Identificação de Enterobactérias

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ENTEROBACTERIAS Identificação
Prof. Dr. Bruno Jaegger Laranjeira
Características para
 identificação presuntiva
Gram: céls bacilares e cocobacilares Gram-negativas com 0,5 a 2m de largura e 2 a 4m de comprimento
 Características morfológicas: colônias secas ou mucosas relativamente grandes em ágar sangue, de cor cinza opaco; colônias vermelhas ou brancas/transparentes em ágar Mac Conkey (fermentação da lactose).
Características para
 identificação presuntiva
Presença ou não de enzimas codificadas pelo material genético dos cromossomos bacterianos  metabolismo bacterianos que podem ser detectadas em técnicas de cultivo in vivo.
Substratos são incorporados ao meio de cultura, junto com um indicador .
Características Gerais
Com poucas exceções, TODOS os membros do grupo de Enterobacteriaceae demonstram as seguintes características:
 Fermentação da glicose;
 Citocromo oxidase negativa (10 a 20 seg.);
 Redução de nitrato a nitrito (3 a 24 horas);
Meios de cultura para detecção da fermentação de Lactose
Meio ágar McConkey:
- Sais biliares e cristal violeta: inibição de CG (+)‏
vermelho neutro: indicador de pH.
EMB:
Eosina e azul de metileno: inibição de CG(+);
Ágar Tríplice Áçucar-Ferro (TSI)‏
Três açúcares:
Glicose;
Lactose;
Sacarose;
Peptonas;
Indicador de pH: vermelho de fenol;
Sulfato ferroso
Tiossulfato de sódio
Ágar Tríplice Áçucar-Ferro (TSI)‏
Ágar Tríplice Áçucar-Ferro (TSI)‏
REAÇÕES EM TSI:
Pico Alcalino/Fundo Alcalino (verm/verm): ausência de fermentação de carboidratos. Ex. Pseudomonas aeruginosa.
 Pico Alcalino/Fundo Ácido (verm/amarelo): fermentação de glicose; ausência de fermentação de sacarose (lactose). Ex. espécies de Shigella.
Ágar Tríplice Áçucar-Ferro (TSI)‏
REAÇÕES EM TSI:
Pico Alcalino/Fundo Ácido (Preto - H2S): fermentação de glicose;ausência de fermentação de lactose, produção de sulfeto de hidrogênio. Ex.: espécies de Samonella, Citrobacter e Proteus.
 Pico ácido/Fundo Ácido (amarelo/amarelo): fermentação de glicose e de sacarose (lactose). Ex.: E. coli e espécies de Klebsiella. 
Formação de gás
Formação de gás:
Clivagem do ácido fórmico → H + CO
E. coli
Shigella sp.
Proteus
Pseudomonas aeruginosa
Formiase
Ágar Tríplice Áçucar-Ferro (TSI)‏
Microrganismos que são capazes de fermentar a glicose são, em geral detectados através das reações que produzem quando cultivados em meio TSI.
TÉCNICA:
1)inoculação com um filamento reto e longo, em profundidade (3 a 5cm) do fundo do tubo. (porção aeróbia e anaeróbia).
2) 35°C durante 18 a 24 horas.
Provas para avaliar as características metabólicas
Utilização de carboidratos;
Produção de Indol;
Vermelho de metila;
Prova de Voges-Proskauer (produção de acetoína);
Utilização de citrato;
Produção de urease;
Descarboxilação de lisina, ornitina e arginina;
Produção de fenilalanina desaminase;
Motilidade;
Provas para avaliar as características metabólicas
Descarboxilação de lisina, ornitina e arginina;
Produção de fenilalanina desaminase;
Motilidade;
Provas para avaliar as características metabólicas
Produção de Indol:
- produto de degradação do metabolismo do aa triptofano  cor vermelha após a adição de uma solução que contenha p-dimetilaminobenzaldeído (reativo de Ehrlich ou de Kovac).
Prova do indol em caldo triptofano e em meio SIM
Provas para avaliar as características metabólicas
Produção de Indol:
TÉCNICA:
- Semear o caldo triptofano com o microrganismo e incubar a 35°C por 18 a 24hs;
- adição de 15 gotas do reativo de Kovacs ou Ehrlich (parede interna do tubo) 
Resultados:
+ cor vemelha = produção de indol
- cor amarela = ausência de indol 
Provas para avaliar as características metabólicas
Vermelho de metila (VM):
- Produção de ácidos orgânicos, a partir da fermentação da glicose  grande quantidade de ácidos como produto final (reativo: solução hidroalcólica de vermelho-de-metila). 
Provas para avaliar as características metabólicas
Vermelho de metila (VM):
TÉCNICA:
- Semear o meio Clark e Lubs com o microrganismo e incubar a 35°C por 18 a 24hs;
- Adição de 5 gotas do reagente (parede interna do tubo) 
Resultados:
+ cor vemelha = pH 4,5 (vence o sistema tampão)‏;
- cor amarela = pH 6,0 (produção de acetoína)‏
Via de fermentação dos ácidos mistos
Provas para avaliar as características metabólicas
Vogues Proskauer:
- Baseado na conversão de acetoína diacetil metil carbinol através da ação de hidróxido de potássio e O2 atemosférico  complexo vermelho sob a ação catalítica de -naftol e creatinina
Provas para avaliar as características metabólicas
Vogues Proskauer:
TÉCNICA:
Semear o meio Clark e Lubs com o microrganismo e incubar a 35°C por 18 a 24hs;
Adição de 0,6mL de solução de -naftol 5% + 0,2mL de solução de KOH a 40%;
Agitar suavemente para oxigenar o meio e oxidar a acetoína;
Deixar descansar o tubo por 10 a 15 min.
Provas para avaliar as características metabólicas
Vogues Proskauer:
Resultados:
+ cor vemelha = presença de acetoína
- cor cobre = ausência de acetoína
Via de Fermentação do butileno glicol
Ação Catalítica
Acetil-metil-carbinol
+ α-naftol e KOH 40%
Provas para avaliar as características metabólicas
Teste do citrato:
Determinar a capacidade de um microrganismo utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para metabolismo e crescimento;
Indicador de pH é o azul de bromotimol e também é adicionado fosfato de amônia.
Provas para avaliar as características metabólicas
Teste do citrato:
TÉCNICA:
- Semear o meio de citrato de Simmons com o microrganismo e incubar a 35°C por 18 a 24hs;
Resultados:
+ cor azul = meio alcalino (pH 8,4)‏
- cor verde = meio neutro sem crescimento (pH 6,9)‏
Urease 
bactérias que possuem a enzima urease → degradação da uréia liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a coloração “pink”. 
Caldo uréia de Stuart
Ágar uréia de Christensen
Fenilalanina Desaminase 
Bactérias que produzem enzimas que desaminam a fenilalanina no meio → ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico adicionado ao meio, desenvolvendo cor verde 
Presuntiva para Proteus, Morganela, Providencia 
Provas para avaliar as características metabólicas
Descarboxilação da lisina, ornitina e arginina
Muitas espécies de bactérias possuem enzimas que podem descarboxilar aa específicos no meio da prova, originando aminas de reação alcalina e CO2. Os aa + estudados e as aminas produzidas são:
Lisina  cadaverina
Ornitina  putrescina
Arginina  citrulina
Provas para avaliar as características metabólicas
TÉCNICA:
- Semear o caldo base de Moeller + 10g do aa de interesse (Cf 1%) com o microrganismo e incubar a 35°C por 18 a 24hs;
- Colocar óleo mineral até 1cm acima da superfície do meio (ambiente anaeróbio).
Resultados:
 - amarelo = pH ácido
+ púrpura = pH alcalino (descarboxilação do aa).
Útil para diferenciar entre Klebsiella (negativo) 
e Enterobacter (positivo) 
Positivo
Negativo
Motilidade
Ágar semi-sólido (0,4% ou menos);
Meios MILI e MIO (fundo levemente turvo) ou outro meio caso as bactérias tenham crescimento lento;
interpretação via exame macroscópico do meio para determinar zona difusa de crescimento projetada a partir da linha de inoculação.
Temperatura de acordo com a sp. bacteriana. 
Paciente da UTI, 32 anos, HIV positivo, adquiriu uma pneumonia. Foi colhido um lavado brônquico do paciente e enviado ao laboratório. O lavado foi semeado de maneira semi-quantitativa em meios, ágar sangue, ágar McConkey, ágar chocolate e caldo BHI. Após 24 h, ±36ºC, na estufa, foi observado crescimento bacteriano, > 40.000 colônias, colônias rosa pálido, que apresentou as seguintes características bioquímicas: TSI= amarelo/amarelo, gás (++) H2S(-), VP(+), indol (-), citrato (+), Fenil (-), uréia (+), motilidade(-), lisina (+), arginina e ornitina (-).O biomédico deve considerar a contagem? Justifique sua resposta.Qual a bactéria em questão?