Relatório Cinética Enzimática (1)

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RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA DE CINÉTICA ENZIMÁTICA DA LDH
QBQ211 – IQUSP 2016
Grupo: 
PARTE I – DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DA LDH 1 E LDH 5
1. Determinação da Cinética da LDH 1
A partir da experiência e aplicando a lei de Lambert-Beer (Aλ=ελ.c.d; para A = 503 nm; E = 19200 M-1.cm-1; d = 0,45 cm), foram obtidos os seguintes dados, já descontada a absorbância do tubo branco (ABranco = 0,190 nm) no cálculo da concentração de produto formado:
	Tubo
	Absorbância
	Concentração de produto formado (µM)
	Velocidade da reação (µM/min)
	1/V
	Concentração de lactato na reação (mM)
	1/[S]
	1
	0,163
	-0,633
	-0,063
	-15,802
	0,050
	20,000
	2
	0,272
	1,922
	0,192
	5,203
	0,070
	14,286
	3
	0,227
	0,867
	0,087
	11,532
	0,100
	10,000
	4
	0,300
	2,578
	0,258
	3,879
	0,200
	5,000
	5
	0,375
	4,336
	0,434
	2,306
	0,500
	2,000
	6
	0,476
	6,703
	0,670
	1,492
	0,700
	1,429
	7
	0,590
	9,375
	0,938
	1,067
	1,000
	1,000
	8
	0,626
	10,219
	1,022
	0,979
	1,500
	0,667
	9
	0,766
	13,500
	1,350
	0,741
	2,000
	0,500
Os dados da linha 1 foram inconsistentes, uma vez que o valor da absorbância foi inferior ao do tubo branco. Os resultados dos tubos 2 e 3 também apresentaram incoerência, pois a absorbância da solução no tubo 3 foi inferior à do tubo 2, apesar de ter uma concentração de substrato maior. 
As discrepâncias observadas podem ter ocorrido por medição incorreta dos reagentes, por descalibração das pipetas e/ou inexperiência do grupo, e no intervalo incorreto de tempo entre cada pipetação de lactato nos tubos. 
Os dados da linha 1 foram desconsiderados. Entretanto, os das linhas 2 e 3 foram mantidos em razão dos cálculos dos valores de KM e VMÁX, que sofreriam alteração relevante com a exclusão, e por não se saber precisar o impacto dos erros da análise sobre o total do experimento.
Mesmo sem esses dados, não seria obtida a hipérbole esperada no gráfico da velocidade em função da concentração do substrato, correspondente a uma enzima de cinética michaeliana(1)(2). Adicionando uma linha de tendência logarítmica, obtém-se uma curva mais próxima do esperado.
No gráfico duplo-recíproco, os valores dos tubos 2 e 3, mais distantes da reta, apresentam a maior distorção.
Pela reta média do gráfico duplo-recíproco, utilizando a equação de Lineweaver-Burk, obtiveram-se os seguintes valores:
	VMÁX
	0,947 µM/min
	KM
	1,965 mM
2. Determinação da Cinética da LDH 5
A partir da experiência e aplicando a lei de Lambert-Beer (Aλ=ελ.c.d; para A = 503 nm; E = 19200 M-1.cm-1; d = 0,45 cm), foram obtidos os seguintes dados, já descontada a absorbância do tubo branco (ABranco = 0,141 nm) no cálculo da concentração de produto formado:
	Tubo
	Absorbância
	Concentração de produto formado (µM)
	Velocidade da reação (µM/min)
	1/V
	Concentração de lactato na reação (mM)
	1/[S]
	1
	0,128
	-0,305
	-0,030
	-32,821
	0,5
	2,000
	2
	0,130
	-0,258
	-0,026
	-38,788
	1
	1,000
	3
	0,147
	0,141
	0,014
	71,111
	2
	0,500
	4
	0,170
	0,680
	0,068
	14,713
	4
	0,250
	5
	0,137
	-0,094
	-0,009
	-106,667
	7
	0,143
	6
	0,200
	1,383
	0,138
	7,232
	10
	0,100
	7
	0,163
	0,516
	0,052
	19,394
	12
	0,083
	8
	0,204
	1,477
	0,148
	6,772
	15
	0,067
Os dados das linhas 1, 2 e 5 apresentaram valor de absorbância inferior ao do tubo branco, o que demonstra haver erro na obtenção dos mesmos.
Os dados relativos ao tubo 3, apesar de não terem apresentado incoerência em relação aos demais, contribuiria para valores incoerentes de VM e KMÁX. 
As discrepâncias observadas podem ter ocorrido por medição incorreta dos reagentes, por descalibração das pipetas e/ou inexperiência do grupo. Houve, ainda, influência do mal funcionamento de um pipeta no momento de introduzir o lactato, que precisou ser substituída e afetou o intervalo de pipetação.
Na elaboração dos gráficos, optou-se por utilizar os dados das linhas 4, 6, 7 e 8, apesar da inconsistência observada no tubo 7, cuja absorbância foi inferior à do tudo 6.
Pela reta média do gráfico duplo-recíproco, utilizando a equação de Lineweaver-Burk, obtiveram-se os seguintes valores:
	VMÁX
	0,107 µM/min
	KM
	2,277 mM
3. Conclusão comparativa dos parâmetros cinéticos de LDH 1 e LDH 5
A expectativa era de que o valor de KM fosse menor para LDH 1, pois esta enzima apresenta maior afinidade pelo lactato do que a LDH 5(1). Apesar dos erros identificados, isso foi corroborado pelo experimento, seja pela observação direta da alteração de cor do indicador apenas com a enzima LDH 1, mesmo a concentrações menores de lactato do que aquelas utilizadas para LDH 5, como pela análise dos dados da cromatografia, que possibilitou calcular valores de KM condizentes com essa expectativa, embora não tão distantes.
A maior diferença foi observada entre as velocidades máximas obtidas, sendo a VMÁX da LDH 1 cerca de 9 vezes maior que a de LDH 5. 
Esses dados permitem concluir que não apenas a afinidade da LDH 1 pelo lactato é maior, atingindo máxima eficiência catalítica em menores concentrações de substrato, mas a própria eficiência cinética da enzima LDH 1 é maior em relação a LDH 5. Isso é condizente com a ocorrência das enzimas no organismo, isto é, da LDH 1 no coração e da LDH 5 no músculo esquelético (e no fígado), evitando o acúmulo de lactato (que leva à fadiga) no primeiro e permitindo a utilização do piruvato no metabolismo aeróbico, enquanto nos tecidos esqueléticos possibilita o metabolismo anaeróbico, com liberação de ATP durante atividades físicas(1).
PARTE II – QUESTÕES COMPLEMENTARES
REFERÊNCIAS
(1) Fundamento do Roteiro para a Aula Prática.
(2) NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5ª edição. Porto Alegre, Artmed.