Relatório 1

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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Agrárias
 Curso de Engenharia de Alimentos 
	
RELATÓRIO: CURVA PADRÃO E PROTEINA- MÉTODO BRADFORD
Aluna: Lívia Caroliny Almeida - 2013068420
 Professor: Igor Viana Brandi
Disciplina: Laboratório de Engenharia Bioquímica 
Agosto 2017
INTRODUÇÃO
As proteínas são componentes essenciais a todas as células vivas e estão relacionadas praticamente a todas as funções fisiológicas, existem muitas espécies diferentes para cada função biológica diversa. Atividades de pesquisa e desenvolvimento na área de produção, purificação e caracterização de enzimas exigem um método rápido e sensível para a quantificação de proteínas. O método baseado na adsorção do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas chamado também de Bradford (Bradford, 1976).
O método baseia se na adição de etanol, ácido fosfórico e um corante chamado Azul Brilhante de Coomassie G250 à solução contendo proteínas. 
No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante da forma aniônica (vermelha) para a forma catiônica (azul), que absorve fortemente em 595 nm (ZAIA et al., 1998). 
Sedmak (1977) relatam que este método é baseado na interação entre o corante e o grupo NH3+ das proteínas. Esta interação pareceu ser uma função da concentração de hidrogênio com ácido perclórico diluído e ácido clorídrico. Nem todas as proteínas têm a mesma proporção de grupos NH3+ e nem todos estes grupos reagem identicamente com o corante. Assim, a quantidade de coloração desenvolvida no ensaio do corante varia com a proteína usada, como acontece nos ensaios de Lowry.
OBJETIVOS 
A prática teve como objetivo principal determinar a concentração de proteínas presentes na amostra de BSA (bovine sérum albumin).
MATERIAIS
Reagente de Brandford
Solução de BSA 1µL 
Leite de vaca 
Água Milli-Q
Espectrofotômetro com comprimento de onda de 595nm
Cubeta 1,5 ml
Tubos de microcentrifuga
Pipetas graduadas e fracos para preparação e armazenamento de reagente
Pipetas de precisão 
Becker
METÓDOS
Foram distribuídos 5 tubos de ensaio, nas concentrações: 1mg/mL, 0,5mg/mL, 0,25mg/mL, 0,125mg/mL. Utilizando as micropipetas de acordo com o volume pretendido, adicionou-se água destilada, BSA (dissolvido em água para concentração final de 1 mg µL-1) e o reagente de Bradford nas proporções. Preparou-se uma solução estoque de 1mg/1mL, ou seja, pesa-se 1 mg de BSAe o dissolve em 1mL de água destilada, a concentração desta solução em microgramas por microlitro é 1000ug de BSAem 1000uL de água destilada. 
Adicionou-se ao tudo todos os itens constantes na pratica 1, agitou-se os tubos em agitador do tipo vortex. A calibração do espectrofotômetro para o valor da absorbância zero foi realizado utilizando-se água destilada (amostra branco). Em seguida, colocou-se o conteúdo do tubo nº 1 na cubeta, e registrou-se a leitura da absorbância. Da mesma forma, foram realizadas as leituras da absorbância dos tubos 2 a 5. Os valores foram tabulados e apresentados na tabela 1. A figura 1 apresenta um esquema didático de fácil visualização do processo como um todo.
Figura 1: representação da prática de curva padrão e proteína utilizando o método de Bradford.
RESULTADOS E DISCURSSÃO
Observamos nos gráficos a seguir, referente ao experimento, que aumentando-se a concentração de BSA aumentou a absorbância.
	Amostra
	Concentração (mg/mL)
	Abs (595nm)
	Branco
	0
	0,00
	A1
	1
	0,130
	A2
	0,5
	0,101
	A3
	0,25
	0,082
	A4
	0,125
	0,077
Tabela 1: Leitura das amostras no espectrofotômetro da curva padrão de BSA no método de Bradford.
A curva de calibração é apresentada na Figura 2. Conforme pode ser observado, a correlação entre absorbância e quantidade de proteína se mostrou linear no intervalo de 1mg/mL para 0,130nm de absorbância a 0,125mg/mL para 0,077nm.
A curva-padrão corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância e os de concentração. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração.
Figura 2: Curva elaborada para a quantificação de proteínas pelo método de Bradford com padrão BSA.
A partir da curva apresentada na figura 1 obteve-se a equação 1. Que evidencia a quantidade de proteína e absorbância a 595nm.
ABS = 0,103mg/mL+0,0394nm
Equação 1: Correlação entre a concentração proteica e absorbância a 595nm.
Pode-se também concluir que este é um método muito sensível, daí a existência de erros que podem ter ocorrido. Os possíveis erros que podem levar a menor linearidade da curva podem estar associados a erro de pesagem, erro de pipetagem, inexistência das repetições, variação dos instrumentos utilizados como, balança, micropipeta e espectro. 
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha da metodologia adequada para determinação de proteínas totais em qualquer tipo de amostra. Segundo Zaia et al (1998), o principal deles é o conhecimento mais preciso possível dos constituintes da amostra e de suas concentrações, o que facilita na identificação de possíveis interferentes e ajuda na escolha do método mais apropriado.
O método de Bradford é muito usado em purificação de proteínas, devido à sua rapidez, sensibilidade e existência de poucos interferentes por outro lado existe uma desvantagem, o método detecta somente moléculas de proteínas com 8-9 ligações peptídicas (Bradford, 1976) e, portanto, subestima as concentrações de proteínas.
 
Ao fim do experimento foi possível verificar que influências do meio, como diferenças no volume manipulado podem produzir diferentes leituras de concentração como vimos no experimento, mas ao final nos permitiram medir a concentração total de proteínas das amostras pelo método de Bradford.
CONCLUSÃO
	Os métodos colorimétricos para determinação de proteínas são empregados em diversos ambientes: culturas de microrganismos, em alimentos, para determinação do crescimento bacteriano, em águas naturais e residuárias, entre outros. Com o experimento conseguimos determinar a curva de absorbância em presença da proteína. Também podemos aplicar o conhecimento do programa Excel.
REFERÊNCIAS 
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., v. 72, p. 248, 1976.
SEDMAK, J. J.; GROSSBERG, S.E. (1977). A rapid sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G250. Anal. Biochem v. 79, p. 544-552.
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. (1998). Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existente Química nova. v.21, n. 6, p. 787-793.
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Quim. Nova, v. 21, n. 6, p. 787-793, 1998.