir levemente e observar ao microscópio com aumento 10X ou 40X. 
Cultivo em lâmina.
Nesta técnica as estruturas permanecem devem permanecer íntegras e o meio utilizado pode ser Sabouraud dextrose ágar, batata ágar, lactrimel ágar ou V8.
 Esterilizar placas de Petri com uma lâmina no interior, papel de filtro e lamínula.
 Colocar o meio de ágar em placa. Deixar solidificar.
Com a alça em L, destacar porções bem pequenas da colônia do bolor, crescida no ágar e colocar nos quatro lados do pedaço de ágar.
 Cobrir com lamínula esterilizada, pressionando levemente.
Colocar um pouco de água destilada esterilizada no fundo da placa esterilizada, repor a água esterilizada, sempre que necessário. Deixar por 10-15 dias, dependendo da velocidade de crescimento do fungo.
Para montar, retirar a lamínula com pinça estéril. Fixar o fungo na lamínula colocando 1 a 2 gotas de álcool e esperar secar. Montar essa lamínula em uma lâmina limpa, com uma gota de lactofenol azul-algodão.
A lamínula pode ser vedada com esmalte de unha ou Etellan para conservar por mais tempo.
Pode, também, ser montada a lâmina do microcultivo, retirando-se o pedaço de ágar, fixando com álcool e colocando uma lamínula limpa, com uma gota de Lactofenol azul-algodão.
A classificação e identificação dos fungos estão baseadas principalmente nos caracteres macro e micromorfológicos, assim como no método de reprodução sexual do organismo isolado. O processo de identificação de leveduras inclui testes bioquímicos, que serão discutidos posteriormente. Observamos atualmente em micologia, a participação crescente das técnicas de biologia molecular, no auxílio taxonômico. 
Nosso primeiro grande objetivo é diferenciar colônias leveduriformes e filamentosas.
1.- Observe e descreva as principais características macroscópicas das diversas colônias fúngicas a serem analisadas:
Colônias leveduriformes
b) Colônias filamentosas
			
Micromorfologia dos fungos de interesse em micologia médica
4b. Rotina de Identificação de Leveduras 
 l - ISOLAMENTO
1 - Princípio:
	Freqüentemente as leveduras crescem com bactérias em cultura, ou pode haver o desenvolvimento de mais de uma espécie de levedura no mesmo cultivo. Para a correta identificação das leveduras é essencial utilizar culturas puras. O primeiro passo portanto, consiste na purificação dos cultivos.
2 - Material utilizado:
	- água destilada esterilizado
	- alça de platina
	- cultivo de levedura a ser identificada
	- placas de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol 
3 - Técnica:
	Preparar uma suspensão da colônia em água destilada esterilizada de acordo com o no 3 da escala de MacFarland. Com o auxílio de uma alça de platina semear em estrias em placa de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol.
Incubar a 37(C por 48 horas. A cultura isolada será utilizada para as provas de identificação.
	OBS: Quando não houver crescimento ideal nesta temperatura, proceder o isolamento em outra placa e incubar à temperatura ambiente.
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ll - Prova do tubo germinativo
1 - Princípio:
	Esta é uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo é formado dentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espécies, como Candida tropicalis podem produzi-lo após 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans são positivas. 
O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por não ser septado, apresentar paredes paralelas e não possuir constrição na sua extremidade “abaulada”.
2 - Material utilizado:
	- 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc.
	- pipetas Pasteur
	- lâminas
	- lamínulas
3 - Técnica:
	Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37(C durante duas horas. Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e cobrir com lamínula. Examinar ao microscópio com objetivas de 10 x e 40x.
 4 - Estruturas observadas ao microscópio:
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lll - Prova do clamidoconídio (microcultivo)
1 - Princípio:
	Observar a existência ou não de filamentação, a produção de clamidoconídios, blastoconídios e de artroconídios, assim como a disposição destes elementos no micélio. C. albicans produz clamidoconídios arredondados em posição intercalar ou terminal em relação à pseudohifa. De modo geral, a maioria das espécies do gênero Candida formam pseudohifas bem desenvolvidas. Já as leveduras dos gêneros Torulopsis, Rhodotorula e Cryptococcus não produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentam pseudohifas rudimentares ou não as formam. A presença de artroconídios é sugestiva de Geotrichum spp. ou Trichosporon spp, este último associado a blastoconídios.
2 - Material utilizado:
	- Cultivos de 24-48 horas
	- Ágar fubá
	- Placas de Petri (90x15 mm)
	- Alça de platina com extremidade retilínea
	- Lamínulas esterilizadas
3 - Técnica:
	Fundir o meio de ágar fubá e verter sobre placa de Petri. Após a solidificação, com o auxílio de uma alça de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfície da placa e cobrir com lamínula esterilizada. Incubar a 25(C, durante 48-96 horas. Examinar ao microscópio, com objetivas de 10 x e 40x.
4 - Observação ao Microscópio:
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IV - Prova de assimilação de fontes de C e N (auxanograma)
1- Princípio
	O teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar um composto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de assimilação. Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras. Estão condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam a degradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução do nitrato.	
2- Material utilizado
	- Cultivo de 24-48 horas
	- Meio C
	- Meio N
	- Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas
	- Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas
	- Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, 		melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, 	inositol)
	- Fontes de nitrogênio (peptona e KNO3)
3- Técnica
	Preparar suspensão da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padrão 5 da escala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabilizá-los em banho Maria a 50(C durante a realização
da prova. Para verificar a assimilação de fontes de carbono, misturar 2 mL da suspensão com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Para observar a assimilação de fontes de nitrogênio, misturar 1 ml da suspensão com 20 ml do meio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Após a solidificação dos meios, distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrogênio (meio N) sobre o ágar. Incubar a 30(C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo de crescimento na área correspondente a cada fonte. 
4- Leitura
	Gli
	Gal
	Mal
	Sac
	Lac
	Raf
	Tre
	Mel
	Ram
	Dul
	Ino
	Cel
	Inu
	Man
	Xil
	KNO3
	Pep
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
V - Prova de fermentação de Açúcares (zimograma)
1- Princípio
	A habilidade de uma levedura para fermentar um determinado açúcar dependerá da presença ou ausência de um sistema de transporte que permitirá a absorção do açúcar a baixas tensões de O2 e da presença de um sistema enzimático que atuará na degradação glicolítica do açúcar com a formação de etanol e anidrido carbônico. A fermentação positiva ou negativa de um determinado açúcar é um dado complementar para diferenciar as espécies.
2- Material
	- Cultivos de 24-48 horas 
	- Água destilada esterilizada (4ml)
	- Meio de cultivo para a fermentação de açúcares: dextrose, maltose, sacarose, 		lactose, galactose, e trealose
	- Bateria de meios para fermentação (tubos de rosca com tubos de Durhan)
	- Pipeta automática calibrada para 200 microlitros
3. Técnica
	Preparar uma suspensão de leveduras (turbidez de acordo com o padrão 5 da escala de MacFarland). Inocular 200µl da suspensão em tubos de ensaio contendo os respectivos carboidratos. Incubar a 37(C por 24-72 horas. Realizar leitura observando a produção de ácido (mudança de cor do meio) e gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan). A observação da prova é válida até 20 dias após a realização da mesma.
4- Leitura
	Açúcar
	Dex
	Malt
	Sac
	Lac
	Galac
	Treal
	Gás
	
	
	
	
	
	
�
VI - Produção de Urease
1- Princípio
	É prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificação de algumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp. O dermatófito T. mentagrophytes são urease positivos.
2- Material 
	-Cultivo de 24-48 horas 
	-Meio de uréia de Christensen
3- Técnica
	Semear cultivos de 24-48 horas na superfície do meio de uréia de Christensen. Incubar à temperatura de 30(C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador.
4- Leitura
	Vermelho = positivo
	Amarelo = negativo
II - Produção de Cápsula
1- Princípio
	A formação de cápsula é observada em espécies de Cryptococcus, embora possa ocorrer em outras espécies de leveduras. A observação de cápsula no exame direto de uma levedura necessita complementação posterior da identificação através de outras técnicas (prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.).
2- Material 
	-Cultivo da levedura-problema 
	-Lâmina
	-Lamínula
	-Água destilada esterilizada
	-Tinta da China
3- Técnica
	Após homogeneizar a levedura com uma gota de água destilada e uma gota de tinta da China sobre uma lâmina, sobrepor uma lamínula e observar ao microscópio.
4- Leitura
	As preparações positivas irão mostrar a presença de uma área clara, a cápsula, em torno da célula leveduriforme, sobre um fundo negro.
VIII - Produção de pigmento no ágar-niger
1- Princípio
	Quando Cryptococcus neoformans é semeado num meio contendo extrato de semente de niger, girassol ou alpiste, as colônias tornam-se negras ou marrons devido a atividade de fenol oxidase da levedura. Colônias de outras leveduras, incluindo outras espécies de Cryptococcus irão manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado na triagem para isolamento de C. neoformans.
2- Material 
	-Meio de ágar-niger
	-Alça de platina
	-Cultivo da levedura-problema
3- Técnica
	Semear a levedura-problema em placa contendo meio de ágar-niger, pelo método do esgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC.
4- Leitura
	A colônia de C. neoformans apresenta coloração marrom ou negra.
IX - Produção de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas)
1- Princípio
	Algumas espécies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, as ascosporas. A observação dessas estruturas é importante para a identificação da levedura. Para estimular a produção de ascosporas é necessário cultivar o isolado em meios especiais
2- Material 
	-Cultivo da levedura-problema
	-Placa contendo meio de Gesso, ou V-8. 
	-Alça de platina
	-Bateria de Ziehl Nielsen
	-Lâmina
3- Técnica
	Semear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37(C ou à temperatura ambiente, de acordo com a exigência do isolado. Após 5-7 dias, realizar esfregaço em lâmina, corar pela técnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscópio com objetiva de 100 x.
4- Leitura
	Examinar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o número de ascosporas em cada asco.
	Principais estruturas microscópicas dos fungos 
Hifa: Estruturas tubulares, constituídas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem ser classificadas como hialina ou demácea)	
	Septada; dividida em compartimentos celulares através de septos parciais, completos ou perfurados.	
		
	
	Cenocítica; filamento contínuo não sendo “aparentemente” dividida por septos.					
								
	
	
2.	Blastoconídio: Organismo unicelular globoso, ovóide ou elipsóide denominado levedura. Se origina quando a célula mãe gera um ou mais indivíduos por um processo denominado brotamento ou gemulação.	
	
	
3.	Pseudohifa: Constituída pela sequência de brotamentos de leveduras sem separação entre as células filhas gerando uma estrutura alongada, de paredes não paralelas, sem septo mas com ponto de contrição entre uma célula e outra. Podem existir brotamentos laterais múltiplos que nascem a partir do ponto de contricção, formando assim o pseudomicélio.		
4.	Artroconídios: São elementos retangulares de paredes grossas formados por fragmentação das formas cilíndricas dos fungos previa divisão do material genético.
5.	Clamidoconídios: Estrutura de resistência produzida pelo fungo como resposta frente às condições adversas do meio. Células geralmente globosas ou ovóides, de volume aumentado, parede dupla e espessa. A localização no micélio pode ser intercalar, apical ou terminal. Os conídeos também podem apresentar esta estrutura.
	
Os fungos têm ciclos de reprodução assexual e sexual, onde os elementos de frutificação podem ter uma disposição interna ou externa.
1.	Zygomycota: Esporos sexuados-zigosporas. Esporos endógenos assexuados- esporangiósporos, contidos em esporângios.
3.	Ascomycotina: Em algum estágio da vida, produzem esporos endógenos sexuados- ascosporos dentro de estruturas em forma de saco denominados ascos. Segundo a morfologia do asco adquire a denominação de peritécio, apotécio ou cleistotécio.
4.	Basidiomycotina: Esporos sexuados- basidiósporos situados externamente sobre a célula mãe-baside.
5.	Chytridiomycota:
Reprodução		Disposição	Estruturas
Assexuada		Externa	Conídios, picnidioconídios
			Interna		Esporangiósporos
Sexuada		Externa	Basidiósporos
			Interna		Ascos simples, ascostroma, peritécio, cleistotécio, 						apotécio.
Observe e descreva os caracteres microscópicos dos seguintes exemplos de reprodução dos fungos.
Reprodução assexuada externa
Reprodução assexuada interna
Reprodução sexuada interna
2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscópicas dos seguintes fungos filamentosos:
 Trichophyton rubrum	 T. mentagrophytes	 T. tonsurans
Microsporum gypseum	 Microsporum canis	 Epidermophyton floccosum
 Aspergillus spp		 Penicillium spp		 Paecilomyces spp
							
 
 Fusarium spp		 Rhizopus spp			Mucor spp
 
 Phialophora spp		Cladosporium spp		 Fonsecaea pedrosoi
 Alternaria spp		 Curvularia spp		 Nattrassia mangiferae
 
 
 Sporothrix schenkii	Histoplasma capsulatum	Paracoccidioides brasiliensis
	25(				25(					25(
37(				37(					37(
�
6.- Referências bibliográficas
Arango M.; Castañeda E. Micosis Humanas Procedimentos Diagnósticos Exámenes directos. 1995.
Ellis D.H. Clinical Mycology. The human opportunistic Mycoses. P. Fazer Inc. Guillinham Printers Pty. Ltd. Australia 1994.
Hoog G.S. et al Atlas of clinical fungi. Contraolbureau oor Schimmelcultures, Netherlands/Universitat Rovira Virgili , Spain. 2000.
Kern M. A. Medical Mycology. A Self-Instructional Text. F. A. Davis Company. Philadelphia, 3 er ed 1988.
Lacaz C.Z.; Porto E.; Martin J. C. Micología Médica: Fungos, actinomicetos e algas de interese médico 7 de. São Paulo: Sarvier, 1984.
Richardson M.D. & Warnock D.W. Fungal Infection. Diagnosis and managment. Blockwell Scientific publication, london. 1er ed 1993.
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Autores
Agenor Messias Junior
Arnaldo Lopes Colombo
Eugenio Reyes Arenas
Olga Fischman Gompertz
Patrício Godoy Martinez
Victor Silva Vargas
Colaboradores
Cledja Soares deAmorim
Edméa Helena de Oliveira
Fabiane Camargo G. Nunes
Leila Paula de Almeida
Luis Zaror Cornejo
Marly Forjaz
Zelinda Maria Nakagawa
REINO EUMYCOTA
(De Hoog et al 2000)
Divisões
Ascomycota
Chytridiomycota
Basidiomycota
Zygomycota
Lamínula
Lâmina suporte
Àgar batata
Lâmina para
microcultivo
Umedecer com 4 ml de água esterilizada
MICOSES OPORTUNÍSTICAS:
ZIGOMICOSES
HIALOHIFOMICOSE
FEOHIFOMICOSE
CANDIDIASE
CRIPTOCOCOSE
ASPERGILOSE
PNEUMOCISTOSE
LEVEDUROSES
MICOSES SUPERFICIAIS:
PITIRIASES VERSICOLOR
TINHA NEGRA
PIEDRA NEGRA
PIEDRA BRANCA
MICOSES CUTÂNEAS:
DERMATOFITOSES
CANDIDIASES
MICOSES SISTÊMICAS:
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
BLASTOMICOSE
HISTOPLASMOSE
COCCIDIOIDOMICOSE
MICOSES SUBCUTÂNEAS:
ESPOROTRICOSE
CROMOBLASTOMICOSE
MICETOMAS
RINOSPORIDIOSE
ENTOMOFTOROMICOSE
MICOSE DO JORGE LOBO