Relatorio sobre Separação de Pigmentos Vegetais por Cromatografia em Coluna

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ÍNDICE 
I – RESUMO .................................................................................... 2 
II – INTRODUÇÃO .......................................................................... 3 
III – OBJECTIVOS .......................................................................... 5 
OBJECTIVO GERAL ..................................................................................... 5 
OBJECTIVOS ESPECÍFICOS
 .................................................................... 5 
IV – REVISÃO BIBLIOGRAFICA .................................................. 6 
V – PROCEDIMENTOS
 ................................................................ 8 
VI – RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................ 10 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA. ............................................................ 10 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ......................................... 11 
VII – CONCLUSÃO ....................................................................... 14 
VIII – BIBLIOGRAFIA .................................................................. 15 
IX – ANEXOS ................................................................................. 16 
 
 
 
 
 
 
 
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I – RESUMO 
 
Nesta prática fez-se a separação dos pigmentos de clorofila e carotenoide do 
espinafre utilizando a técnica da cromatografia em coluna tendo a 
monitoração sido feita mediante a cromatografia em camada delgada, a 
realização da prática foi dividida em grupos, em que alguns grupos faziam a 
preparação do espinafre macerado afim de preparar-se o resíduo sólido e a 
parte líquida que era utilizado para a separação da clorofila e do carotenoide 
enquanto que outros grupos faziam a separação da clorofila sendo e do 
carotenoide. 
Vale ressalvar que a separação era favorecida pela afinidade ou não que a 
clorofila e o carotenoide tinham com os solventes (n-hexano e acetona), onde 
também foi possível inferir sobre o caráter polar dos mesmos (clorofila e 
carotenoide). O carotenoide como teve interação com o n-hexano (apolar) foi 
dado como ligeiramente polar, enquanto que a clorofila teve afinidade com a 
(acetona) tendo sido dada como polar. 
 Após a obtenção da clorofila e do carotenoide fez-se a medição dos seus Rf´s 
para depois fazer a comparação com as amostras de clorofila e de carotenoide 
já obtidas. 
Para culminar a prática fez-se a caracterização da clorofila e carotenoide 
obtidos por meio de espectroscopia no infravermelho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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II – INTRODUÇÃO 
 
Extratos vegetais são geralmente, misturas complexas constituídas de 
diversos compostos com grupos funcionais diferentes. A separação destas 
substâncias, tanto para identificação ou, em maior quantidade, para a 
realização de ensaios farmacológicos, é um processo lento que envolve 
adsorventes caros e grandes quantidades de solventes. (Morrison e Boyd). 
O espinafre (Spinacia oleracea) é uma erva rasteira originária do centro e 
sudoeste da Ásia, pertencente à família das amarantáceas, cujas folhas são 
comestíveis. É uma planta anual (raramente bianual), que cresce até cerca de 
30 cm de altura. O espinafre pode sobreviver durante o inverno em zonas 
temperadas. As folhas são alternadas, simples, de ovaladas a triangulares na 
base, muito variáveis em tamanho, desde 2–30 cm de extensão e 1–15 cm de 
largura, com folhas maiores na base da planta e menores no topo. 
(Wikipédia.com, acessado em 10 de Novembro de 2017) 
Dentro dos espinafres podem ser encontrados pigmentos, dentre os quais 
mencionamos: 
 Clorofila que são pigmentos vegetais cuja função é a fotorrecepção de 
luz nos comprimentos de onda entre o azul e o verde refletindo-a em 
diferentes tonalidades de verde. São as responsáveis pela fotossíntese 
sintetizando dióxido de carbono e água utilizando a luz como fonte 
energética. Existem quatro tipos de clorofila a, b, c e d. Entre as quais 
a primeira é essencial à fotossíntese. (Morrison e Boyd). 
 
 
 
 
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 Carotenoides sendo moléculas lipossolúveis que podem apresentar 
tonalidades amarela, alaranjada ou vermelha, estão amplamente 
presentes nas plantas e actuam como precursores da vitamina A em 
animais. O seu sistema de ligações duplas conjugadas confere-lhes 
algumas das suas actividades biológicas como a antioxidante por 
exemplo. têm sido também utilizados como aditivos alimentares e em 
alguns produtos farmacêuticos. Moura Andrade et al. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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III – OBJECTIVOS 
 
OBJECTIVO GERAL 
v Efectuar a separação dos pigmentos de clorofila e de carotenoides do 
espinafre por intermédio da cromatografia em coluna. 
 
OBJECTIVOS ESPECÍFICOS
 
Proporcionar aos estudantes os critérios básicos de uma cromatografia em 
coluna frisando : 
v O tipo de fase móvel/fixa a ser utilizada;
A relação entre a 
cromatografia em coluna e a cromatografia em camada delgada (CCD). 
v A maior/menor afinidade da amostra com uma ou outra fase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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IV – REVISÃO BIBLIOGRAFICA 
 
A cromatografia é um método de separação e caracterização de misturas sendo uma 
técnica de purificação em que as moléculas presentes numa dada mistura são 
separadas com base na sua solubilidade em diferentes solventes (fase móvel) 
e mobilidade num dado substrato (fase estacionária) visto que a separação 
ocorre devido ao fato das moléculas possuírem uma propriedade chamada polaridade em 
comum e tenderem a se atrair mutuamente. Uma molécula polar é aquela que possui uma 
região com excesso em electrões e outra região com falta de electrões. Estas regiões às 
vezes são representadas como sendo negativamente e positivamente carregadas, 
respetivamente. Moléculas polares são unidas por forças de atração entre cargas opostas 
de moléculas diferentes. (Collins et al, 1995) 
Esta técnica é fundamentada na migração diferencial dos componentes de 
uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases 
imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de 
combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica 
extremamente versátil e de grande aplicação. (Morrison e Boyd). 
As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-
se diversos critérios, tais como formafísica do sistema cromatográfico, a fase 
móvel empregada, a fase estacionária utilizada e o modo se separação. Assim, 
a grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias tornam 
essa técnica extremamente versátil e de grande aplicação. (Morrison e Boyd). 
Existem vários meios de se avaliar o cromatograma. Do ponto de vista 
qualitativo (visual) pode-se efetuar a avaliação apenas dispondo de uma 
câmara UV, contendo lâmpadas capazes de emitir luz nos comprimentos de 
onda de 254nm e 366nm. Neste caso as manchas são visualizadas e suas 
distâncias de migração calculadas. Esta distância da amostra se comparada 
 
 
 
 
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com a distância de migração do padrão diz respeito à “qualidade da amostra”. 
Isto é calculado através do Rf (fator de retardamento). Rf é a relação entre as 
distâncias percorridas pelo composto e pela frente do solvente. (Collins et al, 
1995). 
A seguir é apresentado um esquema sobre os tipos de cromatografia: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esquema nº01: Tipos de cromatografia.(Collins et al, 1995). 
 
 
Cromatografia 
Planar Coluna 
Centrífuga CCD CP Líquida CSC Gasosa 
Clássica CLAE CG CGAR 
 
 
 
 
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V – PROCEDIMENTOS
 
 
PREPARAÇÃO DO EXTRACTO DE ESPINAFRE 
Pesamos 10 gramas de espinafre (uma ou duas folhas); maceramo-los em um 
almofariz e com a ajuda de uma espátula transferimos o sólido para um 
béquer. Preparamos 30 mL de uma solução de n-hexano/acetona (1:1) e 
adicionamo-las ao béquer contendo o espinafre. Deixamos a solução em 
repouso por 15 minutos. Após esse período transferimos a solução líquida para 
outro béquer e adicionamos dois gramas de sulfato de magnésio para eliminar 
possíveis resíduos de água. Em seguida, filtramos a solução resultante para 
um erlemeyer e adicionamos 2 gramas de sílica gel. Levamos a solução ao 
evaporador rotatório de modo a evaporar a mistura de solvente. 
 
PREPARAÇÃO DA COLUNA CROMATOGRÁFICA
	
Num béquer, pesamos 6 gramas de sílica gel, e dissolvemo-los em n-hexano. 
Paralelamente colocamos um pedaço de algodão na coluna cromatográfica e 
com a torneira aberta adicionamos hexano até ao meio da mesma. 
Adicionamos lentamente a solução de sílica gel e de hexano até mais ou menos 
3/4 da coluna (tomamos cuidado para não deixar a coluna secar). Após a 
adição de toda a sílica; adicionamos o extracto de espinafre com cuidado de 
modo a ter uma superfície plana. Em seguida adicionamos lentamente uma 
pequena quantidade de hexano; abrimos a torneira e colectamos as fracções 
em tubos de ensaio (trocamos o tubo de ensaio após o solvente ocupar metade 
da capacidade do mesmo). Adicionamos pequenas quantidades de solvente na 
coluna para que essa não seque. Quando todo o carotenoide foi colectado 
 
 
 
 
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(solução amarela) mudamos o solvente de hexano para acetona, de modo que 
as fracções de clorofila começaram a ser colectadas. 
OBS: Se a coluna começar a apresentar rachaduras devido ao calor; embeba 
um pedaço de algodão em acetona e fixe-o na parte exterior da coluna em que 
surgir a rachadura. 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
	
A cromatografia em camada delgada pode servir como base de monitoramento 
da coluna, especialmente quando os materiais a serem separados não 
apresentarem coloração alguma (que não é o nosso caso). Entretanto, 
efectuamos para fins de confirmação. 
Preparamos uma solução de hexano e acetona 4:1 e transferimo-las para a 
vuba cromatográfica. Pegamos uma placa cromatográfica e com o auxílio de 
um lápis traçamos duas linhas a frente do solvente e a linha de aplicação da 
amostra. Em zonas equidistantes aplicamos as frações colectadas com um 
intervalo de um tubo de ensaio (2, 4, 6...etc.) e em seguida colocamos a placa 
na câmara e após a eluição do solvente revelamos a placa com a ajuda da 
lâmpada de ultravioleta. 
Juntamos as fracções dos mesmos extractos e transferimo-los para um balão, 
evaporamos o solvente no evaporador rotativo. Adicionamos uma quantidade 
mínima de acetona para solubilizar os pigmentos e após a volatilização da 
acetona efectuamos um espectro no infravermelho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VI – RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA. 
Durante a cromatografia em coluna utilizou-se o n-hexano primeiro para 
poder retirar o carotenoide, isso deve-se ao facto de que geralmente apolar se 
dissolve em apolar, onde o hexano por ser um alcano ou seja por possuir 
ligações simples entre os átomos de carbono e hidrogénio, não possuir nenhum 
grupo que retire ou que doe electrão a molécula e também por possuir uma 
geometria favorável é apolar tal como o carotenoide que é um polieno (possui 
varia ligações duplas) e não possui nenhum grupo que retire ou doe electrões 
a molécula também é uma molécula apolar que prova que neste caso se 
cumpre a regra de que apolar dissolve apolar e que polar dissolve polar. 
Para a retirada da clorofila utilizou-se a acetona que é uma substância polar 
pois possui um grupo carbonilo e o oxigênio do grupo carbonilo por ser mais 
electronegativo que o carbono atrai a densidade de electrões do carbono para 
aumentar a polaridade da ligação tornando assim a molécula polar, a clorofila 
possui vários grupos carbonilos logo é também uma substância polar, fazendo 
assim com que eles têm afinidade entre si e isso permite a remoção da clorofila 
do espinafre em coluna fraccionada pela acetona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
Foi feita a cromatografia em camada delgada duas vezes na 1ª utilizou-se uma 
mistura de hexano/acetona na proporção 5:1 como eluente, a amostra foi o 
espinafre e verificou-se que o carotenoide presente tinha maior afinidade do 
que a clorofila. Na 2ª fez-se a separação do carotenoide e da clorofila e por 
cromatografia em coluna e fez com as amostras obtidas a cromatografia em 
coluna esperava-se que o carotenoide tivesse maior afinidade pois o eluente 
era 83,3% apolar, mas não foi isso que se verificou na pratica, pois, a clorofila 
3 apresentou maior afinidade do que o carotenoide. 
Os resultados obtidos são apresentados nas tabelas abaixo. 
Tabela 1 – Dados obtidos 
AMOSTRAS DA (cm) DS (cm) Rf 
Carotenoides 6,050 
 
6,300 
0,960 
Clorofila 1 1,100 0,175 
Clorofila 2 5,250 0,833 
Clorofila 3 6,150 0,976 
Tabela 2 – Dados Obtidos 
AMOSTRAS DA (cm) DS (cm) Rf 
Carotenoides 6,00 
 
6,300 
0,95 
Clorofila 1 1,65 0,26 
Clorofila 2 0,50 0,08 
Clorofila 3 0,25 0,04 
DA – Distância percorrida pela substância; 
 
 
 
 
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DS – Distância percorrida pelo eluente; 
Rf – Factor de Retenção. 
 
ESPECTRO DE INFRAVERMELHO 
CAROTENOIDE 
 
Fig. 1 – Espectro do Carotenoide 
 
Tabela 3 – Identificação das ligações a partir do espectro de infravermelho do carotenoide 
Numero de Onda Grupo Funcional / Ligações 
769,23 –(CH2)n– 
1015,59 – 1088,36 –CH=CH– 
1259,10 CH3 
79
6.
23
10
15
.5
9
10
88
.3
6
12
59
.1
0
 55
 60
 65
 70
 75
 80
 85
 90
 95
 100
%
Tr
an
sm
itta
nc
e
 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 
Wavenumbers (cm-1)
 
 
 
 
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CLOROFILA 
Fig. 2 – Espectro da Clorofila 
 
Tabela 4 – Identificação das ligações a partir do espectro de infravermelho da clorofila 
Numero de Onda Grupo Funcional / Ligações 
688,68 – 759,18 Grupo Etila 
1682,89 C=O de Amidas 
3353,93 N–H 
 
 
 
 
68
8.
68
75
8.
18
16
82
.8
9
33
53
.9
3
 45
 50
 55
 60
 65
 70
 75
 80
 85
 90
 95
 100
%
Tr
an
sm
itta
nc
e
 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 
Wavenumbers (cm-1)
 
 
 
 
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VII – CONCLUSÃO 
 
Comprovou-se mais uma vez a afirmação de que “Substâncias polares tendem 
a se dissolver em substâncias polares e substâncias apolares tendem a se 
dissolver em solventes apolares ” isso porque os carotenoides se dissolveram 
no hexano e a clorofila na acetona. 
A separação dos carotenos e da clorofila foi um sucesso foi possível obter 
ambos em diferentes estágios da pratica. 
Durante a cromatografia em camada delgada houve uma anomalia onde 
verificou-se que uma das amostras de clorofilas obtidas possui maior 
afinidade do que o carotenoide, uma das possíveis causas desta anomalia é a 
contaminação das amostras durante evaporação dos solventes. 
De forma geral foi uma pratica positiva pois cumpriu-se todos os objectivos e 
obtivemos as amostras pretendidas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VIII – BIBLIOGRAFIA 
 
Constantino, M. (2004). Fundamento de Química Experimental. Em M. 
Constantino, Fundamento de Química Experimental. São Paulo. 
EATON. (1989). Laboratory Investigations in Organic Chemistry. Em 
EATON, Laboratory Investigations in Organic Chemistry. 
Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S. Introdução a métodos 
cromatográficos. 6 ed. Campinas SP: Editora da Unicamp. 1995. Pgs 13-20. 
Moura-Andrade, G. C. R.; Oetterer, M.; Tornisielo, V. L. O tomate como 
alimento – Cadeia produtiva e reíduos de agrotóxicos. Pesticidas: r. ecotoxicol 
e meio ambiente, Curitiba v. 20 jan/dez 2010. P. 59 
Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgânica; Fundação Calouste 
Gulbenkian; 9a ed; Lisboa; 1992. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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IX – ANEXOS 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3 – Espinafre 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4 – Preparação do Extracto de Espinafre 
 
 
 
 
 
Fig. 5 – Extracto de Espinafre 
 
 
 
 
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Fig. 6 – Sílica Gel 
 
 
 
 
 
 
Fig. 7 – Hexano 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8 – Pesagem da sílica 
 
 
 
 
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Fig. 9 – Eluente da Cromatografia em Camada Delgada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 10 – Esquema da Destilação Fracionada