aula11_Testes Bioquímicos e Atividade Enzimática (1)

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Identificação de bactérias
As colorações simples diferenciais ou estruturais,
mesmo se combinadas com diferentes tipos de
cultivo e observação das características das
colônias, não são suficientes para a identificação
de bactérias isoladas.
Os testes bioquímicos são amplamente utilizados
em associação com resultados obtidos através da
coloração e cultivos, servindo como prova
definitiva na identificação das bactérias isoladas,
visto que as propriedades metabólicas são únicas
para cada espécie.
Identificação de bactérias
Esta classificação das bactérias em relação às
suas características bioquímicas se dá porque
tipos diferentes os micro-organismos apresentam
tipos diferentes de vias metabólicas para obtenção
de energia (fermentação, respiração ou ambos),
bem como podem possuir enzimas especificas
utilizadas no processo de metabolização dos
diferentes substratos contidos nos meios de
cultivo.
Os testes bioquímicos para identificação dos
micro-organismos podem ser divididos: tipos de
metabolismo e atividade enzimática.
Testes
→ Fermentação de carboidratos;
→ Teste da catalase;
→ Teste da utilização de citrato;
→ Presença de descarboxilases;
→ Teste da uréase;
→ Teste da β-galactosidade;
→ Liquefação da gelatina;
→ Produção de H2S;
→ Teste do indol;
→ Teste do vermelho de metila;
→ Teste Voges-Proskauer;
→ Redução do nitrato;
→ Teste oxidação/fermentação;
→ Hidrolise do amido;
→ Teste da motilidade.
Identificação de bactérias
Após a análise de todos os testes bioquímicos,
expressados na maioria das vezes como positivo
ou negativo, os resultados poderão ser agrupados
e a bactéria identificada de acordo com as
características já preestabelecidas através de
esquemas de identificação.
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Reações de Caracterização para Coliformes (IMViC)
Esquema de inoculação para as reações de caracterização de
Coliformes
Reações IMViC
(I) Indol : Utilizado para caracterizar e/ou identificar bactérias
entéricas, que são capazes de produzir indol a partir do aminoácido
triptofano, através da enzima triptofanase.
+ +
0 Meio de cultura: caldo triptona ou caldo peptona;
0 Reagente de Kovac (p-dimetillaminobenzaldeido, butanol e ac.
clorídrico);
0 Inóculo (micro-organismo) : bactéria do grupo coliforme;
0 Incubação: 24 a 48 horas a 35ºC.
triptofanase
Triptofano Indol Amônia ácido pirúvico
(I) Indol 
Interpretação dos resultados: após incubação durante 24 a 48 horas a 
35ºC, juntar à cultura crescida 0,2 a 0,3ml do reagente de Kovac’s.
o Teste positivo : aparecimento de um anel sobrenadante vermelho
intenso indicando a presença de indol;
o Teste negativo: a cor do reagente permanece inalterada.
(B)Vermelho de Metila: comprova a capacidade de um organismo
de produzir e manter estáveis produtos finais ácidos da fermentação
da glicose.
 Meio de cultura: caldo-glicosado-fosfatado (meio de Carky Lubs) 
 Cultura: bactéria do grupo coliforme.
GLICOSE Ácido pirúvico
Várias 
Enzimas
Ácido lático;
Ácido acético;
Ácido succínico;
Ácido fórmico;
Etanol;
Dióxido de carbono;
Gás hidrogênio
MECANISMO DA REAÇÃO: pH < 4,4 vira o indicador para vermelho.
Interpretação: após incubação a 35ºC por 48h, ou 30ºC por 3 a 5
dias, juntar 2 a 3 gotas do indicador vermelho de metila
 Cor vermelha indica teste positivo
 Cor amarela indica teste negativo.
(C) Voges Proskauer:
determina a capacidade de um organismo de produzir um produto final
neutro da fermentação da glicose, o acetilmetilcarbinol (acetoína).
o Meio de cultura: caldo-glicosado-fosfatado (meio de Carky Lubs)
o Culturas: Eschericha coli (-) e Enterobacter aerogenes, B.subtilis (+)
Glicose Ác. Pirúvico Fermentação
via butilenoglicólica
Acetoína
Reagente de Barrit A (alfa naftol)
Reagente de Barrit B (KOH)
Anel Vermelho
MECANISMO DA REAÇÃO
+
+
Interpretação: após 48 horas de incubação, retira-se com pipeta estéril
1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6ml de
solução de -naftol e 0,2 ml de KOH a 40 %. Agita-se vigorosamente e
deixa-se em repouso em estufa a 35oC. Observa-se a partir de 15 minutos
até um máximo de 4 horas.
O aparecimento de uma coloração cereja que se estende da superfície para o
fundo do tubo indica um teste Voges Proskauer positivo.
O aparecimento de uma coloração acobreada ou mesmo vermelha indica teste
negativo.
GLICOSE
Ácido
Pirúvico
Acetilmetil carbinol
(acetoína)
Butilenoglicol Diacetilo
ác. lático, ác. acético
ác. succínico, ác. fórmico 
Complexo vermelho cereja
Fermentação 
ácida mista 
Esquema Bioquímico
KOH + 
Ar
a- naftol
Vermelho
Prova VP positiva Prova VM positiva
pH < 4,4
vira o indicador 
para vermelho
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D) Teste de citrato: avalia a capacidade de um micro-organismo em
utilizar o citrato como única fonte de carbono
 Meio de cultura: meio de citrato (citrato de Koser ou citrato de Simmon)
 Culturas: Eschericha coli e Enterobacter aerogenes
MECANISMO DA REAÇÃO Citrato de sódio
+
Fosfato de amônia
Fermentação do Citrato
Hidróxido de amônia, carbonato de sódio + 
azul de bromotimol (indicador)
Azul
Interpretação do teste de citrato: após 24-48 horas de incubação em 
meio citratado, observa-se: 
 Meio líquido de citrato de Koser
Crescimento visível (o meio fica turvo): prova positiva;
Ausência de crescimento (o meio permanece límpido): prova negativa
 Meio solidificado de Simons
+ virada do indicador azul de bromotimol de verde para azul;
- cor inalterada.
DIFERENTES COMBINAÇÕES DE RESULTADOS 
DE TESTE DE IMViC
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http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/IMViC1.jpg
http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/IMViC2.jpg
http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/IMViC3.jpg
Com os resultados dos quatro testes anteriores pode-se determinar
o gênero do coliforme isolado através da Tabela 1, que fornece uma
interpretação dos resultados das reações do IMViC.
Microrganismo Indol Vermelho 
de Metila
Voges
Proskauer
Citrato
Eschericha coli
Variedade I
Variedade II
+
-
+
+
-
-
-
-
Citrobacter freundii
(Intermediário)
Variedade I
Variedade II
-
+
+
+
+
-
+
-
Enterobacter 
aerogenes
Variedade I
Variedade II
-
+
-
-
+
+
+
+
TABELA 1: Interpretação das reações IMViC
Interpretação das reações IMViC
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Fermentação de carboidratos
Determina a capacidade de um organismo de fermentar (degradar) um
hidrato de carbono específico incorporado a um meio básico,
produzindo ácido ou ácido com gás.
Meio de cultura: meio de cultura simples com baixa concentração de
peptona e altas concentrações de açúcares como glicose, lactose etc. O
meio contém um indicador (vermelho de fenol), o qual se apresenta na
cor amarela em pH abaixo de 6,8 ou na cor vermelha em pH acima de
7,4; e tubo de vidro de Durham.
Interpretação:
Glicose(+) e produção de gás(+) Glicose(-) e produção de gás(-)
http://4.bp.blogspot.com/_nW0PD0NVfZQ/Ste2q5pj0rI/AAAAAAAAACs/c-4kBEwU0kQ/s1600-h/046.JPG
0 Prova da Amilase: determina se o microrganismo possui a enzima 
amilase que hidroliza o amido
0 Meio: ágar simples contendo aproximadamente 0,2% de amido
0 Culturas: Bacillus subtilis (+); Bacillus megaterium(- ) Proteus vulgaris (-)
Alfa amilase
H2O
Alfa-D-glicose
Alfa amilase
H2O
Alfa-D-glicose
Procedimento: Após inoculação do micro-organismo, a placa é
incubada a 35°C por pelo menos 48h. Passado o período de incubação,
a superfície da placa é coberta com uma solução de iodo (pode ser lugol
da coloração e Gram), para a revelação da prova.
Interpretação:
0 ( + ): a presença de uma zona
clara ao redor do crescimento
indica a utilização do amido;
0 ( - ): meio azul para amido
insolúvel e marron para amido
parcialmente solúvel.
TESTE DA CATALASE
 Princípio: Determinar a habilidade de um determinado micro-
organismo emdegradar enzimaticamente o peróxido de hidrogênio,
com formação de água e oxigênio (formação de bolhas). Produzem
a enzima catalase.
 Técnica: Gotejar sobre a biomassa microbiana, o reagente
peróxido de hidrogênio a 3%. Observar a formação de bolhas.
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Provas no Meio de Leite
diferencia micro-organismos sobre a base de suas múltiplas reações 
metabólicas em meio de leite.
0 Meio de cultura: meio de leite (litmus) com indicador de pH (azul de 
tornassol ou azul de bromocresol).
0 Culturas: Lactobacillus bulgariccus (+)
Streptococcus termophyllus (+)
Salmonella (-)
Interpretação
0 A) Fermentação da lactose produção de ácidos: meio amarelo;
0 B) alcalinidade  não ocorre fermentação da lactose mas ocorre
atuação nas substâncias nitrogenadas liberando amônia azul;
0 C) formação de coágulo e digestão: alguns micro-organismos
promovem a formação de coágulo devido ao aumento do pH do meio,
mas depois o coágulo se desfaz devido à ação de enzimas proteolíticas
produzidas pelos micro-organismos.
Teste do Manitol
 Grupo 1- Staphylococcus aureus;
 Grupo 2 - grupo das espécies
de Staphylococcus que não são
S. aureus.
 Isso é possível, pois somente
os S.aureus fermenta o manitol,
acidificando o meio que de rosa passa
para amarelo.
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o Meio é o Ágar Hipertônico Manitol, que possui uma concentração
muito elevada de sal, o que impede que a grande maioria das
bactérias cresça.
o É utilizado na diferenciação de bactérias do
gênero Staphylococcus em dois grupos:
Teste em Meio TSI (Triplice Sugar Iron)
Avalia a capacidade de um organismo atacar um hidrato de
carbono específico incorporado em um meio de cultura básico,
com produção ou não de gases ou possível produção de ácido
sulfídrico (H2S).
0 Meio de cultura: O meio apresenta a proporção de Glicose :
Lactose : Sacarose 1:10:10 (g/L), há também tiossulfato de sódio,
sulfato ferroso e peptona. O indicador de pH é vermelho de fenol
(pH ácido indicador fica amarelo; pH alcalino o indicador fica
vermelho).
0 Técnica: Inocular a cultura com alça em agulha em meio de
cultura distribuído em tubo de ensaio.
0 Culturas: Eschericha coli , Salmonela typhosa,
Pseudomonas aeruginosa
Interpretação
0 Teste de Fermentação e liberação de gases
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http://2.bp.blogspot.com/_w-cD4iiccqU/R1nWybY9M0I/AAAAAAAAAB8/5acytUagQg4/s1600-h/ferm..png
0 Teste para H2S: Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato
redutase ela irá catalisar a reação de degradação do tiossulfato de
sódio presente no meio produzindo H2S, este reage com o sulfato
ferroso formando um precipitado preto de sulfeto ferroso. Para que
esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido, assim se
a base do tubo estiver negra deve ser lida como que a bactéria é
fermentadora de glicose.
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Prova em meio de Kligler
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0 Liquefação da Gelatina: determina a capacidade de um organismo de 
produzir enzimas do tipo proteolítica (gelatinase) que hidrolizam a 
gelatina.
0 Meio: meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de 
gelatina 
0 Culturas: Staphyococcus aureus (patogênico +) e St. Epidermidis (+ 
tardiamente) , Bacillus (+), e Enterobactérias , Serratia e Proteus ( -)
0 Resultado: Após incubação a 35º C durante 24 a 48 h as culturas são 
colocadas no refrigerador a 4º C durante 30 minutos, ou em banho de 
gelo durante 3 a 5 minutos. 
-meio sólido
+ meio 
líquido 
Proteína + H2O Polipeptídeos
+
H2 O
Aminoácidos individuais
Gelatinase
Gelatinase
Métodos rápidos para caracterização: sistemas
multitestes
0 Enterotube IIR
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Haste de metal usada 
para inocular
Compartimentos 
do Enterotube
É um sistema com 
meios de cultura 
específicos contidos 
em compartimentos 
distintos.
É utilizado para a 
identificação de 
enterobactérias..
Resultado:
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Kits para caracterização de bactérias
0 Tiras API 20E: reações de caracterização de enterobactérias
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0 FOOD System Descrição: Food System é um sistema de 24
poços com substratos bioquímicos desidratados e meios de cultura
para a pesquisa e presumível identificação de microrganismos em
carnes, leite e queijo, peixe e outros produtos alimentares.
O sistema fornece a pesquisa e a
presumível identificação de
Salmonella spp., Citrobacter spp,
Proteus spp./Providencia spp.,
Pseudomonas spp., Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus
cereus, Listeria spp., fungos e
leveduras.
O sistema é inoculado com a
suspensão da amostra alimentar e
incubado a 36ºC ± 1ºC durante 18 a
24 horas.
http://www.frilabo.pt/fcms/index2.php?option=com_content&task=view&id=470&pop=1&page=0