AVALIAÇÃO DE UMA SEMI-NESTED PCR PARA DETECÇÃO DO HPV EM AMOSTRAS CERVICO-VAGINAIS DE ESTUDANTES UNIVERSITÁRIAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
LETÍCIA ROBERTA SOUSA VILHENA DA SILVA 
LETÍCIA SOUZA DA SILVA 
 
 
 
 
AVALIÇÃO DE UMA SEMI-NESTED PCR PARA DETECÇÃO DO HPV EM 
AMOSTRAS CERVICO-VAGINAIS DE ESTUDANTES UNIVERSITÁRIAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
BELÉM – PARÁ 
2018 
 
 
LETÍCIA ROBERTA SOUSA VILHENA DA SILVA 
LETÍCIA SOUZA DA SILVA 
 
 
 
 
AVALIÇÃO DE UMA SEMI-NESTED PCR PARA DETECÇÃO DO HPV EM 
AMOSTRAS CERVICO-VAGINAIS DE ESTUDANTES UNIVERSITÁRIAS 
 
Trabalho de Conclusão de Curso 
apresentado à Faculdade de Farmácia, no 
Instituto de Ciências da Saúde, da 
Universidade Federal do Pará, como 
requisito parcial para obtenção do Grau de 
Farmacêutico. 
 
 
Orientadora: Profª. Drª. Maísa Silva de 
Sousa 
 Co-orientação: Msc. Rodrigo Covre Vieira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BELÉM – PARÁ 
2018 
 
 
AVALIÇÃO DE UMA SEMI-NESTED PCR PARA DETECÇÃO DO HPV EM 
AMOSTRAS CERVICO-VAGINAIS DE ESTUDANTES UNIVERSITÁRIAS 
 
Trabalho de Conclusão de Curso 
apresentado à Faculdade de Farmácia, no 
Instituto de Ciências da Saúde, da 
Universidade Federal do Pará, como 
requisito parcial para obtenção do Grau de 
Farmacêutico. 
 Orientadora: Profª. Drª. Maisa Silva de Sousa 
 Co-orientação: Msc. Rodrigo Covre Vieira 
 
Aprovado em: ____/____/2018 Conceito: 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
Profª. Drª. Maisa Silva de Sousa 
Orientadora 
 
 
Msc. Rodrigo Covre Vieira 
Co-orientador 
 
 
Prof°. Drº. Eduardo Dias Almeida 
Examinador 
 
 
Profª. Drª. Fabíola Elizabeth Villanova 
Examinadora 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
À Deus, pela dádiva da vida, pelo cuidado em todos os momentos comigo, 
por iluminar minha mente nas fases mais difíceis e por me dá paz e sossego quando 
mais precisava. 
 Meus agradecimentos à Universidade Federal do Pará, ao Laboratório de 
Biologia Molecular do Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará 
e ao Laboratório de Citologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade 
Federal do Pará. 
 Aos meus queridos pais Lucirene Sousa Vilhena da Silva e Lusinaldo Roberto 
Souza da Silva minha eterna gratidão, carinho e confiança, vocês são a base da 
minha formação, a minha força de cada dia, obrigada pela dedicação, amizade e 
amor. 
À minha família, que esteve presente em todos os momentos da minha vida, 
torcendo e me desejando muito êxito e sucesso nos meus projetos, especialmente 
as minhas avós Ana Vilhena e Emerentina da Silva 
 À orientadora, Maísa Sousa da Silva, por toda dedicação, exercendo seu 
papel de orientação com sabedoria, pelo aprendizado, pela inspiração e orientação 
científica. 
 Ao co-orientador, Rodrigo Covre Vieira, pelo incentivo, paciência, apoio, 
dedicação, confiança, ensinamentos e pela ajuda em todas as etapas do 
desenvolvimento deste trabalho. 
A minha dupla de TCC, Letícia Souza, pela confiança, comprometimento e 
por ter me ajudado a torna esse sonho realidade, meus sinceros agradecimentos. 
As minhas amigas de infância, Andressa Barros e Luciana Cruz, pela 
amizade, pelos conselhos, pelas conversas jogadas fora, pelas risadas, pelo apoio e 
pelo companheirismo. 
Aos meus amigos de faculdade, Ísis Costa, Luiz Antonio, Iago Brasil, Williane 
Rocha, Jhessica Peniche, Letícia Souza e Paulo Henrique, pela amizade, paciência, 
convívio, aprendizado e companheirismo. Vocês contribuíram para que eu me 
tornasse uma pessoa melhor. 
A todos os amigos e professores da Faculdade de Farmácia, do Laboratório 
de Biologia Molecular do Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do 
Pará e do Laboratório de Citologia do Instituto de Ciências Biológicas da 
Universidade Federal do Pará. 
Letícia Roberta Sousa Vilhena da Silva 
 
 
AGRADECIMENTOS 
Aos meus pais Waldemir Conceição Rabelo da Silva e Virgínia Sousa da Silva 
por todo o apoio, incentivo, apoio incondicional e suporte para tornar este sonho 
realidade. 
Ao meu mestre da vida Dr° Daisaku Ikeda por todos os incentivos enviados 
que fizeram com que eu tivesse certeza que era capaz de tudo. 
Ao Laboratório de Biologia Molecular do Núcleo de Medicina Tropical da 
Universidade Federal do Pará e ao Laboratório de Citologia do Instituto de Ciências 
Biológicas da Universidade Federal do Pará. 
À orientadora Maisa, por nos colocar no projeto, pela orientação, apoio e 
confiança. 
Ao nosso co-orientador Rodrigo, por toda paciência, benevolência, ajuda no 
laboratório e neste trabalho, e por todo conhecimento partilhado. 
À minha parceira de trabalho, Letícia Roberta, que mesmo com nossas 
diferenças fizemos este trabalho dar certo. Obrigada pelos momentos em que nos 
desesperamos, aprendemos e rimos juntas. 
À minha irmã e sobrinho por toda ajuda e alegria partilhada dentro de casa. E 
o cuidado com o meu Apollo quando eu estava ausente. 
Ao meu namorado, melhor amigo e companheiro de todas as horas, Júnior 
Guimarães, pelo carinho, compreensão, amor e solidariedade. Por sempre me deixar 
estudar na sua casa quando precisei, e me alimentar. 
À minha amada torcida Leoas Azulinas, por todos os momentos de alegria 
nas nossas festas e jogos do Remo. Obrigada pela amizade. 
Aos meus amigos de turma, Ísis Costa, Iago Brasil, Jhéssica Peniche, Luiz 
Antonio, Williane Rocha, Paulo Henrique e Railana Rodrigues, por todos os 
momentos juntos, estudando, rindo e compartilhando esses 5 anos. 
E por fim, à comunidade acadêmica da Faculdade de Farmácia: docentes, 
técnico-administrativos e discentes. 
 
Letícia Souza da Silva 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Investigou-se a prevalência da infecção pelo HPV e apresentou-se a avaliação de 
uma técnica de semi-nested PCR em um único tubo para a pesquisa do HPV, 
técnica esta proposta e padronizada por Rajan Saini e Jacinta Santhanam (2009) e 
faz a utilização dos iniciadores MY09, MY11 e GP6+. A principal vantagem desta 
metodologia é que não se faz necessário a passagem de DNA de um tubo para 
outro, diminuindo assim o risco de contaminação. Além disso, a técnica proposta 
leva menos tempo, consome uma menor quantidade de reagentes e faz o uso de 
iniciadores já utilizados no laboratório, não havendo portando a necessidade da 
aquisição de novos iniciadores. O estudo utilizou 55 amostras de estudantes 
universitárias atendida pelo programa estudante saudável da Universidade Federal 
do Pará, com idade de 18 a 46 anos. Os melhores resultados obtidos na 
padronização foram demonstrados nas condições: temperatura de hibridização de 
57 ºC, a 3 µL de DNA, reação com 10+35 ciclos e concentração de iniciadores de 
0,25 µM (My09) e 1 µM (MY11/GP6+), com volume final de 20 µL. Tendo como 
resultado a prevalência de 21,81% pela técnica de nested PCR e de 36,36% quando 
considerado a técnica de semi-nested PCR. A avaliação da técnica proposta 
mostrou que esta tem potencial para ser utilizada na rotina do laboratório, diminuindo 
o uso de reagentes e diminuindo o tempo de reação. Porém, outros testes de 
padronização ainda precisam ser realizados para melhorar a qualidade da reação de 
amplificação e englobando um maior número de amostras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
We investigated the prevalence of HPV infection and presentend the evaluated of a 
semi-nested PCR technique in a single tube for HPV research , a technique 
proposed and standardized by Rajan Saini and JacintaSanthanam (2009). use of 
primers MY09, MY11 and GP6 +. The main advantage of this methodology is that it 
is not necessary to pass DNA from one tube to another, thus reducing the risk of 
contamination. Furthermore, the proposed technique spends less time, consumes a 
smaller amount of reagents and makes use of primers already used in the laboratory, 
therefore, there is no need for the acquisition of new primers. The study used 55 
samples of university students attended by the healthy student program of the 
“Universidade Federal do Pará”, aged from 18 to 46 years. The best results obtained 
in the standardization were demonstrated under the conditions: hybridization 
temperature of 57 °C, 3 μl of DNA, reaction with 10 + 35 cycles and primer 
concentration of 0.25 μM (My09) and 1 μM (MY11 / GP6 +), with a final volume of 20 
μL. As a result the prevalence of 21.81% by the technique of nested PCR and 
36.36% when considered the technique of semi-nested PCR. The evaluation of the 
proposed technique showed that it has the potential to be used in the laboratory 
routine, reducing the use of reagents and decreasing the reaction time. However, 
other standardization tests still need to be performed to improve the quality of the 
amplification reaction and comprising a larger number of samples. 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
CCU - Câncer de Colo Uterino 
CN – Controle negativo 
CP – Controle positivo 
HCII - Captura Híbrida II 
DNA - Ácido Desoxirribonucléico 
E1 a E2 - Proteínas não estruturais da região precoce (E) 
FP – Falso positivo 
FN – Falso negativo 
HPV - Papilomavírus humano 
HSIL - Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto Grau 
IARC- International Agency of Research on Cancer 
ICTV - International Committe on the Taxonomy of Viruses 
INCA – Instituto Nacional do Câncer 
JEC - Junção escamo-colunar 
L1 e L2 Proteínas do capsídeo da região tardia (L) 
NMT - Núcleo de Medicina Tropical 
OMS - Organização Mundial de Saúde 
ORF- fase de leitura aberta (open reading frames) 
PB- Pares de Base 
PCR - Reação em Cadeia mediada pela Polimerase 
PES- Projeto Estudante Saudável 
pRB - Proteína do retinoblastoma 
 
 
p53 - Proteína do gene p53 
Rb - gene supressor tumoral Rb 
SUS - Sistema Único de Saúde 
TCLE - Termo de Consentimento Livre Esclarecido 
UFPA - Universidade Federal do Pará 
UICC - Union for International Cancer Control 
VLP- Viral Like Particle 
VP – Verdadeiro positivo 
VN – Verdadeiro negativo 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x. Ladder de 100 pb........ 31 
Figura 2 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................32 
Figura 3 Gel de agarose a 2% corado com SYBR Safe 1x.....................................33 
Figura 4 Gel de agarose a 2% corado com SYBR Safe 1x.....................................34 
Figura 5 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................35 
Figura 6 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................35 
Figura 7 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................35 
Figura 8 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................37 
Figura 9 Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x........................................37 
Figura 10 Gráfico da distribuição das estudantes por faixa etária..........................38 
Figura 11Prevalência do HPV pela técnica de nested PCR...................................39 
Figura 12 Prevalência do HPV pela técnica de semi-nested PCR.........................39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE SÍMBOLOS 
% Símbolo de percentagem 
°C Graus centígrados (Celsius) 
G Gramas 
mL Mililitros 
µL Microlitros 
µM Micromolar 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1- INTRODUÇÃO ................................................................................................... 12 
2- REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 15 
2.1 Câncer do colo do útero ................................................................................ 15 
2.2 Epidemiologia do HPV e do câncer no colo do útero no Brasil ............. 16 
2.3 Papilomavírus humano – HPV ................................................................... 17 
2.3.1 Estrutura do Genoma Viral .................................................................... 17 
2.3.2 Ciclo de infecção do HPV .......................................................................... 19 
2.4 Diagnóstico do papilomavírus humano (HPV) ......................................... 21 
2.4.1 Diagnóstico do HPV ............................................................................... 22 
2.4.1.1 Imunohistoquímica ............................................................................. 23 
2.4.1.2 Biologia Molecular .............................................................................. 24 
2.4.1.3 Kits de diagnóstico comercial. ............................................................ 25 
3- JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 26 
4- OBJETIVOS ....................................................................................................... 27 
5- METODOLOGIA ................................................................................................. 27 
6- RESULTADOS ................................................................................................... 31 
6.1. Padronização da técnica da PCR. .................................................................. 31 
6.1.1. PCR inicial. ................................................................................................... 31 
6.1.2. Aumento de DNA. ..................................................................................... 32 
6.1.3. Número de Ciclos. .................................................................................... 32 
6.1.4. Diluição de DNA........................................................................................ 33 
6.1.5. Temperatura de hibridização dos iniciadores. .......................................... 34 
6.1.6. Termociclador ........................................................................................... 36 
6.2. Condições Finais. ........................................................................................... 36 
6.4 Perfil das estudantes ........................................................................................ 37 
6.5 Prevalência do HPV ......................................................................................... 39 
7- DISCUSSÃO ...................................................................................................... 40 
8- CONCLUSÃO ..................................................................................................... 43 
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 44 
Apêndice A: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) ............................ 47 
APÊNDICE B: Questionário para as estudantes. ...................................................... 48 
ANEXO A – Aprovação comitê de ética. ................................................................... 50 
ANEXO B: Protocolo de extração. .............................................................................51 
 
 
 
12 
 
1- INTRODUÇÃO 
A estimativa mundial, realizada em 2012, pelo projeto Globocan/Iarc, apontou 
que, dos 14 milhões de novos casos estimados de câncer no colo do útero, mais de 
60% ocorreram em países em desenvolvimento. Para a mortalidade, a situação 
agrava-se quando se constata que, dos 8 milhões de óbitos previstos, 70% 
ocorreram nesses mesmos países (INCA,2016), 
Como a expectativa de vida no planeta tem melhorado gradativamente, a 
incidência de câncer, estimada em 2002 em 11 milhões de casos novos, alcançará 
mais de 15 milhões em 2020 (UICC, 2005). 
A região Norte possui a maior taxa de incidência do Câncer de Colo do 
Útero (CCU) do Brasil. Diferente de todo o restante onde o câncer de mama é 
mais frequente, excluindo o câncer de pele tipo não melanoma. Dados do 
Instituto Nacional de Câncer (INCA) estimam que enquanto nas outras regiões a 
taxa de incidência do CCU, em média, é de 16,67 casos para cada 100 mil 
mulheres, na Região Norte esse índice é de 23,97 casos para cada 100 mil 
mulheres (INCA, 2016). 
O CCU é causado por infecções persistentes por tipos de alto risco 
oncogênico do papilomavírus humano (HPV). Existem mais de 200 tipos de HPV 
reconhecidos, estima-se que quatorze genótipos estejam relacionados com a 
oncogênese, e os mais comumente presentes são os HPV16 e HPV18, sendo de 
alto risco oncogênico (PITTA et al., 2010). O tipo mais prevalente nas infecções do 
trato genital é o HPV tipo 16 (aproximando a 66%), acompanhado dos tipos 18 
(15%), 45 (9%) e 31 (6%) e os quatro tipos unidos, correspondem até 80% dos 
casos de infecção (NAKAGAWA et al., 2010). 
O vírus HPV tem a capacidade de se manter em forma latente, podendo ser 
detectado por técnicas de biologia molecular, suas manifestações subclínicas são 
identificadas com colposcopia, citologia ou histologia, apresentando também 
infecção clínica (NOGUERES et al., 2010). 
Estudos epidemiológicos têm associado parâmetros relacionados à atividade 
sexual como principais fatores de risco para a infecção pelo HPV. A população 
jovem apresenta uma maior suscetibilidade a fatores de risco para a infecção pelo 
vírus devido a multiplicidade de parceiros sexuais, início precoce da atividade sexual 
13 
 
e o não uso de preservativo. Apesar de o CCU ser raro em mulheres jovens, é de 
extrema importância a detecção de lesões precoces a partir do exame preventivo de 
papanicolaou, evitando a progressão destas para o câncer (KJELLBERG; 
HALLMANS, 2000). 
A incidência das lesões precursoras está diretamente relacionada ao número 
de parceiros sexuais masculinos. Sugere-se que o homem seja o reservatório da 
infecção. Há risco cinco vezes maior em mulheres com dois parceiros ou mais antes 
de completar 20 anos. O risco da aquisição do HPV aumenta em paralelo com o 
número de parceiros sexuais, variando de 17% em mulheres com um parceiro, até 
83% em mulheres com cinco parceiros (KJELLBERG; HALLMANS, 2000). Nas duas 
últimas décadas, o desenvolvimento e o aprimoramento das técnicas de biologia 
molecular contribuíram de forma decisiva na identificação do HPV como principal 
agente causador do processo neoplásico, possibilitando uma melhor compreensão 
da história natural do câncer do colo uterino (BOSCH, 2002). Este estudo 
demonstrou a presença do DNA do HPV em 90 - 100% dos casos de câncer do colo 
do útero. 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas moleculares 
comumente utilizadas para detecção do HPV, sendo um método de biologia 
molecular baseado na amplificação seletiva de uma sequência de DNA específica 
(GUTIERREZ-XICOTENCATL et al., 2009). 
As técnicas de PCR baseiam-se na amplificação específica de segmentos do 
DNA alvo e tem potencial para a detecção de níveis muito baixos de carga viral em 
células e tecidos, mesmo em infecções ditas não produtivas. A utilização da PCR 
permite uma melhor avaliação dos casos alterados e auxilia a interpretação dos 
resultados do PCCU e no encaminhamento destes casos para tratamento 
especializado (RODRIGUES A, 2009). 
O genoma do HPV é constituído por cerca de 8.000 pares de bases, contendo 
8 esquadros de leitura (Open Reading Frames, ORFs), estes ORFs são expressos a 
partir de mensagens policistrônicas de mRNA transcritos a partir de uma única fita 
de DNA, funcionalmente o genoma do HPV pode ser dividido em região precoce (E 
ou Early), região tardia (L ou Late) e região de controle (LCR ou Long control region) 
(FERRAZ et al., 2012). A região E codificam os genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 
responsáveis pela síntese das proteínas de mesmo nome, e a região L codifica os 
genes L1 e L2 relacionados à formação e maturação do capsídeo viral, os genes E 
14 
 
são expressos imediatamente após a infecção, e apresentam nos seus produtos a 
função de regular a replicação e a expressão do DNA viral, nos casos dos HPV com 
potencial oncogênico, alguns destes genes precoces (E5, E6 e E7) estão envolvidos 
na transformação celular (MARTINS et al., 2008). 
A maioria dos estudos utilizam os iniciadores MY09/MY11 para a identificação 
do HPV, entretanto casos de baixa carga viral podem gerar resultados falsos 
negativos. Assim, metodologias baseadas na nested PCR buscam aumentar a 
sensibilidade da técnica, como por exemplo, em casos de amostras provenientes de 
mulheres jovens, onde a maioria dos resultados citológicos é normal ou com lesões 
de baixo grau, apresentando menores quantidades de DNA quando comparados a 
casos de carcinoma invasivo (HAWS, 2004). 
É preciso desenvolver outras técnicas moleculares para a detecção do HPV, 
pois a técnica de nested PCR por ter uma alta sensibilidade é utilizada 
frequentemente para detecção molecular, ela por utilizar dois conjuntos de 
oligonucleotídeos iniciadores em reações subsequentes, cujo produto de 
amplificação da primeira reação é utilizado como molde para a segunda, pode 
ocorrer contaminação nessa passagem de DNA de um tubo para o outro. A técnica 
de semi-nested PCR em um único tubo vem para melhorar essa ferramenta que 
ajuda na detecção do HPV (RODRIGUES A, 2009). 
 
 
15 
 
2- REFERENCIAL TEÓRICO 
 
2.1 Câncer do colo do útero 
 
O câncer de colo do útero é o estágio final raro de uma infecção por HPV não 
resolvida, atualmente definida como presença persistente de DNA de HPV em testes 
repetidos de espécimes cervicais. (HPV CENTRE, 2015) 
O intervalo de tempo entre o pico da infecção por HPV e o pico da incidência 
de câncer é de duas a quatro décadas, tornando as infecções iniciais e lesões 
precursoras do CCU um alvo adequado para triagem e detecção precoce. Apesar 
das lacunas significativas no conhecimento, o câncer no colo do útero é o melhor 
entendido de todos os cânceres e sistema modelo para carcinogênese. (HPV 
CENTRE, 2015) 
As mulheres podem procurar prevenção através da vacinação contra o HPV 
antes do início da vida sexual e fazendo o exame preventivo (Exame de 
Papanicolaou ou citopatológico), que pode detectar as lesões precursoras. Quando 
essas alterações que antecedem o câncer são identificadas e tratadas é possível 
prevenir a doença em 100% dos casos (INCA, 2016). 
O exame deve ser feito preferencialmente pelas mulheres entre 25 e 64 anos, 
que têm ou já tiveram atividade sexual. Os dois primeiros exames devem ser feitos 
com intervalo de um ano (INCA, 2016). 
Existem atualmente duas vacinas disponíveis contra o HPV, elas protegem 
contra os tipos de HPV-16 e HPV-18. Essas vacinas são constituídas de partículas 
similares a do vírus (VLP, sigla inglesa para viral like particle) produzida a partir de 
tecnologia recombinante, sendo assim, não infecciosas. Essas vacinas mostraram 
que há uma alta eficiênciapara com as mulheres sem confirmação de infecções 
prévias, com diminuição de mais de 90% de infecções persistentes e redução 
próxima a 100% de lesões cervicais moderadas e severas (Schiffman et al., 2007). 
Em março de 2014, o Sistema Único de Saúde (SUS) do Ministério da Saúde 
passou a oferecer a vacina tetravalente contra HPV chamada Gardasil e fabricada 
pela Merck Sharp & Dohme Farmacêutica, sendo utilizada na prevenção do câncer 
16 
 
do colo do útero para meninas de 11 a 13 anos. Em 2015, foram vacinadas as 
adolescentes de 9 a 11 anos e, em 2016, começaram a ser imunizadas as meninas 
que completam 9 anos. O esquema de vacinação é composto por três doses: a 
segunda é aplicada com intervalo de seis meses e a terceira, de reforço, cinco anos 
após a primeira dose. Mais de 4,1 milhões de meninas já receberam a primeira dose 
da vacina. O número representa 83,5% do público-alvo, formado por 4,9 milhões de 
adolescentes na faixa-etária de 11 a 13 anos (Ministério da Saúde, 2016). 
2.2 Epidemiologia do HPV e do câncer no colo do útero no Brasil 
Aproximadamente 291 milhões de mulheres no mundo são portadoras do 
HPV, sendo que 32% estão infectadas pelos tipos 16, 18 ou ambos. Comparando-se 
esse dado com a incidência anual de aproximadamente 500 mil casos de câncer de 
colo do útero, conclui-se que o câncer é um desfecho raro, mesmo na presença da 
infecção pelo HPV. Ou seja, a infecção pelo HPV é um fator necessário, mas não 
suficiente, para o desenvolvimento do câncer do colo do útero (INCA, 2016). 
O HPV é considerado uma das ISTs mais estudadas no mundo. Presume-se 
que mais de 70% das mulheres sexualmente ativas poderão estar infectadas pelo 
vírus ao longo da sua vida. No entanto, 80% dessas infecções são passageiras e 
eliminadas pelo sistema imune sem causar nenhum transtorno. E os outros 20% 
podem avançar para lesões causando o câncer cervical (ALBA et al. 2009). 
 Em alguns casos, o predomínio da infecção do HPV é alto em mulheres 
jovens e continua constante com a idade. Alguns fatores podem influenciar e 
contribuir para o aumento da prevalência em mulheres maduras como: exposição 
continuada com novos parceiros sexuais, recidiva da infecção latente, mudanças na 
imunidade, como o declívio da função imune e hormonal em idades mais avançadas, 
imunossupressão causada por coinfecção com outros agentes virais ou parasitários 
e cofatores relacionados à microbiota cérvico vaginal e pH (WHEELER, 2013). 
Para o ano de 2016, no Brasil, são esperados 16.340 casos novos de câncer 
do colo do útero, com um risco estimado de 15,85 casos a cada 100 mil mulheres 
(INCA, 2016). Sem considerar os tumores de pele não melanoma, o câncer do colo 
do útero é o mais incidente na Região Norte (23,97/100 mil). Nas Regiões Centro-
17 
 
Oeste (20,72/100 mil) e Nordeste (19,49/100 mil), ocupa a segunda posição; na 
Região Sudeste (11,30/100 mil), a terceira; e, na Região Sul (15,17 /100 mil), a 
quarta posição (INCA, 2016). 
De acordo com a última estimativa mundial, essa neoplasia foi responsável 
por cerca de 265 mil óbitos em mulheres em 2012, sendo que 87% desses óbitos 
ocorreram em países em desenvolvimento. A última informação para mortalidade no 
Brasil aponta que ocorreram, em 2013, 5.430 mortes por câncer do colo do útero em 
mulheres. A sobrevida em cinco anos para esse tipo de câncer obteve melhora ao 
longo dos anos, variando de menos de 50% para mais de 70% em todo o mundo, de 
uma forma geral. No Brasil, para o período de 2005 a 2009, a sobrevida ficou em 
torno de 61% (INCA, 2016). 
 
2.3 Papilomavírus humano – HPV 
 
2.3.1 Estrutura do Genoma Viral 
 
Os papilomavirus podem infectar uma infinidade de vertebrados, incluindo o 
homem, sendo os papilomavírus humano (HPV) os mais estudados. De acordo com 
o International Committe on the Taxonomy of Viruses (ICTV), o HPV pertence à 
família Papillomaviridae, gêneros papilomavírus Alfa, Beta, Gama, Delta, Kappa, 
Lambda, Nu e Zeta, estes são classificados de acordo com as diferentes sequências 
nucleotídicas. O gênero Alfa é considerado mais importante, pois está relacionado 
com o vírus que infecta a mucosa genital e orofaríngea e inclui os tipos oncogênicos 
associados ao câncer cervical (DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD, et al., 2010). A 
classificação do HPV é baseada na sequência nucleotídica das regiões de leitura 
aberta (Open Reading Frame) do gene L1. Um novo tipo é identificado quando a 
variação da sequência nucleotídica é maior que 10%, variações entre 3-10% são 
consideradas subtipos, enquanto as variantes diferem menos que 3% e tipicamente 
apresentam variação em um único nucleotídeo. Os papilomavírus humano são 
denominados pela abreviação HPV seguida por um número à medida que um novo 
tipo é descoberto (DE VILLIERS et al., 2004; SCHIFFMAN et al., 2010). 
18 
 
Mais de 200 tipos de HPV já foram descritos até o momento, sendo que cerca 
de 45 infectam o trato anogenital. Os tipos 6, 11, 13, 27, 28, 29, 32, 40, 42, 43, 44, 
54, 57, 61, 62, 64, 70, 71, 72, 74, 78, 81, 83, 84, 86, 87, 89 e CP6108 são 
classificados como baixo risco oncogênico por estarem associados a lesões 
benignas e condilomas acuminados; os tipos 26, 53 e 66 são classificados como 
potencialmente oncogênicos; enquanto os tipos 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 
51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 69, 70, 73, 82, 85, 91 são classificados como alto risco 
oncogênico por estarem associados a lesões pré-cancerosas e ao câncer do colo do 
útero (MUNOZ et al., 2003; DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD, et al., 2010). 
Recentemente, a International Agency for Research on Cancer (IARC) 
classificou 12 tipos de HPV: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 como 
carcinógenos grupo 1 (oncogênicos ou alto risco) (BOUVARD; BAAN; STRAIF, et al., 
2009) por estarem associados a lesões pré-cancerosas e ao câncer cervical 
(MUÑOZ et al., 2003; MUÑOZ et al., 2006). Esses 12 tipos de HPV originam-se de 
quatro espécies de um único ramo do gênero alfa da árvore evolutiva do HPV. O 
mesmo ramo evolutivo inclui o HPV 68, classificado pela IARC como carcinógenos 
do grupo 2A (provavelmente carcinogênicos para a espécie humana) e os tipos 67, 
34, 73, 70, 85, 26, 69, 82, 30, 53 e 66 como carcinógenos do grupo 2B (raramente 
carcinogênicos) (LI et al., 2011). 
Os quatro principais tipos relacionados a lesões genitais são os HPV 6, 11, 16 
e 18. O HPV 6 foi descoberto em 1982 em um tumor genital (o raro tumor Buschke-
Lowenstein), embora seja tipicamente encontrado em verrugas genitais benignas 
(condilomas acuminados). Em 1983, os HPV 11 e 16 foram relacionados a lesões 
cervicais. Posteriormente o HPV 16 foi isolado de papillomas de laringe e verrugas 
genitais (ZUR HAUSEN, 2009). Desde então, inúmeros estudos moleculares têm 
demostrado que o HPV 6 e 11 estão presentes em cerca de 90% das verrugas 
genitais benignas. Em contraste, os HPV 16 e 18 são relacionados à persistência e 
progressão de lesões intraepiteliais de alto grau (HSIL), lesões pré-cancerosas e na 
maioria dos cânceres cervicais invasivos. Eles são responsáveis por cerca de 50- 
70% e 20-30% respectivamente dos cânceres cervicais diagnosticados no mundo. 
Os tipos 31, 33, 45, 52 e 58 são também oncogênicos, mas bem menos 
prevalentes no carcinoma cervical (ZUR HAUSEN, 2002, 2009; CHAUHAN et al., 
2009; EINSTEIN et al., 2009). 
19 
 
Outras lesões malignas do trato anogenital também estão frequentemente 
relacionadas às infecções por tipos de HPV de alto risco, incluindo o câncer de 
vulva, pênis e ânus (EINSTEIN et al., 2009). 
 
2.3.2 Ciclo de infecção do HPV 
O genoma do HPV é constituído por uma molécula de DNA de dupla fita 
circular, com cerca de 8.000 paresde bases (pb) que codifica aproximadamente 300 
mil daltons de proteínas. 
O genoma do HPV possui oito regiões conhecidas como fases de leitura 
aberta (Open Reading Frames) e uma região não-codificada. As fases de leitura 
aberta são organizadas em três regiões: a região precoce (composta pelos genes 
E1, E2, E4, E5, E6, E7), responsáveis por processos iniciais da replicação viral, no 
controle de sua transcrição e na transformação celular; a região tardia (composta 
pelos genes L1 e L2), responsáveis pelas etapas finais da replicação do vírus, como 
a síntese de proteínas estruturais do capsídeo; e uma região responsável pela 
modulação destes processos na célula do hospedeiro, chamada região controladora 
(URR) (FERRAS et al., 2012; PINTO et al., 2012 ). 
Atualmente, existe mais de 200 tipos de HPV sendo que novas linhagens são 
descobertas e adicionadas a essa lista (VIDAL et al., 2012). Sua classificação se dá 
em tipos diferentes, e é feita devido as diferenças entre a sequência dos 
nucleotídeos do seu genoma viral. 
Os HPV são um grupo heterogêneo de vírus. As análises de sequências de 
DNA têm permitido identificar mais de 100 tipos virais (Scully C, 2002). 
Atualmente considera-se um novo tipo de HPV quando as sequências de 
nucleotídeos dos genes L1, E6 e E7 (aproximadamente 30% do genoma viral) diferir 
em mais de 10% dos tipos conhecidos. Se esse percentual for menor que 2%, então, 
o novo vírus isolado é designado como uma variante do mesmo tipo. Os subtipos 
virais correspondem a genomas cuja sequência nucleotídica nessas regiões gênicas 
diferir entre 2% e 10% dos tipos já descritos (Burd, 2003). 
20 
 
A proteína L1 é importante na produção de vacinas contra o HPV. Essas são 
preparadas a partir de partículas virais semelhantes ao vírus (VLP, originado do 
inglês virus-like particle). Produzidas a partir de tecnologia recombinante, resultante 
da proteína L1 do capsídeo viral dos tipos de HPV, altamente refinados e capazes 
de originar uma resposta imunológica. Essas vacinas não apresentam DNA viral, 
logo não são capazes de infectar as células, e de se produzirem ou causarem a 
doença (CONITEC, 2013). 
O HPV causa infecção na célula através de microfissuras na camada basal do 
epitélio. O vírus invade a célula, chegando até o núcleo, onde lá permanece na 
forma epissomal, isto é, permanece em círculo no núcleo da célula, mas não 
incorporado ao DNA da mesma. Após a sua permanência no núcleo, o vírus começa 
o seu processo de replicação na célula infectada chegando a 50/100 epissomos por 
célula. A partir do momento que ocorre a divisão da célula basal, os epissomos do 
HPV também HPV apresenta um ciclo que está diretamente relacionado com o 
processo de diferenciação e renovação do epitélio. O epitélio escamoso no seu 
estado normal cresce em camadas estratificadas, onde as células da camada basal 
têm a capacidade de se proliferarem e as células dos estratos superiores tornam-se 
diferenciadas e não proliferativas. Com a proliferação do epitélio, a célula basal se 
diferencia e uma das células-filhas migra para camadas superiores do tecido, 
iniciando assim a diferenciação e a interrupção do seu ciclo proliferativo, já a outra 
célula- filha continua na camada basal com fenótipo proliferativo perpetuando a 
linhagem. As células que apresentam o vírus do HPV não são capazes de controlar 
o ciclo mesmo quando diferenciadas (VIDAL, 2012). 
O ciclo da infecção do HPV passa por cinco etapas consecutivas: 1) infecção, 
2) manutenção do genoma, 3) fase proliferativa, 4) amplificação do genoma e 5) 
síntese e liberação de novas partículas virais. Na produção das partículas virais, 
ocorre a ampliação do genoma do HPV, que é dependente dos genes E1, E2, E4 e 
E5. A produção das partículas infecciosas acontece nas camadas médias e 
superiores do epitélio cervical. Nesse processo tardio, os genes L1 e L2 reúnem as 
proteínas do capsídeo do vírus que são apresentadas nos grupos de células com 
maior expressão do gene E4, importante na alteração da matriz intracelular, 
maturação e replicação do vírus. A produção do vírus e o seu empacotamento do 
DNA se encontra na camada superficial. A composição e a liberação das partículas 
21 
 
virais são liberadas na superfície do epitélio sem prejudicar as células hospedeiras, 
mostrando assim o ciclo produtivo da infecção. 
Esse processo de expressão viral no ciclo de uma infecção produtiva é similar 
para os diferentes tipos de HPV. No entanto, o progresso de neoplasias está 
relacionado à perda da regulação deste ciclo do HPV. Situações observadas em 
infecções resistentes pelos HPV de alto risco oncogênico, que tentam incorporar o 
seu genoma na célula hospedeira. Durante o processo de incorporação, o genoma 
viral pode apresentar a perda do gene E4 e parte do gene E2, que tem como função 
o controle da transcrição dos demais genes virais. Com a perda de função do E2, 
ocorrerá o aumento dos genes E6 e E7, e a inabilidade do vírus de continuar o seu 
ciclo biológico. Nesse caso, não terá o amadurecimento das células hospedeiras e 
produção de novas partículas virais (FERRAZ et al., 2012). 
Os genes E6 e E7 são mencionados em vários estudos pois são responsáveis 
pelo desenvolvimento do câncer no colo do útero. A proteína constituída a partir do 
gene E6 provoca a destruição p53, principal gene de supressão tumoral, este é 
responsável pelo processo de apoptose da célula infectada, gerando assim um 
aumento de mutações na célula hospedeira, já as proteínas constituídas pelo gene 
E7 inativa a proteína Prb (proteína do retinoblastoma) que é responsável pelo 
bloqueio do ciclo normal celular. Com todos esses eventos, a célula deixa de ter o 
controle da divisão mitótica e se prolifera de forma descontrolada, tendo como 
consequência o câncer instalado (FERRAZ et al., 2012). 
 
2.4 Diagnóstico do papilomavírus humano (HPV) 
 
O diagnóstico da infecção pelo HPV considera o histórico da mulher, como o 
exame físico e exames complementares, apresentando uma pesquisa direta ou 
indireta do vírus por meio de modificações provocadas pelas células e tecidos 
infectados (DEMATHE et al., 2011). A presença do vírus pode ser notada devido os 
vários métodos, sendo que cada um depende do estágio que a infecção se encontra. 
Nas manifestações clínicas, encontram-se lesões verrucosas, reconhecidas a partir 
de um exame clínico detalhado. Já nas manifestações subclínicas pode ser 
22 
 
identificada pelos exames citológicos, colposcospia e biopsia. E na forma latente 
pode ser reconhecida pelo uso de técnicas moleculares (ARAÚJO; REIS, 2014). 
 
 
2.4.1 Diagnóstico do HPV 
 
O diagnóstico da infecção por HPV leva em conta os dados da história da 
paciente, exame físico e exames complementares com a pesquisa direta do vírus ou 
indiretamente através das alterações provocadas pela infecção nas células e no 
tecido (DEMATHE et al., 2011). 
A presença do vírus HPV pode ser detectada através de vários métodos, 
sendo cada um dependente do estágio biológico em que se encontra a infecção 
(HAVRECHAK, 2002). Na forma clínica, apresentam-se lesões verrucosas 
evidentes, identificadas a partir de um exame clínico detalhado. Na forma subclínica 
pode ser detectada através de exames citológicos, colposcospia e biópsia. Na forma 
latente pode ser identificada através do uso de técnicas moleculares (ARAÚJO; 
REIS, 2014). 
O exame de papanicolaou tem se mostrado o principal meio de prevenção da 
doença, pois permite a detecção da infecção do HPV classificando o nível de 
acometimento celular, permitindo o tratamento da lesão antes que a mesma alcance 
a junção escamo colunar (JEC) e posteriormente se instale como carcinoma 
(NASCIMENTO;ANDRADE, s/d). 
É uma técnica simples, de fácil execução e tem se mostrado eficaz e apto 
para aplicação em larga escala, além do baixo custo (MAGALHÃES et al., 2012). 
Geralmente se recomenda que as mulheres realizem o exame anualmente a partir 
dos 25 anos. Tendo dois resultados negativos, a periodicidade do exame passa a 
ser a cada três anos, conforme as diretrizes do Ministério da Saúde (GUIA DO HPV, 
2013). 
A colposcopia é um exame importantíssimo para a identificação das lesões 
causadas pelo vírus que tem como objetivo analisar a superfície e as terminações 
vasculares do colo do útero, vagina e vulva, este exame é utilizado quando ocorre a 
identificação de uma lesão no exame de papanicolaou, neste momento a paciente 
passa por uma coleta de material para ser submetido a biópsia. Dependendo do tipo 
23 
 
de lesão a paciente é encaminhada para tratamento caso necessário (RAMOS et al., 
2009). 
As lesões apresentam características que são analisadas, como: tonalidade e 
intensidade aceto-branca, contorno da margem e superfície das áreas aceto-
brancas, padrão vascular e permanência do iodo. Tendo eficiência na diferenciação 
das lesões de baixo grau das de alto grau (ALBUQUERQUE, 2016). 
A citologia oncótica, exame que procede à visualização das lesões foi um 
método desenvolvido pelo médico grego George Papanicolau, que se mostra como 
meio de prevenção da doença, pois ajuda na identificação da doença do HPV 
especificando o nível de acometimento da célula, obtendo assim o tratamento da 
lesão antes que alcance a junção escamo colunar (JEC). É um método simples, de 
fácil realização e eficácia, apto para ser aplicado em grande quantidade, além de ter 
um baixo custo (MAGALHÃES et al., 2012). 
A realização periódica do exame citopatológico continua sendo a estratégia 
mais amplamente adotada para o rastreamento do câncer do colo do útero. Atingir 
alta cobertura da população definida como alvo é o componente mais importante no 
âmbito da atenção primária, para que se obtenha significativa redução da incidência 
e da mortalidade por câncer do colo do útero. (INCA, 2016) 
 
2.4.1.1 Imunohistoquímica 
 
A técnica imunohistoquímica tem a finalidade de verificar o revestimento 
proteico das partículas virais do HPV e utiliza-la no estudo de distribuição e 
localização de biomarcadores e proteínas expostas em diferentes partes de um 
tecido biológico, como marcadores moleculares específicos da proliferação ou de 
apoptose. A visualização de um contato antígeno-anticorpo pode ser adquirida 
através de diversas formas (MARTINS, 2013). 
 
Entre os principais marcadores imunohistoquímicos, pode-se citar a proteína 
nuclear pRb, originada do gene Rb. Esta proteína tem a finalidade de regular o ciclo 
celular através da transcrição de genes celulares. Estes estão relacionados no 
processo do ciclo e na proliferação celular, logo, mutações de Rb ou inativação de 
24 
 
pRB podem gerar a proliferação celular descontrolada. (ELEOTÉRIO JÚNIOR et al., 
2006). 
 
Como E6 e E7 são oncoproteínas encontradas no processo carcinogênico da 
infecção pelo HPV no qual impedem a atividade do p53 e da pRb, respectivamente, 
a atividade persistente dessas oncoproteínas serve como indicador de continuação 
de neoplasia intraepitelial para carcinoma invasivo. A quantidade de proteínas E6 ou 
E7 através da imunohistoquímica pode ocasionar um melhor valor preditivo do que a 
detecção de DNA viral sozinho. No entanto, a medição das proteínas E6 e E7 pode 
não ser a melhor das hipóteses, por estas serem produzidas em pequenas 
quantidades em células transformadas, e pela sensibilidade do ensaio. (MARTINS, 
2013). 
 
2.4.1.2 Biologia Molecular 
 
A infecção do HPV apresenta um diagnóstico importante na triagem do vírus, 
este processo é considerado mais específico e mais sensível para a identificação do 
mesmo. Os métodos moleculares têm como base as técnicas de captura hibrida 
(CH), southern blot, hibridização in situ e reação em cadeia da polimerase (PCR). 
Entre estes, a captura hibrida II (HCII) é o método mais usado em nosso meio para a 
detecção de HPV (RODRIGUES et al., 2009). Porém, é necessário conhecer o 
genoma do vírus a ser pesquisado (NOBREGA JÚNIOR; BARBOSA, 2013). 
Atualmente, a Reação em cadeia da polimerase (PCR), é empregada para 
reconhecer e confirmar a presença do HPV, esta técnica foi desenvolvida por Saiki, 
et al. (1985) e principalmente por Mullis, et al. (1987). Este método de amplificação 
de DNA pede uma quantidade reduzida de DNA viral, possibilitando assim o estudo 
de pequenas amostras clínicas. 
Existem duas abordagens relevantes para a detecção do DNA do HPV por 
PCR que são as PCR de consenso e a PCR tipo específica. Os ensaios de PCR 
mais amplamente utilizadas usam os iniciadores, GP5+ / GP6+, MY09/MY11, cujo 
alvo é uma região altamente conservada do gene L1 do HPV, amplifica numerosos 
tipos de HPV genital numa mesma reação. O conjunto PCR GP5+ / GP6+ consiste de 
dois iniciadores que detectam uma ampla gama de HPV em baixa temperatura de 
25 
 
anelamento. Estes iniciadores amplificam fragmentos de aproximadamente 150 pb 
(Kleter et al. 1999). 
O MY09/11 PCR, por outro lado, é sintetizado com vários nucleotídeos 
degenerados em cada um dos iniciadores, gerando uma mistura de 25 iniciadores 
que são capazes de amplificar um amplo espectro de tipos de HPV (Boulet et al., 
2008). 
Os iniciadores PGMY09/MY11 foram desenhados para melhorar a 
sensibilidade do sistema MY09/MY11 de todo o espectro de tipos com aumento da 
detecção de infecções múltiplas com melhor reprodutibilidade e especificidade 
(Boulet et al., 2008). Este conjunto de iniciadores consiste em uma mistura de 
oligonucleotídios que permitem à amplificação de um fragmento de 
aproximadamente 450 pb (Gravitt et al. 2000, Coutleé et al. 2002). 
A nested PCR é caracterizada por melhorar a especificidade e a eficiência da 
reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando 
até mesmo sequências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro 
produto, a amplificação da real sequência-alvo. Estas duas etapas podem ser 
realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando 
o semi-nested PCR (VIEIRA, 2002). 
Apesar do aumento de sensibilidade, a nested PCR apresenta um alto risco 
de contaminação na passagem de material amplificado de um tubo para outro, 
gerando resultados falsos positivos. Diante disto, os autores Rajan Saini e Jacinta 
Santhanam propuseram uma técnica de semi-nested PCR em um único tubo. 
A metodologia proposta é mais rápida e diminui o risco de contaminação na 
passagem de DNA amplificado de um tubo para o outro. Porém, esta técnica foi 
testada apenas em amostras de carcinoma invasivo e de material proveniente de 
culturas celulares, que apresentam alta quantidade de DNA. A partir deste 
pressuposto, este estudo propõe avaliar a sensibilidade da técnica para as amostras 
de secreção vaginal onde são esperadas menores quantidades de DNA. 
 
2.4.1.3 Kits de diagnóstico comercial. 
 
Outros métodos de detecção do HPV são conhecidos como Métodos 
comerciais. Esses métodos tem objetivo de identificar, amplificar ou isolar o 
fragmento de DNA. Entre eles, podemos citar o Kit de ácido nucleico viral de alta 
26 
 
pureza (Roche, EUA), este tem a finalidade de isolar eficientemente o DNA e o 
RNA de uma ampla gama de materiais de amostra. E o Kit papillocheck (Greiner 
Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha) este tem a finalidade de identificar 
24 genótipos de HPV, entre outros kits ( OLIVEIRA, 2011). 
 
3- JUSTIFICATIVA 
 
O Laboratório de Biologia Molecular e Celular(LBMC) do Núcleo de Medicina 
Tropical (NMT) atualmente faz o uso da técnica de nested PCR na pesquisa de HPV 
em amostras cérvico-vaginais. Embora esta técnica aumente a sensibilidade de 
detecção em relação a PCR MY09/11 ou GP5+/6+ isoladamente, a realização deste 
tipo de técnica de nested PCR em dois tubos consome mais tempo, exige dois 
conjuntos de misturas de reação e é propenso a reações falso positivas devido ao 
risco de contaminação na passagem de DNA do primeiro para o segundo tubo. 
Desta maneira, o presente estudo propõe a avaliação de uma técnica de 
semi-nested PCR em um único tubo para a pesquisa do HPV, tal técnica foi proposta 
e padronizada por Rajan Saini e Jacinta Santhanam (2009) e faz a utilização dos 
iniciadores MY09, MY11 e GP6+. 
A principal vantagem desta metodologia é que não se faz necessário a 
passagem de DNA de um tubo para outro, diminuindo assim o risco de 
contaminação. Além disso, a técnica proposta leva menos tempo, consome uma 
menor quantidade de reagentes e faz o uso de iniciadores já utilizados no 
laboratório, não havendo portando a necessidade da aquisição de novos. 
Todavia, durante a padronização da metodologia pelos autores Rajan Saini e 
Jacinta Santhanam foram avaliadas somente amostras cérvico-vaginais e swab oral 
contendo DNA de clones de HPV. Tais amostras apresentam elevada concentração 
do DNA viral e um alto grau de pureza, propiciando assim condições ideais para a 
reação de PCR. Desta maneira, não há dados descritos na literatura que 
demonstrem a utilização desta técnica em amostras cérvico-vaginais de rotina 
provenientes de programas de rastreamento do CCU. Ainda, o presente estudo inclui 
mulheres jovens (estudantes universitárias) onde presumivelmente não são 
27 
 
esperados casos de CCU, demonstrando assim menores concentrações de DNA, 
quando comparados a casos de câncer ou amostras clonadas. 
4- OBJETIVOS 
OBJETIVO GERAL: 
 Padronização da técnica de semi-nested PCR para detecção do HPV 
em amostras de secreção cérvico-vaginal de estudantes universitárias de Belém, 
Pará, Brasil. 
 
 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 
 
 Identificar o perfil socioeconômico das participantes do estudo. 
 Estimar a prevalência da infecção por HPV entre estudantes 
universitárias atendidas pelo Programa Estudante Saudável. 
 
 
5- METODOLOGIA 
Trata-se de um estudo com amostras de secreção cérvico-vaginal de 
estudantes universitárias da Universidade Federal do Pará (UFPA), Campus Guamá, 
Belém do Pará - Brasil. 
O projeto pesquisando infecções e doenças infecciosas na extensão 
universitária faz parte do Programa Estudante Saudável (PES) da UFPA, inscrito na 
Plataforma Brasil pelo número de CAAE: 38202214.6.0000.5172 e possui aprovação 
prévia do Comitê de Ética e Pesquisa do Núcleo de Medicina Tropical (Número do 
parecer: 1.218.417 – ANEXO A), de acordo com as diretrizes e normas envolvendo 
seres humanos da Resolução n° 446/2012 do Conselho Nacional de Saúde. Todas 
as participantes do estudo preencheram o Termo de Consentimento Livre e 
Esclarecido (TCLE – APÊNDICE A) e concordaram com a utilização das amostras 
no projeto. 
28 
 
As amostras cérvico-vaginais foram coletadas para o exame molecular com o 
auxílio de escovas endocervicais. A extração de DNA foi realizada utilizando-se o kit 
GE Healthcare. 
Esse procedimento de extração apresenta cinco etapas, a primeira é 
chamada de lise celular. Nela, inicialmente se enumera os tubos de 1,5mL e as 
amostras de secreção vaginal. Em seguida, adicionou-se respectivamente, 20µL de 
Proteinase K e 300 µL da amostra que foi agitada em vortex e centrifugada 
previamente para a homogeinização. E depois foi adicionado 400 µL do tampão de 
Lise, com isso o microtubo foi fechado com parafilm e vortexado por 1 minuto e em 
seguida incubado por 10 minutos. Na segunda etapa chamada de ligação do DNA 
genômico, utilizou-se coluna + tubo de 2mL e transferiu-se o material para o centro 
da coluna para centrifugar durante um minuto a 11000 rpm. Como sequência, 
descartou-se o material do tubo coletor, enxugou-o com papel e montou-se 
novamente a coluna mais o tubo, sendo que o DNA permanecerá ligado à sílica da 
coluna. Na terceira etapa denominada de lavagem, adicionou-se 500 µL do tampão 
de Lise à coluna e centrifugou durante 5 minutos à 11000g. Na quarta etapa 
conhecida como lavagem e secagem, foi adicionado 500 µL do tampão de Lavagem 
na coluna e centrifugado por 5 minutos à 11000rpm. Após isso, descartou-se o 
material do tubo coletor e transferiu a coluna para um novo tubo de 2 mL e depois foi 
feita uma nova centrifugação para retirar possível contaminação com álcool durante 
1 minuto à 11000g. E por fim a última etapa chamada de eluição, nela ocorreu a 
transferência da coluna para o tubo coletor (tubo padrão do kit), logo após foi 
adicionado 200 µL do tampão de eluição no centro da coluna e incubado por 1 
minuto à temperatura ambiente. Em seguida, ocorre a centrifugação durante 1 
minuto a 11000rpm, sendo que o DNA está no tubo coletor. Depois desse tempo, a 
coluna é descartada e o DNA purificado é guardado a uma temperatura de -20 ºC 
em tubo de 1,5 mL. 
Posteriormente as amostras foram submetidas a uma PCR de globina para 
avaliar a adequabilidade do material extraído. As amostras negativas foram 
retestadas e, em caso de inadequabilidade, foram excluídas das análises. A PCR de 
globina (iniciadores g73/g74) (Quadro 1) consistiu em uma reação com as seguintes 
condições: desnaturação inicial a 95 ºC por 4 minutos, 35 ciclos com desnaturação 
29 
 
(95 °C/45 segundos), hibridização dos iniciadores (55 °C/45 segundos) e extensão 
(72 °C/45 segundos), 10µl de master mix, e por fim 2µl de DNA. 
 
Quadro 1: Lista de iniciadores utilizados no estudo. 
Primer Sequência de nucleotídeos 
Tamanho do 
Fragmento 
Amplificado 
(pb) 
G73/G74 
(globina) 
G73: 5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’ 
G74: 5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’ 
268 
 
My09/11 
(região L1 –
HPV) 
 
MY09: 5’ CGTCCMAARGGAWACTGATC 3’ 
MY11: 5’ GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3’ 
 
450 
GP5
+
/GP6
+
 
(região L1 –
HPV) 
GP5
+
:5TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC3' 
GP6
+
:5GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC3’ 
140 
My09/My11/G
P6
+
 (região 
L1 –HPV) 
MY09:5'CGTCCMARRGGAWACTGATC3' 
MY11:5'GCMCAGGGWCATAAYAATGG3' 
GP6
+
: 5’GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC3’ 
450 
(My 09/11) 
 
190 
(My11/Gp6
+
) 
 
A nested PCR (MY09/11 + GP5+/6+) consistiu nas seguintes reações: 1° 
etapa: PCR MY09/11; desnaturação inicial a 95ºC por 3 minutos, 35 ciclos com 
desnaturação (95°C/30 segundos), hibridização dos iniciadores (55°C/30 segundos) 
e extensão (72°C/30 segundos). Por fim, foi incluída uma etapa de extensão final por 
72ºC por 8 minutos. Essa reação foi realizada com um volume final de 10 µl 
contendo 5 µL de Master Mix 2x, 2 µL de DNA, 1 µL de água; 1 µL de My09 com 
concentração inicial de 10 µM e final de 1 µM; 1 µL de My11 com concentração 
inicial de 10 µM e final de 1 µM. 
A 2° etapa (PCR GP5+/6+) consistiu em uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 
minutos, 35 ciclos com desnaturação (94°C/40 segundos), hibridização dos 
iniciadores (55°C/40 segundos) e extensão (72°C/ 40 segundos). Por fim, foi incluída 
uma etapa de extensão final por 72ºC por 8 minutos. Essa reação foi realizada com 
um volume final de 10 µL contendo 5 µL de Master Mix 2x, 2,6 µL de água; 1 µL de 
30 
 
GP5+ com concentração inicial de 10 µM e final de 1 µM; e 1 µL de GP6+, com 
concentração inicial de 10 µM e final de 1 µM. 
A semi-nested PCR foi realizada inicialmente com as mesmas condições de 
ciclos e reagentes padronizadas pelo autor. As condições iniciais da reação desemi-
nested PCR em uma única etapa foram com primer MY09 concentração de 0,25 µM; 
e primers My11 e GP6+ com concentração de 1 µM. No termociclador (PCR 
Genemate series), essa reação constituiu uma desnaturação inicial de 95ºC por 3 
minutos, 10 ciclos (fragmento My09/11) com desnaturação (95 °C/30 segundos), 
hibridização dos iniciadores (53°C/30 segundos) e extensão (72°C/30 segundos). 
Enquanto, os 30 ciclos seguintes (fragmento My11/GP6+) foram constituídos por 
uma desnaturação de 95°C por 30 segundos, hibridização (40°C/30 segundos) e 
extensão (72°C/30 segundos). Por fim, foi incluída uma etapa de extensão final por 
72°C por 7 minutos. 
Os produtos obtidos pela PCR foram revelados por eletroforese em gel de 
agarose a 2%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta com 
o auxílio de um transiluminador. As bandas observadas no gel foram analisadas 
através da comparação com a técnica padrão de PCR utilizada no laboratório. 
Para a análise do perfil da população estudada foi feita a utilização da 
metodologia de análise estatística descritiva. Utilizou-se a média, desvio padrão e 
análise de dispersão para as variáveis: idade, estado civil, vida sexual ativa, 
tabagismo, consumo de álcool e o número de parceiros durante a vida. 
Para o cálculo da prevalência do HPV foi feita uma análise com a proporção 
de positivos frente à proporção total de investigadas. 
 
 
 
 
 
 
31 
 
6- RESULTADOS 
 6.1. Padronização da técnica da PCR. 
 
6.1.1. PCR inicial. 
Os primeiros testes de PCR foram realizados com as mesmas condições 
padronizadas pelo autor: 2µL de DNA, 3,5 µL de água para PCR,10 µL de Master 
Mix 2x, 0,5 µL de My09, 2µL de My11, 2µL de GP6+. Os iniciadores apresentaram 
concentrações finais de 0,25 µM(MY09) e 1µM (MY11 e GP6+). 
Inicialmente foram testadas 25 amostras de secreção vaginal com resultados 
positivos na técnica padrão do laboratório. Para cada bateria de testes foi incluído 
um controle negativo. Os resultados desta primeira amplificação não apresentaram 
resultados satisfatórios, houve um baixa quantidade de DNA amplificado em relação 
a técnica utilizada pelo laboratório (Figura 1). Além disso, as amostras testadas 
apresentaram uma alta quantidade de rastros e fragmentos inespecíficos. 
Devido ao fato de que as condições propostas pelos autores não 
apresentaram bons resultados, foram feitas uma série de testes para adequação da 
reação para as condições das amostras. 
 
Figura 1: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x. Ladder de 100 pb. 
 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
32 
 
6.1.2. Aumento de DNA. 
Inicialmente foi realizado o aumento da quantidade de DNA de 2 µL para 4 µL, 
como objetivo de melhorar a quantidade de DNA amplificado. Foram mantidas as 
mesmas concentrações de iniciadores, volume de reação e condições de 
temperaturas. 
 Não foram observados resultados satisfatórios. Apenas uma amostra 
demonstrou quantidade satisfatória de DNA amplificado, embora tenha sido 
observado uma menor quantidade de rastro em relação ao teste inicial (Figura 2). 
 
Figura 2: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x. 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
6.1.3. Número de Ciclos. 
 Outra bateria de testes foi realizada para verificar a influência da quantidade 
de ciclos na reação de PCR. Nesta etapa foram alterados o número de ciclos da 
primeira e segunda etapa da reação. A reação padrão de 10+30 ciclos não se 
mostrou favorável, foi observado uma grande quantidade de DNA para o fragmento 
My09/11, mas a intensidade do fragmento My11/GP6+ (190 pb) foi abaixo do 
esperado. Em um segundo momento, reação testada foi de 10+35 ciclos que 
33 
 
apresentou como resultado uma melhora nos fragmentos MY11/GP6+ (Figura 3), 
utilizando 3µL de DNA, poucos rastros e menos fragmentos inespecíficos. E por fim, 
reação testada foi de 15+30 ciclos que obtivemos como resultado uma melhora no 
excesso de primer, porém apresentou fragmentos inespecíficos e ainda baixa 
quantidade de DNA para o fragmento MY11/GP6+. Esses testes utilizaram 3µL de 
DNA com a finalidade de diminuir os fragmentos inespecíficos e melhorar a 
amplificação do fragmento das amostras. 
 
Figura 3: Gel de agarose a 2% corado com SYBR Safe 1x. 
 
Lado esquerdo: PCR 10+35 ciclos e lado direto: PCR 15+30 ciclos. 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
6.1.4. Diluição de DNA 
Foi realizado uma bateria de testes com diluição de DNA para verificar se o 
excesso ou a baixa quantidade de DNA estaria interferindo na reação. Foi utilizado 
1µL de DNA e 9 µL de água em todos os tubos da reação. Em cada tubo foi 
colocado 1µL de DNA e 9 µL de água, depois foi passado do primeiro para o 
segundo tubo 1 µL e assim sucessivamente. Com isso a diluição ficou no primeiro 
teste 1 µL, no segundo 1:10, no terceiro 1:100, no quarto 1:1000, no quinto 1:10000 
e no sexto teste 1:100000. 
34 
 
Figura 4: Gel de agarose a 2% corado com SYBR Safe 1x 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
 6.1.5. Temperatura de hibridização dos iniciadores. 
Diversas temperaturas de hibridização foram testadas com o objetivo de 
melhorar a quantidade de DNA amplificado e diminuir os rastros na PCR. 
Primeiramente, foi testada a temperatura usada pelo autor, essa nos mostrou como 
resultado amostras não amplificadas, com pouca quantidade de DNA e formação de 
produtos inespecíficos (Figura 5). Em seguida, foram feitos testes alterando a 
temperatura de hibridização da primeira etapa da PCR. A temperatura de 55 ºC 
apresentou como resultado bandas fortes, porém ainda com fragmentos 
inespecíficos (Figura 6). Depois, foi testada uma temperatura de 57 ºC, essa 
apresentou melhoras nos fragmentos MY11/ GP6+, poucos fragmentos inespecíficos 
e poucos rastros (Figura 7). 
 
 
 
 
 
Figura 5: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x 
35 
 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
Figura 6: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
Figura 7: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x. 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
36 
 
Outro teste realizado foi o teste de gradiente, este usado para verificar a 
variação da temperatura de hibridização MY11/GP6+. Neste teste foi usado as 
seguintes temperaturas: 38 ºC, 38,5 ºC, 39 ºC, 39,5 ºC, 40 ºC, 40,5 ºC, 41 ºC, 41,5 
ºC, 42 ºC, e 42,5 ºC com o objetivo de diminuir os fragmentos inespecíficos. Com o 
aumento da temperatura, obteve-se o seguinte resultado: aumento do rendimento do 
MY09 e uma diminuição no MY11/GP6+. Já com as temperaturas baixas do 
gradiente, obteve-se um rendimento melhor para MY11/GP6+ e com menos rastros 
comparados com as maiores temperaturas. 
 
6.1.6. Termociclador 
Os resultados demonstraram que não ocorreu nenhuma variação significativa 
de rendimento quando utilizado diferentes termocicladores. 
 
6.2. Condições Finais. 
Após a realização de diversos testes, os melhores resultados obtidos foram 
demonstrados com as seguintes condições: temperatura de hibridização de 57 ºC, a 
3 µL de DNA, reação com 10+35 ciclos e concentração de iniciadores de 0,25 µM 
(My09) e 1 µM (MY11/GP6+), para um volume final de 20 µL. 
Ainda assim, os resultados obtidos na nested PCR (Figura 8) utilizada no 
laboratório demonstraram melhor amplificação de DNA e menor ocorrência de 
rastros e fragmentos inespecíficos (Figura 9). 
 
 
 
 
 
 
37 
 
Figura 8: Gel de agarose 2% corado com SYBR Safe 1x 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular 2017. 
Figura 9: Gel de agarose 2%corado com SYBR Safe 1x 
 
Fonte: Laboratório Biologia Molecular (2017) 
 
6.4 Perfil das estudantes 
Foram analisadas 55 amostras de estudantes universitárias que procuraram o 
Projeto Estudante Saudável da UFPA para a realização do exame de papanicolaou, 
durante o período do estudo, a idade destas estudantes variou dos 18 aos 46 anos, 
com média de 26,7 anos (Tabela 2). O percentual de estudantes com idade igual ou 
inferior a 25 anos foi de 65,45% (36/55) (Figura 10). 
38 
 
Figura 10: Gráfico da distribuição das estudantes por faixa etária 
 
Aproximadamente 90% das entrevistadas declararam-se solteiras (48/55), 
sendo as demais casadas (7,55%; 4/55). A maioria das estudantes (94,54%. 52/55) 
relatou ter vida sexual ativa. Destas, 64% (18/52) tiveram um ou dois parceiros 
sexuais durante a vida. Foi verificado que 94% (47/50) não eram fumantes e 64% 
(32/50) faziam uso de bebidas alcoólicas ocasionalmente (Tabela 1). 
 
Tabela 1: Características das estudantes 
Características Valores 
Idade (Anos) 
Variação 
Média (desvio padrão) 
Estado civil 
Não casadas (%) 
Casadas (%) 
Vida sexual ativa 
Sim (%) 
Não (%) 
Tabagismo 
Sim (%) 
Não (%) 
Uso de álcool 
Sim (%) 
Não (%) 
Parceiros sexuais durante a vida 
Variação 
Média (desvio padrão) 
 
18 a 46 
26,7 ( 7,1) 
 
48 (92%) 
5 ( 7%) 
 
52 (95%) 
3 (5 %) 
 
3 (6%) 
47 (94%) 
 
32 (64%) 
18 (36%) 
 
1 a 12 
4,8 (2.3) 
 
39 
 
6.5 Prevalência do HPV 
A prevalência da infecção pelo HPV entre as participantes do estudo foi de 
21,81% pela técnica de nested PCR (Figura 11) e de 36,36% quando considerado a 
técnica de semi-nested PCR (Figura 12). 
Figura 11: Prevalência do HPV pela técnica de nested PCR. 
 
 
Figura 12: Prevalência do HPV pela técnica de semi-nested PCR. 
 
 
 
 
21,81% 
78,19% 
Prevalencia do HPV (nested PCR) 
Positivo Negativo 
36,36% 
63,64% 
Prevalencia do HPV (Semi-nested PCR) 
Positivos Negativos 
40 
 
7- DISCUSSÃO 
A análise dos resultados do estudo mostrou que a técnica de semi-nested 
amplificou um número maior de amostras em relação à nested PCR. Todavia, houve 
dois casos discordantes entre as amostras que foram amplificadas por ambas as 
metodologias e, apesar dos vários testes de padronização da semi-nested, não 
foram obtidos resultados totalmente livres de rastros e fragmentos inespecíficos. 
Um dos fatores que podem justificar o maior número de amostras positivas na 
técnica testada está relacionado com o extensivo número de testes de padronização 
realizados para melhorar a amplificação pela técnica. Foram avaliados fatores 
frequentemente associados a falhas em PCR, como por exemplo, o excesso de 
DNA, excesso ou falta de reagentes, entre outros. 
Um segundo fator que também pode está relacionado com as amostras 
positivas é a temperatura de hibridização. Esta foi testada várias vezes e verificou-se 
que houve a amplificação do maior fragmento, apresentando uma maior quantidade, 
em contra partida não se conseguiu amplificar o segundo fragmento bem. Com isso, 
foram feitas várias alterações na segunda temperatura e não se notou uma melhora. 
Desse modo, foi realizada mais uma tentativa, dessa vez alterando a primeira 
temperatura. Essa alteração deixou a reação mais específica, aumentando a 
temperatura de hibridização e amplificando bem a região de MY09/11, porém quanto 
mais se aumenta a temperatura de hibridização, menos DNA se amplifica. Dessa 
forma, obteve-se uma melhora significativa no segundo fragmento. 
Outro fator que pode explicar a divergência entre o número de amostras 
amplificadas entre as duas técnicas foi a não otimização da nested PCR já utilizada 
no laboratório. De fato, durante a realização deste estudo não foi realizado nenhum 
teste para avaliar a qualidade da reação da metodologia de nested PCR. Alguns 
fatores podem estar associados com a menor quantidade de amostras positivas, 
entre estes o alto número de ciclos e o excesso de DNA. A técnica utilizada no 
laboratório de biologia molecular faz o uso de duas reações separadas com 35 ciclos 
cada. Este elevado número de ciclos pode gerar um excesso de DNA amplificado, o 
que pode comprometer a ação da enzima TAQ DNA polimerase, uma vez que o 
excesso de DNA na reação aumenta o número de cargas negativas e leva ao 
41 
 
sequestro do íon magnésio (Mg++), comprometendo desta maneira a atividade da 
polimerase durante a segunda reação. 
Apesar de todos os cuidados tomados neste estudo para prevenir a 
contaminação de amostras, a possibilidade de contaminação não pode ser 
descartada. Tal fator também pode estar associado à divergência entre o número de 
amostras amplificadas nas duas técnicas ou com a discordância apresentada nas 
duas amostras amplificadas na nested e negativas na metodologia de semi-nested 
PCR. 
 Sendo assim, outros testes se fazem necessários para melhorar a 
amplificação da técnica. A avaliação da interferência da quantidade de magnésio, a 
adição de substâncias aditivas (DMSO e solução Q) e a realização de uma 
touchdown pcr são exemplos que podem melhorar a qualidade da reação. Além 
disso, novos testes de temperatura, número de ciclos e purificação de DNA podem 
ser benéficos. 
 Dentre as variáveis analisadas foi encontrado um resultado similar na 
literatura em relação à idade das pacientes, estudos mostram que a prevalência do 
HPV é maior em mulheres no início da atividade sexual, decaindo com a idade 
(MOODY; LAIMINS, 2010). Este pico pode ser explicado por conta da maior 
frequência de atividade sexual, multiplicidade de parceiros sexuais, uso irregular de 
métodos contraceptivos de barreira e fragilidade da cérvice uterina no início da vida 
sexual, além dos traços psicossociais desse grupo etário, que normalmente não 
procura os serviços de saúde com a mesma regularidade que as mulheres mais 
velhas para fins preventivos (PINTO, 2011). 
A prevalência de HPV na população estudada foi muito próxima a encontrada 
por Vieira e colaboradores, onde foi observada uma prevalência de 25% entre 
estudantes universitárias de Belém (VIEIRA, 2015). 
Coelho e colaboradores estudaram as mulheres do município de Bragança no 
estado do Pará no ano de 2016, obtendo a prevalência de 37,5% (COELHO, 2016). 
Em relação ao estado civil, observa-se uma maior frequência de HPV em 
mulheres solteiras (85,71%), que pode ser por conta da multiplicidade de parceiros. 
A multiplicidade de parceiros sexuais enquadra-se como importante fator de risco 
42 
 
para aquisição de IST, tendo em vista que mulheres com tal comportamento 
possuem maior oportunidade de contato com diferentes tipos virais a cada contato 
com novo parceiro sexual (MOSCICKI A, 2001). 
Este é um dado preocupante, pois nos mostra que mulheres jovens e 
universitárias não estão fazendo o uso da camisinha. Pinto e colaboradores 
estudaram a prevalência de infecção genital pelo HPV, e encontraram prevalência 
de infecção genital significativamente maior em mulheres solteiras, separadas ou 
viúvas (PINTO, 2011). Todavia, foram observadas na literatura estudos onde as 
mulheres com mais infecções pelo HPV são as casadas ou em união estável, devido 
a confiança na estabilidade da relação conjugal e o não uso do sexo seguro (AYRES 
E SILVA, 2010). 
As altas taxas de mortalidade pelo CCU na região Norte do Brasil e o 
comportamento de risco apresentado neste estudo mostra a relevância de ações de 
saúde para a população jovem com objetivo de conscientizar sobre a importância do 
uso da camisinha e sobre a realização periódica do PCCU buscando identificar 
lesões e favorecendo o tratamento precoce caso necessário.43 
 
8- CONCLUSÃO 
A avaliação da técnica proposta mostrou que esta tem potencial para ser 
utilizada na rotina do laboratório, diminuindo o uso de reagentes e diminuindo o 
tempo de reação. Porém, outros testes de padronização ainda precisam ser 
realizados para melhorar a qualidade da reação de amplificação, além da utilização 
de um número maior de amostras. 
A prevalência da infecção pelo HPV foi semelhante a encontrada em outros 
estudos, onde mulheres jovens são as mais acometidas. É fundamental a 
conscientização da população acerca da doença, da prevenção, a utilização de 
preservativos nas relações sexuais, vacinação e a realização de exames 
ginecológicos periódicos, como Papanicolau e o uso das técnicas de biologia 
molecular nos casos indispensáveis, permitindo assim o diagnóstico precoce e 
diminuindo as chances de desenvolvimento do CCU. 
 
 
44 
 
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- 
 
 
47 
 
APÊNDICE A: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE) 
 
 
 
48 
 
APÊNDICE B: QUESTIONÁRIO PARA AS ESTUDANTES. 
 
 
49 
 
 
 
 
 
50 
 
ANEXO A – APROVAÇÃO COMITÊ DE ÉTICA. 
 
 
 
51 
 
ANEXO B: Protocolo de extração.