Protocolos dos trabalhos de Laboratório B1 2021

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47146 - Laboratório B1-MIA 
 
 
 
 
Guia de trabalhos práticos – Componente B1 
 
2020/2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8263 - Licenciatura em Bioquímica 
8264 - Licenciatura em Biotecnologia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.google.pt/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.neqaauav.pt%2F&psig=AOvVaw1s1DMBB8yuVwhPeW63bs7p&ust=1581594121127000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCODh-7X3y-cCFQAAAAAdAAAAABAD
Laboratório B1-MIA / Funcionamento da Unidade Curricular 2 
Laboratório B1-MIA 
O B J E T I V O S D E A P R E N D I Z A G E M 
✓ Familiarizar os estudantes com técnicas experimentais usadas em bioquímica e química analítica. 
✓ Reforçar o conhecimento e o entendimento de conceitos importantes por experimentação. 
✓ Combinar teoria e prática na interpretação de resultados experimentais. 
✓ Aplicar conhecimentos prévios a situações novas. 
C O N T E Ú D O S P R O G R A M Á T I C O S 
Componente B1 
✓ Quantificação de proteínas pelo método colorimétrico do Biureto. 
✓ Determinação de vitamina C em sumo de laranja por espetrofotometria de visível. 
✓ Extração de lípidos de um alimento e análise por TLC. 
✓ Cromatografia de exclusão molecular. Troca de tampão de uma solução de proteína. 
✓ Invertase: preparação do extrato não purificado da enzima e estudo cinético da catálise da 
invertase. 
✓ Determinação da massa volúmica (método areométrico) e da acidez total. Aplicação ao vinho 
como caso de estudo. 
 
Componente MIA 
✓ Determinação de cloro livre numa lixívia. 
✓ Determinação de alumínio por titulação complexométrica com EDTA. 
✓ Determinação de magnésio numa água engarrafada por espetrofotometria de absorção atómica. 
✓ Determinação de sódio em leite por espetrofotometria de emissão de chama. 
✓ Determinação de fósforo por fotometria. 
✓ Doseamento potenciométrico de cloreto ou cobre, usando um elétrodo seletivo. 
✓ Análise de aditivos em refrigerantes por HPLC. 
 
Componentes B1e MIA 
✓ Elaboração de um poster. 
 
 
 
A R T I C U L A Ç Ã O D A S A T I V I D A D E S 
O Laboratório B1-MIA é uma unidade curricular do 2.º Semestre do 2.º ano das Licenciaturas em 
Bioquímica e Biotecnologia. É uma UC de formação em técnicas de base à Bioquímica e a Métodos 
Instrumentais de Análise, que surge após a formação geral lecionada ao nível do 1.º ano. 
Os fundamentos das técnicas laboratoriais que constam do programa foram lecionados em UC 
anteriores e estão a ser lecionadas no mesmo semestre, como é o caso dos Métodos Instrumentais 
de Análise. 
Laboratório B1-MIA / Funcionamento da Unidade Curricular 3 
M E T O D O L O G I A S D E E N S I N O E A V A L I A Ç Ã O 
De acordo com o Regulamento de Estudos de Licenciatura da UA (RELUA), a avaliação é contínua. 
A avaliação decorrerá em vários momentos, tendo sempre presente que cada uma das 
componentes (B1 e MIA) terá um peso de 50%: 
1. Avaliação contínua, que decorrerá durante todas as aulas (preparação, cálculos ou questionários 
prévios, conhecimento do trabalho a realizar, desempenho no laboratório, capacidade de 
interpretação dos resultados e relatório), e que pesará 35% na nota final. 
2. Será ainda avaliada a execução de um poster referente a trabalhos práticos que os estudantes 
tenham executados ao longo da sua vida académica, com um peso de 5% na nota final. 
3. Serão realizados dois momentos escritos de avaliação, a decorrer a meio do semestre (30 de abril) 
e na última semana de aulas (23 de junho), tendo cada um um peso de 30% na nota final. 
Na época de recurso será feito um exame escrito que terá um peso de 60% na nota final, e cuja nota 
será complementada com 30% da classificação obtida na avaliação referida em 1 e 2. 
A P R E N D I Z A G E M A T I V A 
Nas aulas promove-se uma aprendizagem ativa e a aquisição de autonomia no laboratório, que 
culminará com a elaboração de um poster integrando os conhecimentos adquiridos nas 
componentes B1 e MIA. 
C Á L C U L O D A C L A S S I F I C A Ç Ã O F I N A L 
Avaliação contínua: 
35.00% P Desempenho no laboratório, caderno e relatórios 
30.00% P 1ª prova escrita 
30.00% P 2ª prova escrita 
5.00% P Elaboração de um poster 
Avaliação Final: 
60.00% P Exame escrito 
35.00% P Desempenho no laboratório 
5.00% P Elaboração de um poster. 
R E Q U I S I T O S 
B1: Formação básica em Bioquímica, Química-Física e Laboratório Q1. 
MIA: Frequência prévia e/ou simultânea da disciplina de Métodos Instrumentais de Análise. 
B I B L I O G R A F I A P R I N C I P A L 
B1 e MIA: Guia de laboratório e bibliografia aí incluída/recomendada 
C O E R Ê N C I A C O N T E Ú D O S / O B J E T I V O S 
Cada componente terá 8 trabalhos laboratoriais, correspondendo a 8 aulas, complementadas por 
duas aulas de discussão geral dos trabalhos e resultados e a elaboração de um poster, permitindo 
familiarizar os estudantes com as técnicas experimentais usadas em bioquímica e química analítica 
Laboratório B1-MIA / Funcionamento da Unidade Curricular 4 
e reforçar o seu conhecimento da aplicação das técnicas experimentais. É também incentivada a 
combinação dos conceitos teóricos e práticos na interpretação dos resultados experimentais e a 
aplicação dos conhecimentos a novas situações. 
 C O E R Ê N C I A M E T O D O L O G I A S / O B J E T I V O S 
A UC consta de um conjunto de trabalhos laboratoriais do âmbito da química analítica e da 
bioquímica. Em alguns trabalhos os alunos aplicam novas técnicas analíticas que estão a ser 
ensinadas noutra UC do mesmo semestre (Métodos Instrumentais de Análise) ou que são 
explicadas em aulas de introdução aos trabalhos. Os manuais de trabalhos práticos incluem textos 
de apoio e questionários que guiam o estudante no estudo e na auto-avaliação dos conhecimentos 
adquiridos. Na análise e interpretação dos resultados incentiva-se a interdisciplinaridade, a 
articulação entre teoria e prática, a revisão de vários assuntos estudados em UC anteriores e o 
aprofundamento de alguns deles. Encoraja-se uma abordagem aprofundada e integrada dos temas 
em estudo. 
C A R G A D E T R A B A L H O 
A UC de Laboratório B1-MIA tem uma escolaridade de seis horas práticas semanais, 
correspondentes a 6 ECTS. 
 
 
 
Laboratório B1-MIA / Funcionamento da Unidade Curricular 5 
LABORATÓRIO B1-MIA 2020/2021 - componente B1 
 
Semana Mês 
Segunda 
P4 9h-12h MAC 
P1 13h30-16h30 MAC 
P6 17h-20h CN 
Terça 
P5 9h-12h CP 
P2 13h-16h JS 
P8 16h30-19h30 JALS 
Quarta 
 
Quinta 
P7 9h-12h RF 
P6 13h-16h FA 
P3 16h30-19h30 AG 
Sexta 
P10 8h30-11h30 FRE 
1 março 
(11) 
Não há aula 
(12) 
Não há aula 
2 março 
(15) 
Apresentação 
(16) 
Apresentação 
 
(18) 
Apresentação 
(19) 
Apresentação 
3 março 
(22) 
Elaboração de posters 
(23) 
Elaboração de posters 
 
(25) 
Elaboração de posters 
(26) 
Elaboração de posters 
4 abril 
(5) 
T1 
(6) 
T1 
 
(8) 
T1 
(9) 
T1 
5 abril 
(12) 
T2 
(13) 
T2 
 
(15) 
T2 
(16) 
T2 
6 abril 
(19) 
T3 
(20) 
T3 
 
(22) 
T3 
(23) 
T3 
7 abril 
(26) 
Discussão T1-T3 
(27) 
Discussão T1-T3 
 
(29) 
Discussão T1-T3 
 (30)* 
1º Teste 
8 maio 
(3) 
T4 
(4) 
T4 
 
(6) 
T4 
(7) 
T4 
9 maio 
(10) 
T5 (1ª parte) 
(11) 
T5 (1ª parte) 
 
(13) 
T5 (1ª parte) 
(14) 
T5 (1ª parte) 
10 maio 
(17) 
T5 (2ª parte) 
(18) 
T5 (2ª parte) 
 
(20) 
T5 (2ª parte) 
(21) 
T5 (2ª parte) 
11 maio 
(24) 
T6 
(25) 
T6 
 
(27) 
T6 
(28) 
T6 
12 maio/junho 
(31) 
Apresentação dos 
posters ** 
(1) 
Apresentação dos 
posters ** 
 
(3) 
Feriado 
(4) 
Apresentação dos 
posters ** 
13 junho 
(7) 
Não há aula 
(8) 
Não há aula 
 
(10) 
Feriado 
(11) 
Não há aula 
14 junho 
(14) 
Discussão T4-T6 e 
Avaliação 
(15) 
Discussão T4-T6 e 
Avaliação 
 
(17) 
Discussão T4-T6 e 
Avaliação 
(18) 
Discussão T4-T6 e 
Avaliação 
15 junho 
(21) 
Não há aula 
(22) 
Não há aula 
(23) 
2º Teste 
(24) 
Não há aula 
 
* A Discussão T1-T3 para a turma de sexta-feira será feita em horário a combinar entre o docente e os estudantes, antes do dia 
do teste.** A apresentação dos posters é feita por turma em conjunto entre as componentes B1 e MIA, no horário da turma B1 ou MIA, 
de acordo com a disponibilidade dos docentes e estudantes. 
 
 
 
Docentes (iniciais à frente do horário de cada turma): 
CP = Cláudia Passos MAC – Manuel A. Coimbra JALS = José A. Lopes da Silva AG = Ana Gil 
FA = Francisco Amado CN = Cláudia Nunes FRE = Felisa Rey Eiras RF – Rita Ferreira JS = Jorge Saraiva 
 
Laboratório B1-MIA / Funcionamento da Unidade Curricular 6 
Funcionamento da UC 
 
1. Material 
- Bata e óculos de laboratório. Só trabalhará no laboratório quem possuir bata e óculos de 
laboratório. 
- Caderno de laboratório. O caderno de laboratório não é um conjunto de folhas soltas, nem mesmo 
se agrupadas num caderno de argolas. No caderno de laboratório deverão ficar registados todos os 
procedimentos a efectuar e efectuados, desde a preparação de cada aula, valores registados 
(mesmo os intermédios), observações e principais conclusões de cada trabalho. O caderno de 
laboratório deverá conter as respostas às questões colocadas nos protocolos e os exercícios a 
efectuar nas aulas de discussão dos trabalhos. 
 
2. Preparação da aula 
Uma leitura atenta do guia de trabalhos práticos é fundamental para se conseguir tirar o máximo 
rendimento da aula. No trabalho de preparação da aula deve ter em atenção os seguintes pontos: 
- Cálculos preliminares para a preparação de soluções, pesagens, etc. 
- Elaboração de uma lista de dúvidas que eventualmente lhe surjam, as quais deverá discutir com o 
docente no início da aula. 
- Elaboração de um plano de trabalho (tipo diagrama de fluxo), que deve incluir de forma resumida 
o material a usar em cada passo, reagentes e quantidades, bem como os cuidados a ter. 
- Preparação de tabelas para o registo de observações e resultados experimentais. 
A preparação da aula deverá ser feita no caderno de laboratório. 
 
3. Durante a aula 
As aulas funcionarão em grupos de 2 estudantes. Devido à situação de pandemia, só um estudante 
de cada grupo estará no laboratório, devendo o colega de grupo acompanhar o trabalho online. 
Cada estudante deve registar no seu caderno de laboratório todos os resultados e observações que 
surgirem no decorrer da aula. 
Serão efectuadas duas aulas de discussão dos trabalhos (ver calendário na página anterior). Nas 
aulas de discussão dos trabalhos serão apresentados exemplos de aplicação das matérias em estudo 
a novas situações e serão resolvidos problemas. 
 
4. Relatório 
De cada aula prática deverá ser feito um relatório. Os relatórios são elaborados por grupo e 
entregues no próprio dia ou, no máximo, nos dias seguintes à sua elaboração, de acordo com a data 
acordada com o Professor, para poderem ser entregues corrigidos na aula seguinte. 
Os relatórios devem ser sucintos, contendo os seguintes aspetos: 
✓ Título do trabalho, 
✓ Autores e grupo/turma, 
✓ Dia em que foi feito, 
✓ Objetivos do trabalho, 
✓ Estratégia seguida para atingir os objetivos, 
✓ Resultados e sua discussão, 
✓ Conclusões, que devem estar de acordo com o t´+itulo e devem dar resposta aos objetivos 
definidos. 
As respostsa às perguntas específicas do guia deverão ser enquadradas na discussão dos resultados. 
Laboratório B1-MIA / Regras gerais de segurança no laboratório 7 
 
Regras gerais de segurança no laboratório 
 
1. Conduta geral em caso de acidente: No caso de ocorrer qualquer acidente é fundamental que 
mantenha a calma e saiba qual a primeira atitude a tomar. Uma vez tomadas as primeiras 
medidas de segurança, (descritas ao longo deste texto), informe imediatamente o docente do 
ocorrido. 
2. Higiene laboratorial: Não é permitido comer beber ou fumar
1
 no laboratório. Deve lavar as 
mãos frequentemente sempre que trabalhe com produtos químicos e, em particular, se 
derramar sobre a pele algum produto e após uma aula antes de comer ou fumar. 
3. Protecção corporal: É obrigatório o uso de bata e óculos de segurança (ou outros), sem os quais 
o aluno não é autorizado a permanecer no laboratório. Deve usar luvas de protecção e utilizar 
o nicho sempre que manipular substâncias de alguma forma perigosas.
2
 
4. Prevenção contra incêndios: 
 i) Tenha particular atenção ao manuseamento de substâncias inflamáveis. Nunca aqueça 
solventes inflamáveis em placas de aquecimento, use sempre banho de água.
3
 
 ii) Conheça a localização e modo funcionamento do extintor do laboratório e do balde de areia. 
Não se esqueça de que em caso de incêndio deve dirigir o jacto do extintor para a base das 
chamas. 
 iii) Conheça também a localização da manta de amianto que serve para extinguir incêndios no 
vestuário. 
 iv) Certifique-se de que conhece o ponto mais próximo do seu laboratório em que pode accionar 
manualmente o alarme contra incêndio. 
 v) Se um incêndio atingir proporções incontroláveis deve accionar o alarme de incêndio do 
Departamento. 
5. Comportamento em caso de alarme de incêndio: O sistema de detecção e alarme contra 
incêndios do Departamento de Química pode ser accionado automaticamente através dos 
sensores distribuídos pelo edifício, ou manualmente. Quando o alarme for accionado proceda 
do seguinte modo: 
 i) Desligue todos os aparelhos eléctricos que estiver a utilizar e coloque em segurança todo e 
qualquer material. Estas tarefas devem ser efectuadas o mais rapidamente possível, mas sem 
pânico, de modo a não causar mais acidentes. 
 ii) Dirija-se rapidamente, mas sem atropelos nem pânico, para a porta de saída do 
Departamento, junto à Secretaria e ao Bar e aguarde no exterior. Não deve abandonar este 
local sem que para tal seja autorizado. 
Note bem: 
 i) A observação destas regras é absolutamente obrigatória. 
 ii) Esporadicamente são executados treinos para testar os sistemas de emergência. Mesmo 
nestas alturas, todas as normas acima referidas devem ser observadas como se duma situação 
real se tratasse! 
 
 
1
 É proibido fumar dentro do edifício do Departamento de Química. Excluem-se desta restrição a zona entre a 
Secretaria e o Bar 
2
 Consulte sempre os rótulos dos frascos em caso de dúvida e, em último caso, coloque a questão ao docente. 
3
 Trata-se apenas de uma regra geral, no entanto, há que ter em atenção que determinados reagentes inflamam (ou 
explodem) em contacto com a água, outros reagentes específicos ou mesmo com o ar !, pelo que é fundamental a 
leitura atenta do rótulo de um produto desconhecido. 
Laboratório B1-MIA / Regras gerais de segurança no laboratório 8 
 
6. Tratamento em caso de acidente 
 i) Cortes: deve lavar imediatamente com água e desinfectar o ferimento. Tenha cuidado para 
que nenhum pedaço de vidro ou qualquer corpo estranho fique no ferimento. 
 ii) Queimaduras (calor, ácidos ou bases): lave abundantemente a área atingida com água e 
notifique o docente. 
7. Conservação do Laboratório e do material: 
 i) Deve manter limpas e livres de qualquer obstáculo as zonas de circulação do seu laboratório 
 ii) Deve manter limpa a bancada 
 iii) O material de vidro que utilizar deve ser convenientemente lavado e arrumado no fim do 
trabalho. 
 iv) Os frascos de reagentes e solventes, uma vez usados, devem ser repostos no seu lugar. 
 v) Os aparelhos devem ser utilizados e protegidos respeitando as instruções de operação. 
 vi) Sempre que danificar ou encontrar danificado algum tipo de material informe 
imediatamente o docente para que este possa ser substituído ou reparado. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 1 9 
 
Quantificação de proteínas pelo método espetrofotométrico do Biureto 
 
 
Conceitos a rever para a preparação da aula: 
- Lei de Beer-Lambert 
- Princípios da espectrofotometria de UV-Vis 
 
1.1. Introdução 
As proteínas desempenham papéis extremamente importantes em inúmeros processos 
biológicos, podendo atuar como enzimas, hormonas, neurotransmissores, transportadores de 
membrana, entre outros. A quantificação de proteínas recorrendo à espetrofotometriaé um 
procedimento muito comum nas áreas da bioquímica e da biotecnologia. Apesar de ser 
extremamente importante o estudo estrutural das proteínas, muitas vezes, numa primeira fase 
começa-se por avaliar o teor total de proteína. A sua quantificação por espetrofotometria faz-se, 
usualmente, recorrendo: 
i) a cromóforos (UV) intrínsecos, como é o caso de resíduos aromáticos (280 nm) ou de 
ligações peptídicas (205 nm), ou 
ii) procede-se à reação entre a proteína e um agente que origina a formação de um 
produto corado ou fluorescente. 
Relativamente ao primeiro caso pode-se referir o método direto por espetrofotometria de UV 
(com leituras a 280 e 205 nm), para o segundo caso tem-se por exemplo o método do Biureto (gama 
de linearidade: 1-6 mg/mL). 
A medida de absorvência a 280 e 205 nm dá apenas um valor aproximado da concentração, a 
não ser que se trate de uma proteína muito pura, cuja absortividade é conhecida. A escolha do 
método a usar baseia-se essencialmente na gama de linearidade e nos limites de deteção e de 
quantificação do método e na concentração expectável da proteína na amostra. Assim, para se 
determinar a ordem de grandeza da concentração de proteína e escolher o método de análise mais 
adequado, mede-se (nos casos mais simples) a absorvência a 280 nm. 
Na Tabela 1.1 estão listados os métodos usados mais frequentemente para a determinação 
da concentração de proteína total. Os métodos de Lowry, Bradford e BCA (método do ácido 
bicinconínico) permitem a determinação de concentrações da ordem das µg de proteína. Para além 
da gama de linearidade e da sensibilidade, os interferentes são também fatores a ter em 
consideração aquando da escolha do método a usar. 
 
Tabela 1.1. Métodos frequentemente usados para a determinação da concentração de proteína 
total (Amado et al., 2013). 
Método Princípio Interferentes 
Biureto 
Complexo Cu2+-ligação peptídica pelo 
reagente de Biureto 
Tris, iões amónio, sacarose, aminas primárias, 
glicerol 
Lowry 
Complexo metal com aminoácidos 
aromáticos 
Tampões contendo azoto e detergentes (Triton 
X-100, SDS, Lubrol, CHAPS, octil glucósido por 
exemplo) 
Bradford 
Reação do corante com o grupo amina 
da cadeia lateral dos resíduos dos 
aminoácidos 
Incompatível com surfactantes a concentrações 
rotineiramente utilizadas (causa precipitação). 
BCA 
Deteção colorimétrica do complexo 
Cu2+-ligação peptídica pelo ácido 
bicinconínico 
Aminoácidos livres (Cys, Tyr, Trp), EDTA, 
açúcares redutores, H2O2, fosfolípidos, Tween, 
aminas biogénicas 
 
https://www.google.pt/imgres?imgurl=http://animasc.com/wp-content/uploads/2011/08/pensar1.gif&imgrefurl=http://animasc.com/category/m2p/&h=303&w=320&tbnid=rGxnU8HAAFwLoM:&docid=7Dp1wFBEwk0K8M&ei=BYG8VuqYC8vjUYLKoJgE&tbm=isch&ved=0ahUKEwiqr8W93e_KAhXLcRQKHQIlCEM4ZBAzCA8oDDAM
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 1 10 
 
1.2. Quantificação do teor total de proteína pelo Método de Biureto 
Este método permite determinar a proteína total numa dada amostra e baseia-se na medição, 
por espetrofotometria de visível, do complexo proteína-cobre que se forma em soluções 
fortemente alcalinas. A reação entre o ião cobre e a proteína ocorre por coordenação de um ião 
Cu2+ a 4 átomos de azoto das ligações peptídicas, com perda de um protão de cada um dos grupos 
amida substituídos. Forma-se um complexo de cor púrpura que pode ser quantificado 
espetrofotometricamente a 540 nm. 
 
 
Estrutura Cor púrpura caraterística 
Complexo cobre-proteína 
 
Este complexo apresenta duas bandas de absorção, uma a 270 nm e outra a 540 nm. Apesar 
da banda na região de 270 nm ser muito mais intensa, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada 
para fins analíticos, porque há diversos compostos, normalmente presentes nos sistemas biológicos, 
que absorvem na região de 270 nm causando interferência no método. 
O método de Biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteína total 
em diversos meios, tais como plasma, líquido cefalorraquidiano, urina, saliva, diversos alimentos, 
etc. Este tem sido também aplicado em análises por injeção de fluxo e em estudos cinéticos. Tem a 
vantagem de utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade 
específica para diferentes proteínas. No entanto, a desvantagem deste método prende-se com o 
facto de apresentar uma gama de linearidade entre 1 e 6 mg/mL, i.e. só permitirá a quantificação 
de proteína nesta gama de concentração, sendo necessário, no caso de teores menores, optar por 
outro método (exemplo, método de Lowry, Bradford ou BCA). 
A análise quantitativa de compostos que se encontram em solução, pode ser feita através da 
espectrofotometria de ultravioleta e visível (UV-Vis), utilizando a lei de Beer-Lambert. Esta lei 
relaciona a concentração de um composto em solução, c (mol dm-3), com a sua absorvência A: 
A = ε l c 
onde l é a distância percorrida pelo feixe de luz na solução (cm) e ε é uma constante chamada 
absortividade molar (mol–1 dm3 cm–1), uma vez que tem um valor numérico igual ao da absorvência 
quando a concentração de soluto é 1 mol dm–3, para uma espessura de 1 cm de solução (cuvete de 
1 cm). 
Para a realização deste tipo de trabalho podem ser usados espetrofotómetros de feixe simples 
ou de feixe duplo. 
Para além das absorvências dos padrões e da amostra, ao comprimento de onda definido, 
regista-se também o valor da absorvência do branco (definir para cada tipo de análise o branco 
adequado). Esse valor pode depois ser subtraído ao da amostra, para o mesmo comprimento de 
onda, obtendo-se como resultado apenas o valor de absorvência do analito de interesse. 
Este trabalho tem como objetivo determinar o teor total de proteína de soluções aquosas 
usando o método do Biureto e uma curva de calibração externa de albumina, numa gama de 
concentração entre 1,0 e 6,0 mg/mL. Assim, serão preparadas soluções de albumina de 
http://www.google.pt/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIhteB6O_KAhVMXhoKHWgPBHEQjRwIBw&url=http://www.ebah.com.br/content/ABAAAgILYAE/dosagem-proteinas-pelo-metodo-biureto&bvm=bv.113943164,d.d24&psig=AFQjCNFEnYKQNxJXTxx0Vqv4sr0DXpWP5Q&ust=1455283396006513
http://it.wikipedia.org/wiki/File:Biuret_Test_2.jpg
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 1 11 
 
concentração rigorosa e lidas as respetivas Abs a 540 nm. A partir destes valores será construída a 
curva padrão, que permitirá confirmar a linearidade do método para o intervalo de concentrações 
definido. As amostras serão analisadas sob as mesmas condições dos padrões. Esta abordagem 
(curva de calibração externa) é normalmente utilizada quando os efeitos de matriz não são 
significativos. 
 
1.3. Parte Experimental 
Equipamento 
Espetrofotómetro UV/Vis 
 
Materiais 
Cuvetes de plástico Balões de diluição (20,00, 50,00 ou 100,00 mL) 
Pipetas volumétricas (1-20 mL) Copos 
Micropipetas 
 
Reagentes 
Solução-padrão: Solução aquosa de albumina de 25 mg/mL 
Reagente de Biureto (já preparado): dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6,0 g de tartarato de sódio e potássio 
em 500 ml de água destilada. Transferir quantitativamente (com água destilada) para um balão 
volumétrico de 1 L. Adicionar 300 mL de NaOH 10% (w/v). Perfazer o volume com água destilada. Adicionar 
1 g de KI (para inibir a redução do cobre durante o armazenamento). Guardar em frasco de plástico, no 
escuro. 
 
Amostras a analisar: 3 soluções aquosas de proteína. 
 
Procedimento Experimental 
A- Preparação das soluções padrão para construção da curva de calibração 
1. A partir da solução-mãe de albumina (25 mg/mL) preparar as soluções padrão de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 
e 6,0 mg/mL em balões de 20,00 mL (em função da disponibilidade de balões no laboratório, poderá 
ter que usar balões de 50,00 ou 100,00 mL). Fazer os cálculos durante a preparação prévia da aula e 
mostrar ao docente antes de iniciar o procedimento. 
 
B- Análise espetrofotométrica dos padrões e das amostras 
1. Num suporte para tubos deensaio colocar o nº suficiente de tubos de ensaio, devidamente rotulados: 
duplicados de todos os padrões (6 níveis de concentração – 6×2= 12 tubos) e amostras (3 amostras – 
3×2= 6 tubos) e rotular 1 tubo para o branco. 
2. Nos tubos de ensaio rotulados para os padrões adicionar 1,0 mL de padrão de cada concentração para 
o respetivo tubo, nos das amostras adicionar 1,0 mL de cada amostra e preparar o branco com 1,0 mL 
de água. 
3. Pode começar por preparar primeiro o branco. Usar a mesma micropipeta de 1 mL (ou pipeta 
volumétrica, dependendo do material disponível no laboratório) para o branco e todos os padrões. 
Prepará-los por ordem crescente de concentração. Passar a pipeta uma vez com a solução a medir. 
4. A cada tubo contendo os padrões, amostras e branco adicionar 5,0 mL de reagente Biureto. Agitar 
sempre após cada adição. 
5. Deixar reagir, em repouso, durante 30 min. Coordenar o trabalho entre os diferentes grupos para 
conseguir respeitar este tempo. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 1 12 
 
6. Durante este período de espera deve preparar as cuvetes e confirmar se o espectrofotómetro já está 
operacional com as condições de análise (540 nm). 
7. Medir a absorvência do conteúdo de todos os tubos 540 nm. 
Nota importante: Confirmar se os dados obtidos para todas as amostras se encontram dentro da gama de 
linearidade do método e abrangidos pela reta de calibração. Se se justificar, volte a repetir a análise das 
amostras de forma a poder quantificar o teor de proteína: eventualmente pode ter que diluir as amostras, 
tentado sempre colocá-las o mais próximo possível do centróide da reta (usar pipeta ou micropipeta e 
balão volumétrico – seguida da reação com o reagente de Biureto e leitura da Abs a 540 nm). 
 
Arrumações Finais 
- Lavar todo o material e deixá-lo a secar pendurado nos suportes. 
- Os restos de soluções e resíduos devem ser despejados nos frascos indicados para o efeito. Em 
caso de dúvida consultar sempre o docente. 
- Se partir algum material de vidro, comunique ao professor. Há recipientes próprios para 
material de vidro partido. 
 
1.4. Questionário e tratamento dos dados 
a) Justifique porque usou cuvetes de plástico para fazer as leituras de Abs a 540 nm. 
b) Para esta aula deve, se possível, trazer um computador. Introduzir os dados experimentais no 
programa de computador (Excel ou equivalente). Trace a curva de calibração, por regressão linear 
usando o método dos mínimos quadrados, usando todos os dados obtidos pelo seu grupo. O 
gráfico e os parâmetros da regressão calculados devem ser incorporados no seu caderno. Que 
apreciação faz dos seus dados? 
c) Determine a concentração de proteína nas 3 amostras. No(s) caso(s) em que foi necessário 
fazer diluição, tenha em conta o fator de diluição nos cálculos. 
d) Anote os resultados obtidos pelos outros grupos da sua turma. Apresente para cada amostra, a 
média com o respetivo intervalo de confiança. 
e) Compare os resultados com os valores que lhe serão fornecidos relativos ao teor total de 
proteína nas amostras. Comente. 
 
1.5. Bibliografia 
Amado F., Domingues P., Domingues M.R., Ferreira R., Vitorino R. (2013) Análise de proteínas – guia 
de laboratório, 1ª edição, edição 100luz, Castro Verde, Portugal, Cap 3, pp 17-28 (ISBN: 978-
989-8448-23-1). 
Okutucu B., Dınçer A., Habib Ö., Zıhnıoglu F. (2007) Comparison of five methods for determination 
of total plasma protein concentration, J. Biochem. Biophys. Methods 70, 709-711 
Walker J. (2000) Protein structure, purification and characterisation. In: Principles and techniques of 
practical biochemistry, 5th edition, Keith Wilson and John Walker Eds., Cambridge University 
Press, Cap 6, pp 312-356 (ISBN: 052165873X )
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 2 13 
 
Determinação de vitamina C em sumo de laranja por reação com 2,6-
diclorofenolindofenol seguida de análise por espetrofotometria de visível 
 
 
Conceitos a rever para a preparação da aula: 
- Lei de Beer-Lambert 
- Princípios da espetrofotometria de UV-Vis 
 
2.1. Introdução 
2.1.1. Propriedades do ácido L-ascórbico 
As vitaminas são substâncias que o organismo não tem condições de produzir e, por isso, 
têm que fazer parte da dieta. As frutas, verduras e legumes são as principais fontes de vitaminas, 
mas algumas também podem ser encontradas na carne, no leite, nos ovos e cereais. As vitaminas 
têm funções biológicas específicas no organismo humano, sendo essenciais no seu desenvolvimento 
e metabolismo. A falta delas pode causar variadas doenças, nomeadamente o raquitismo 
(enfraquecimento dos ossos pela falta da vitamina D) ou o escorbuto (falta de vitamina C). Neste 
sentido, torna-se muito importante a sua preservação durante o armazenamento e 
processamento dos alimentos, assim como a implementação de metodologias de controlo do seu 
teor nos alimentos. 
O ácido L-ascórbico (comummente designado como ácido ascórbico ou vitamina C) é 
importante para várias funções do organismo, tais como reações de hidroxilação, como por 
exemplo, na biossíntese de catecolaminas, hidroxiprolina e corticosteróides (11--hidroxilação de 
deoxicorticosterona e 17--hidroxilação de corticosterona). 
A vitamina C é uma vitamina hidrossolúvel, essencial para a síntese de colagénio e 
reparação de tecidos. Desempenha um papel significativo no metabolismo de tirosina, dos hidratos 
de carbono, do ferro, na conversão de ácido fólico em ácido folínico, na síntese de lípidos e 
proteínas, na resistência às infeções, na respiração celular e tem ainda propriedades antioxidantes. 
A eliminação das vitaminas hidrossolúveis ingeridas em quantidades fisiológicas ocorre por 
biotransformação e por excreção renal na sua forma ativa, em proporções variáveis para cada 
agente. O excesso, proporcionado por exemplo por doses farmacológicas, é eliminado pelo rim na 
sua forma ativa. 
O ácido L-ascórbico é particularmente abundante em 
vegetais frescos e frutos, principalmente em citrinos e 
morangos. Devido à grande quantidade ingerida, a batata é a 
principal fonte de vitamina C na nossa dieta. A vitamina C é 
integralmente absorvida e distribuída pelo corpo, existindo em 
concentrações mais elevadas nas glândulas adrenais e pituitária. 
A ingestão recomendada de vitamina C (mg/dia) é 
variável, dependendo de vários fatores como a idade, o estado 
de saúde do indivíduo, género, entre outros. Segundo a 
Organização Mundial de Saúde, no primeiro ano de vida (0 a 12 
meses) por exemplo, os bebés devem ingerir 20 mg por dia, enquanto os adultos dos 19 aos 50 anos, 
devem ingerir entre 75 mg (mulheres) a 90 mg por dia (homens). 
A ascorbato-oxidase, enzima presente em muitos vegetais e frutos frescos, catalisa a reação 
de oxidação do ácido L-ascórbico (L-AA) a ácido desidro-L-ascórbico (L-DHAA): 
L-AA + ½O2 → L-DHAA + H2O 
https://www.google.pt/imgres?imgurl=http://animasc.com/wp-content/uploads/2011/08/pensar1.gif&imgrefurl=http://animasc.com/category/m2p/&h=303&w=320&tbnid=rGxnU8HAAFwLoM:&docid=7Dp1wFBEwk0K8M&ei=BYG8VuqYC8vjUYLKoJgE&tbm=isch&ved=0ahUKEwiqr8W93e_KAhXLcRQKHQIlCEM4ZBAzCA8oDD
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 2 14 
 
Esta reação de oxidação depende de alguns parâmetros tais como a pressão parcial de 
oxigénio, pH (do qual também depende a absorção no UV - Tabela 7.1), temperatura e a presença 
de iões de metais pesados (a oxidação catalisada por metais tem uma velocidade superior à auto-
oxidação espontânea não catalisada). Quantidades vestigiais de iões de metais pesados, 
particularmente Cu2+ e Fe3+, originam perdas elevadas de ácido L-ascórbico. 
 
Tabela 2.1. Efeito do pH na absorção máxima em UV do ácido L-ascórbico. 
pH máx. (nm) 
2 244 
6 - 10 266 
> 10 294 
 
A oxidação é, em geral, irreversível porque o L-DHAA é muito instável; o anel lactona abre e 
forma o ácido 2,3-diceto-L-gulónico, que por sua vez é degradado. Alguns dos produtos formados 
podem polimerizar, originando compostos castanhos, que provocam o escurecimento dos 
alimentos.A vitamina C é usada como aditivo (antioxidante) em diversos alimentos. Uma das suas 
funções como antioxidante é precisamente evitar reações de escurecimento, provocadas, por 
exemplo, por polimerização de o-quinonas com formação de pigmentos castanhos; o ácido L-
ascórbico reage com as quinonas (reduzindo-as a fenóis) evitando assim a sua polimerização. 
 
2.1.2. Determinação do ácido L-ascórbico por reação com o 2,6-diclorofenolindofenol 
O ácido L-ascórbico (L-AA) reduz o 2,6-diclorofenolindofenol (DFIF), cuja forma oxidada é 
rosa, em meio ácido, e a forma reduzida é incolor. O ácido ascórbico, por sua vez, é oxidado a ácido 
desidro-L-ascórbico (L-DHAA): 
 
L-AA + DFIFoxidado → L-DHAA + DFIFreduzido 
 
DFIF
oxidado
 - forma oxidada de 2,6-diclorofenolindofenol 
DFIF
reduzido
 - forma reduzida de 2,6-diclorofenolindofenol 
 
Se se adicionar DFIF em excesso a uma solução contendo ácido ascórbico, a quantidade de 
DFIF que reage é diretamente proporcional à quantidade de ácido ascórbico presente 
inicialmente. A determinação da quantidade de DFIF que reage é determinada por diferença entre 
a quantidade total adicionada e a quantidade que permanece na forma oxidada. Esta determinação 
é feita por espectrofotometria de visível. Assim, faz-se reagir uma quantidade conhecida de ácido 
ascórbico com uma quantidade também conhecida de DFIF, em excesso. Após 15 segundos, lê-se a 
absorvência da solução, que é proporcional à quantidade de DFIF que não reagiu (forma oxidada), 
e obtida através da absorvência ANR. Se AT for a absorvência correspondente ao DFIF total 
adicionado, então a quantidade de DFIF que reagiu, AR, é obtida por AT - ANR = AR 
Tanto a vitamina C (L-AA) como a forma parcialmente oxidada (L-DHAA) têm propriedades 
vitamínicas. O modelo de análise com DFIF só determina a forma reduzida, sendo por isso um 
método adequado para a análise em frutos ou em extratos vegetais não submetidos a tratamentos 
térmicos, já que nestes casos o ácido ascórbico está todo nesta forma (L-AA). 
 
 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 2 15 
 
2.2. Objetivos do trabalho 
Este trabalho tem como objetivo a determinação do teor de ácido L-ascórbico em sumos por 
reação com o 2,6-diclorofenolindofenol, seguido de avaliação espectrofotométrica na zona do 
visível. Tendo em consideração a informação nutricional disponível nos rótulos de alguns produtos 
comerciais, pretende-se que o estudante tenha a capacidade de definir as condições adequadas de 
preparação de várias amostras, nomeadamente o fator de diluição. 
 
2.3. Parte Experimental 
 
Equipamentos 
Espetrofotómetro UV/Vis, Agitador Vortex, Cronómetro 
Materiais 
Micropipetas (volumes diversos) Tubos de ensaio 
Balões volumétricos de 20,00 e 100,00 mL Células para leitura de Abs540 
Copos de 100 mL Filtros de papel (café) 
Reagentes 
Solução de ácido oxálico 0,4% (m/v) - (já preparada) 
Solução de 2,6-diclorofenolindofenol 36 mg/L - esta solução é estável durante 2 a 3 semanas (se 
for guardada em frigorífico) - (já preparada) 
Solução padrão-mãe de L-ácido ascórbico 0,100% (m/v) em ácido oxálico 0,4% - (já preparada) 
 
Procedimento Experimental 
2.3.1. Preparação das amostras: filtração e/ou diluição 
1. Medir 5,00 mL de sumo, armazenado à temperatura ambiente, para um balão volumétrico de 
50,00 mL. Completar o volume com ácido oxálico 0,4%. Tapar e agitar muito bem 
2. Filtrar por um filtro de café e recolher o filtrado num copo. Depois de filtrar, homogeneizar o 
filtrado. 
3. Seguidamente, diluir o filtrado para que os valores de absorvência se ajustem à curva de 
calibração que irá preparar na secção seguinte (se algum dos sumos for muito viscoso, fazer 
uma diluição logo nom ponto 1. para facilitar a filtração). Para delinear esta parte do trabalho, 
tenha em consideração que normalmente para amostras com teores de ácido ascórbico entre 
10 a 40 mg/100 mL, deve diluir o filtrado 2 vezes. Assim, ter em atenção o teor de ácido 
ascórbico indicado no rótulo de cada uma das 3 amostras a analisar. Esta informação é 
fundamental para decidir se deve ou não diluir as amostras e estimar o fator de diluição. 
 
2.3.2. Determinação do teor de ácido ascórbico 
1. Comece por preparar os padrões de ácido ascórbico de concentrações 5, 10, 20, 30, 40, 60 e 80 
ppm (1 ppm = 1 µg/mL) a partir da solução padrão-mãe, em ácido oxálico 0,4%, e usando balões 
volumétricos de 20,00 mL. Faça os cálculos durante a preparação prévia da aula e mostre ao 
docente antes de iniciar o procedimento. 
2. Seguidamente prepare em tubos de ensaio os padrões (P), as amostras (A), a referência e o 
branco, segundo o esquema que se segue: 
Designação Composição de cada tubo 
Referência 1,0 mL de ácido oxálico 0,4% + 9,0 mL de água 
P 0, 1, 2, ..., 6 1,0 mL padrão (0, 5, 10, 20, 30, 40, 60 e 80 ppm) + 9,0 mL de DFIF 
A 1, 2, 3 1,0 mL amostra + 9,0 mL de DFIF 
B 1,0 mL de ácido oxálico 0,4% + 9,0 mL de DFIF 
P- padrão; B- branco; A- amostra 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 2 16 
 
Preparar duplicados para os padrões e para as amostras. Selecionar o comprimento de onda de 
trabalho (comprimento de onda correspondente ao máximo da absorvência ~ 540 nm). 
3. Calibrar o espetrofotómetro com a referência (tubo com 1,0 mL de ácido oxálico e 9,0 mL de 
água, faz-se auto-zero, isto é, Abs=0,000). 
4. Adicionar ao tubo P1 (que já contem 1,0 mL da solução padrão 1) 9,0 mL de DFIF. Tape e agite 
no Vortex imediatamente. Esta parte do trabalho deve ser realizada junto ao 
espectrofotómetro. Ler a absorvência de imediato e registar os valores obtidos numa tabela 
previamente preparada. 
5. Repetir o passo 4. para todos os padrões e amostras. 
Nota: Antes de dar por terminado este ponto, confirme que as absorvências obtidas para as 
amostras se encontram dentro da zona linear da curva de calibração. Caso se justifique tem que 
voltar a analisar as amostras após uma diluição adequada. 
 
A espécie que está a absorver nos casos anteriores é o reagente DFIF que não reagiu com o L-
ácido ascórbico. Se se subtrair ANR de AT (absorvência correspondente ao DFIF total adicionado, 
branco -B), obtêm-se os valores correspondentes ao DFIF que reagiu com L-ácido ascórbico. 
 
Arrumações Finais 
- Lavar todo o material e deixá-lo a secar pendurado nos suportes. 
- Os restos de soluções e resíduos devem ser despejados nos frascos indicados para o efeito. Em 
caso de dúvida consultar sempre o docente. 
 
2.4. Questionário 
a) Para esta aula deve, se possível, trazer um computador. Introduzir os dados experimentais no 
programa de computador (Excel ou equivalente). A tabela com os dados e gráfico da curva de 
calibração devem ser incorporados no seu caderno. 
b) Traçar a curva de calibração por regressão linear usando todos os dados obtidos pelo seu grupo. 
O gráfico e os parâmetros da regressão calculados devem ser incorporados no seu caderno. 
c) Determinar a concentração de ácido ascórbico em cada uma das 3 amostras e expressar os 
resultados em mg/100 mL e em U.I. de vitamina C/100 mL (1 U.I. de vitamina C é igual a 50 g 
de ácido L-ascórbico). 
d) Comparar os resultados obtidos com os valores indicados nos respetivos rótulos e fazer uma 
apreciação crítica em relação ao trabalho realizado. 
 
2.5. Bibliografia 
Belitz, H.-D., Grosch, W., Schieberle, P. (2004) Food Chemistry, 3rd edition, Springer-Verlag Berlin 
Heidelberg, Alemanha, Cap.6, pp. 409-426 (ISBN: 3-540-40818-5). 
David N. Bailey, D. N. (1974) The determination of ascorbic acid: A quantitative analysis experiment, 
J. Chem. Educ., 51 (7), p 488 (DOI: 10.1021/ed051p488). 
Oliveira, R. G., Godoy, H. T., Prado, M. A. (2010) Otimização de metodologia colorimétrica para a 
determinação de ácido ascórbico em geleias de frutas (Optimization of a colorimetric method 
to determine ascorbic acids in fruit jelly), Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(1): 244-249 
(ISSN 0101-2061 
 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 17 
 
Extração de lípidos de um alimentoe análise por TLC 
 
 
Conceitos a rever para a preparação da aula: 
- Conceito de lípidos 
- Cromatografia em camada fina (TLC) 
 
3.1. Introdução 
3.1.1. Considerações gerais sobre lípidos 
Os lípidos são um dos principais grupos de biomoléculas existentes na natureza e, de uma 
forma geral, são caracterizados pela sua baixa solubilidade em água e noutros solventes orgânicos 
polares e elevada solubilidade em solventes apolares. As suas propriedades físicas estão 
relacionadas com a natureza hidrofóbica das suas estruturas. No esquema seguinte estão 
representados alguns exemplos de lípidos que, apesar de apresentarem estruturas muito diferentes 
(o que revela a grande diversidade de estruturas químicas desta família de compostos), têm em 
comum características de hidrofobicidade. 
Fosfatidilcolina 
 
 
 
 
 
Colesterol 
 
 
Ácido palmítico (Ácido hexadecanóico C16:0) 
 
Os lípidos apresentam inúmeras funções biológicas as quais estão relacionadas com as suas 
propriedades físico-químicas. Por exemplo, pelo facto de apresentarem um caráter relativamente 
apolar, os lípidos são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o 
meio extracelular, francamente hidrofílicos. Esta propriedade é muito importante na organização 
de processos biológicos em organismos vivos. Os lípidos encontram-se distribuídos em todos os 
tecidos, principalmente nas membranas celulares e nos adipócitos. 
-
P
ar
te
 h
id
ro
fí
lic
a
P
ar
te
 h
id
ro
fó
b
ic
a
Fosfato
Glicerol
Ácidos 
gordosLigação 
duplaH
https://www.google.pt/imgres?imgurl=http://animasc.com/wp-content/uploads/2011/08/pensar1.gif&imgrefurl=http://animasc.com/category/m2p/&h=303&w=320&tbnid=rGxnU8HAAFwLoM:&docid=7Dp1wFBEwk0K8M&ei=BYG8VuqYC8vjUYLKoJgE&tbm=isch&ved=0ahUKEwiqr8W93e_KAhXLcRQKHQIlCEM4ZBAzCA8oDD
https://pt.wikibooks.org/wiki/Ficheiro:Palmitic_acid_shorthand_formula.PN
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 18 
 
3.1.2. Fração lipídica do ovo 
Neste trabalho, vai ser estudado o perfil lipídico do ovo, o qual é uma importante fonte de 
proteína e de lípidos na dieta humana. O teor de lípidos do ovo completo varia entre 11 e 14%, 
consoante a espécie de ave. Por exemplo, os ovos de galinha e codorniz apresentam valores ca. 
11%, de perua 12%, de gansa 13% e 14% para o ovo de pata. O tipo de alimentação da ave também 
influencia a composição lipídica do ovo. Na Tabela 3.1 é apresentada a composição média das 
diferentes partes do ovo de galinha (Belitz et al., 2004). A gema é composta por cerca de 49% de 
água, 33% de lípidos, 17% de proteína (livetinas), glucose e sais minerais. A composição lipídica da 
gema inclui triacilgliceróis, colesterol e os seus ésteres, e fosfolípidos, como fosfatidilcolina, 
fosfatidiletanolina, lisofosfatidilcolina, entre outros. A clara do ovo apresenta quantidades 
negligenciáveis de lípidos (cerca de 0,03%). 
 
Tabela 3.1. Composição média das diferentes partes do ovo de galinha (Belitz et al., 2004). 
 
 Clara Gema Casca 
Peso médio (%) 56,9 32,8 10,3 
Matéria seca (%) 12,1 51,3 98,4 
Proteína (%) 10,6 16,6 3.3* 
Lípidos (%) 0,03 32,6 - 
Hidratos de carbono (%) 0,9 1,0 - 
Minerais (%) 0,6 1,1 95,1 
* complexo proteína mucopolissacarídeos. 
 
A indústria alimentar tem tirado partido das inúmeras propriedades estruturais e funcionais 
dos lípidos. Destas últimas realça-se o facto de terem um papel importante em algumas 
propriedades dos alimentos como por exemplo cor, viscosidade, e ainda poderem contribuir para 
as características de emulsificação, gelificação e capacidade de formação de espuma. Por exemplo, 
a fosfatidilcolina é um lípido usado como aditivo alimentar, nomeadamente como emulsificante e 
tem sido descrita como apresentando efeitos benéficos para a saúde humana, tais como, regulação 
dos níveis de colesterol. 
 
3.1.3. Caracterização da fração lipídica por cromatografia em camada fina 
A cromatografia é um método de separação, que se baseia na migração diferencial dos 
componentes de uma mistura, resultante de diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a 
fase móvel e a fase estacionária. A cromatografia em camada fina, vulgarmente designada por TLC 
(do inglês Thin Layer Chromatography), é um tipo de cromatografia usada, essencialmente, para i) 
a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, ii) para a 
purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e iii) para a separação dos 
componentes de uma mistura. Uma forma mais atual desta técnica é denominada por HPTLC (High 
Performance Thin-Layer Chromatography – Cromatografia em Camada Fina de Alta Eficiência). 
TLC é uma técnica versátil e de ampla aplicação, pois possui uma variedade de combinações 
entre fases móveis e estacionárias. Neste tipo de cromatografia a fase estacionária é, em geral, 
sólida e forma um revestimento fino sobre um suporte de alumínio, vidro ou plástico. Há vários 
tipos de sorventes que podem ser usados como fase estacionária, a mais comum é a sílica (carácter 
polar). No entanto, a escolha da fase estacionária e da fase móvel deve ser feita tendo em conta as 
características físico-químicas dos compostos a estudar. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 19 
 
A realização deste tipo de cromatografia envolve várias etapas: 
1. Preparação da amostra 
2. Aplicação da amostra 
3. Desenvolvimento 
4. Revelação 
5. Análise do cromatograma. 
 
1. A preparação da amostra depende das suas características físico-químicas. Por exemplo, 
um óleo pode ser aplicado diretamente na placa ou pode ter que ser previamente diluído para se 
obter um cromatograma com uma boa resolução (manchas bem separadas e definidas). No caso de 
amostras que contenham uma mistura complexa de várias biomoléculas, tem que se proceder à 
extração prévia da fração lipídica e em seguida faz-se a análise dessa fração por TLC. 
2. A aplicação da amostra deve ser cuidadosa de modo a evitar a destruição da fase 
estacionária. Uma pequena gota da fração lipídica é colocada sobre a fase estacionária, a cerca 1,5 
cm acima da extremidade inferior da placa (Figura 3.1). 
3. A escolha do eluente (fase móvel) é fundamental. A migração dos analitos (compostos a 
separar) depende da sua afinidade com a fase móvel e com a fase estacionária. O desenvolvimento 
do cromatograma é feito numa câmara fechada para controlo dos vários parâmetros experimentais, 
nomeadamente a composição e o grau de saturação da atmosfera em contacto com o meio 
cromatográfico e a evaporação do eluente. O eluente irá migrar na fase estacionária por efeito de 
capilaridade. 
 
 
Figura 3.1. Algumas etapas da técnica de TLC: aplicação da amostra e desenvolvimento em câmara 
de cromatografia. 
 
4. Com exceção dos casos em que os compostos são corados (caso ilustrado na Figura 3.1), 
é necessário tratar a placa de forma a possibilitar a visualização das manchas (fase da revelação). 
Existem vários reagentes que podem ser utilizados para pulverizar as placas, cujo objetivo é 
reagirem com o(s) analito(s) (compostos a separar) e revelarem a sua presença através da 
Câmara de 
cromatografia
Após desenvolvimento cromatográfico.
Neste casos os analitos em estudo 
são corados, não sendo necessária a 
fase de revelação
Após aplicação da 
amostra
Eluente Eluente
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 20 
 
observação de mancha(s) corada(s). Outra possibilidade consiste em colocar a placa de TLC numa 
câmara com cristais de iodo, uma vez que estes libertam vapores que vão permitir a coloração dos 
compostos e a sua fácil visualização. Esta é uma opção muito utilizada na revelação dos lípidos, uma 
vez que o iodo liga-se aos lípidos de forma não covalente, com exceção dos lípidos com duplas 
ligações. 
5. Finalmente, deve-se proceder à análise do cromatograma. A identificação das classes de 
compostos ou de compostos individuais é feita por comparação com padrões, tendo em conta o 
conceito de índice de retenção (Rf) (Figura 3.2).Figura 3.2. Esquema de uma placa de TLC e cálculo do parâmetro Rf. 
 
Para obter informação complementar relativamente ao TLC convencional há a possibilidade 
de desenvolvimento bidimensional, que corresponde à eluição efetuada em duas direções com 
diferentes eluentes (Figura 3.3). Quando se estudam misturas complexas de lípidos com o TLC 
unidimensional (1 eluente) ocorre a separação dos lípidos por classes ou famílias químicas. Se 
seguidamente se fizer um desenvolvimento bidimensional (2 eluentes) pode-se observar a 
separação dos componentes de cada classe de lípidos (Figura 3.3). 
 
Figura 1.3. Exemplo de TLC bidimensional. 
3.2. Objetivo do trabalho 
Neste trabalho pretende-se extrair lípidos a partir do ovo e proceder à separação e 
identificação das diferentes classes de lípidos por comparação com padrões. A extração de lípidos a 
partir de uma matriz natural baseia-se no facto de serem menos polares que a maioria dos 
componentes da célula. Podem assim ser extraídos seletivamente com solventes orgânicos 
apolares. Por recurso à cromatografia de camada fina - TLC, os lípidos podem ser separados em 
diferentes classes. A Figura 3.4 é uma representação esquemática da posição relativa de várias 
classes de lípidos obtida em condições similares às que serão utilizadas neste trabalho. 
 
a
b
Frente da fase móvel 
(eluente)
Ponto de aplicação 
(amostras e padrões)
a é distância percorrida pelo composto 
b é a distância percorrida pelo eluente
Rf = a/b
1
º 
E
lu
e
n
te
2º Eluente
Ponto de 
aplicação
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 21 
 
 
Figura 3.4. Separação de lípidos por classes usando sílica-gel como fase estacionária e uma fase 
móvel de carácter essencialmente apolar (Belitz et al., 2004). 
 
3.3. Parte Experimental 
Materiais 
Tubos de 10 mL com rosca Câmara de cromatografia 
Provetas de 50 mL Câmara de iodo 
Placa de TLC Tubos capilares 
 
Reagentes 
- Eluente: mistura de solventes (hexano: éter dietílico: ácido acético glacial, 80:20:1 em volume). A 
mistura de solventes deve ser preparada no início de cada aula. 
- Padrões de lípidos em clorofórmio (soluções já preparadas): 
2% colesterol 
2% ergosterol 
1% L-α-fosfatidilcolina de gema de ovo 
0,5% ácido palmítico (C16:0) 
0,5% ácido oleico (C18:1) 
0,5% azeite (atendendo ao seu perfil lipídico é também usado com padrão) 
- Solução de NaCl 1 M 
- Isopropanol 
- Hexano 
- Cristais de iodo 
 
Ponto de 
aplicação
fosfolípidos
ácidos gordos livres
esteróis
monoacilgliceróis
diacilgliceróis
esteróis esterificados
triacilgliceróis
Frente do 
eluente
Fase estacionária: silica-gel
Fase móvel: éter de petróleo / éter dietílico / ácido acético 
90: 10 : 1 v/v
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 22 
 
Procedimento Experimental 
 
3.3.1. Extração dos lípidos do ovo 
1. Quebre a casca de um ovo e recolha em copos diferentes a gema e a clara. Não deixe passar 
gema para a clara. 
2. Meça com uma proveta o volume da clara e o volume da gema. A cada uma destas frações 
adicione igual volume em NaCl 1 M. 
Será usado 1 ovo por turma, assim os passos 1 e 2 serão realizados apenas por um grupo, o qual 
disponibilizará as amostras aos restantes grupos para realizarem as fases seguintes. 
3. Recolha 1 mL de cada uma das misturas anteriores (gema e clara), para tubos de ensaio com 
rosca, e adicione 1,5 mL de isopropanol a cada tubo. Agitar durante alguns segundos. 
4. Adicione 1 mL de hexano a cada tubo, aperte a rosca cuidadosamente e agite bem durante alguns 
segundos. 
5. Deixe repousar 1 minuto. 
6. De seguida use a fase orgânica que contém a fração lipídica (parte superior, uma vez que o hexano 
tem uma densidade inferior à água) para aplicação na placa de TLC. 
 
3.3.2. Preparação e aplicação das amostras na placa de TLC 
1. Marcar a lápis a linha de base (ponto de aplicação) na placa de TLC (~1,5 cm da base). 
2. Tendo o cuidado de registar a ordem de aplicação na própria placa (abaixo do ponto de aplicação), 
aplicar com tubos capilares, 2 a 3 gotas de (soprar para secar mais rapidamente. Deixar secar 
entre a aplicação de cada gota do mesmo tipo de amostra ou padrão): 
- azeite virgem diluído em clorofórmio (gordura vegetal), 
- soluções com padrões de lípidos, 
- amostras de gema e de clara diluídas (obtidas na fase 3.1 do protocolo). 
Seguir o esquema abaixo representado. 
 
 
 
Legenda: 
Marcar com uma letra ou número 
correspondente a cada padrão e amostra, 
como por exemplo: 
 
A - colesterol 
B - ergosterol 
C - L-α-fosfatidilcolina 
D - ácido palmítico (C16:0) 
E - ácido oleico (C18:1) 
F - azeite 
G - gema (diluída 2x) 
H - clara (diluída 2x) 
 
 
3.3.3. Desenvolvimento cromatográfico (a realizar na hotte) 
1. Colocar o eluente (fase móvel) na câmara de cromatografia até obter um máximo de 1 cm de 
altura da mistura de solventes. Esta câmara será usada por todos os grupos. 
2. Colocar cuidadosamente a placa na câmara de cromatografia já com a fase móvel. 
3. Fechar a tampa e deixar desenvolver durante ± 30 minutos (tempo ao fim do qual o solvente deve 
ter percorrido 3/4 da altura da placa de TLC). Aconselha-se a observação regular da placa para 
A B C D E F G H
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 23 
 
garantir que esta fase está a decorrer conforme previsto. No caso de se colocarem várias placas 
em simultâneo na câmara, deve confirmar que estas se mantêm afastadas umas das outras. 
 
3.3.4. Revelação das bandas correspondentes aos lípidos (a realizar na hotte) 
1. Remover a placa da câmara de cromatografia, marcar imediatamente a frente do eluente e deixar 
secar alguns minutos à temperatura ambiente. 
2. Colocar a placa numa câmara contendo cristais de iodo. Fechar a câmara. 
3. Deixar na hotte durante o tempo suficiente para observar bem as manchas (±10 a 15 minutos). 
Aconselha-se que acompanhe constantemente esta fase de revelação, pois se a placa ficar 
demasiado tempo na câmara de iodo, ficará castanha escura, o que irá dificultar a identificação 
da posição das várias manchas. 
4. Remover a placa e marcar a posição das bandas com o lápis (o que deve ser efetuado com alguma 
rapidez, uma vez que as bandas desaparecem assim que o iodo evapora). Caso seja necessário 
fazer alguma confirmação pode voltar a colocar a placa na câmara com cristais de iodo. 
 
Arrumações Finais 
- Lavar todo o material e deixá-lo a secar pendurado nos suportes. 
- Os restos de soluções e resíduos devem ser despejados nos frascos indicados para o efeito. Em 
caso de dúvida consultar sempre o docente. 
 
3.4. Questionário 
a) Preparação prévia: pesquisar informação sobre as principais classes de lípidos do azeite. Para as 
condições de estudo que irá efetuar, estime a sua posição relativa no cromatograma. 
b) Prepare uma tabela em Excel (ou software equivalente) com as distâncias percorridas por cada 
padrão e pelas manchas correspondentes aos componentes das amostras, assim como a 
distância correspondente à frente do eluente. Calcular os Rf correspondentes aos padrões e 
componentes das amostras. 
c) Identifique as classes de lípidos ou lípidos individuais identificados na gema e na clara do ovo, 
com base nos padrões utilizados (incluindo o azeite). 
d) Comente a resolução cromatográfica do cromatograma obtido. 
e) Que procedimento poderia realizar de seguida para obter informação mais detalhada sobre os 
componentes das diversas classes de lípidos identificadas no TLC para a gema? Justifique 
detalhadamente o procedimento que proporia (fase estacionária, eluente, análise do 
cromatograma, etc. …) 
 
3.5. Bibliografia 
Belitz H.-D., Grosch W., Schieberle P. (2004) Food Chemistry, 3rd edition, Springer-Verlag Berlin 
Heidelberg, Alemanha, Cap.11, pp. 551-565 (ISBN: 3-540-40818-5). 
Ramesh B., Adkar S.S., Prabhudesai A.V., Viswanathan C.V. (1979) Journal of the American Oil 
Chemists Society, 56, 585-587. 
Zaima N., Goto-Inoue N., Adach, K., Setou M. (2011) Selective Analysis of Lipids by Thin-Layer 
Chromatography BlotMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass 
Spectrometry, Journal of Oleo Science, 60, 93-98. 
Fuchsa B., Süßa R., Teubera K., Eibischa M., Schiller J. (2011) Review: Lipid analysis by thin-layer 
chromatography—A review of the current state, Journal of Chromatography A, 1218, 2754-
2774. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 24 
 
Cromatografia de exclusão molecular. Troca de tampão de uma solução de 
proteína 
 
 
Conceitos a rever para a preparação da aula: 
- Métodos colorimétricos (espectrofotometria de UV-Vis) 
- Conceito de cromatografia 
 
4.1. Introdução à cromatografia de exclusão molecular 
4.1.1. Conceitos gerais 
A cromatografia é definida como uma técnica de separação de componentes de uma amostra 
pela sua distribuição entre uma fase móvel e uma fase estacionária. Atualmente existem inúmeros 
dispositivos e configurações desenhadas para a realização de processos cromatográficos, em uma 
ou duas dimensões, ou por combinação de diferentes tipos de técnicas. De entre estas destaca-se a 
cromatografia de exclusão molecular (do inglês, Size Exclusion Chromatography - SEC), também 
conhecida por cromatografia de filtração em gel, que é uma técnica muito usada na análise e 
purificação de proteínas e de outras macromoléculas. 
A cromatografia de exclusão molecular consiste na separação dos constituintes de uma 
solução por efeito crivo. Isto é, as moléculas são separadas em função das suas dimensões (do seu 
volume hidrodinâmico), uma vez que a fase estacionária (matriz ou resina) tem poros que permitem 
ou dificultam a entrada das moléculas a separar. Assim, as moléculas de menor tamanho ficam 
retidas nos poros e percorrem um percurso maior, sendo as maiores as primeiras a sair (Figura 4.1). 
Em condições ideais é o volume hidrodinâmico que determina o fracionamento das moléculas, não 
havendo qualquer interação de outra ordem com a matriz. 
A cromatografia de exclusão molecular é realizada em coluna, na qual há a considerar: 
i) Fase estacionária - a matriz do gel. 
ii) Fase líquida móvel - usualmente aquosa, contida nos poros da matriz e no volume 
circundante exterior ao gel. 
O gel é empacotado de modo a formar um leito de separação e apresenta poros numa gama 
de tamanhos bem definida. A solução-amostra contendo as moléculas a separar é aplicada no topo 
da coluna; assim que a amostra entra completamente no gel faz-se passar um fluxo contínuo de 
eluente. As moléculas da amostra arrastadas pelo eluente movem-se ao longo do leito no sentido 
descendente. 
 
Podem-se observar 3 situações: 
1. As moléculas que são mais pequenas que 
os poros do gel podem penetrar em todos 
os poros. 
2. As moléculas com dimensão (volume 
molecular) idêntica à dos poros, penetram 
mais dificilmente nos poros. 
3. As moléculas maiores que os poros, não 
penetram no gel, ficando confinadas à fase 
móvel e são as primeiras a ser eluídas. 
 
Moléculas pequenas 
penetram nos poros 
da fase estacionária
Moléculas grandes 
são excluídas
https://www.google.pt/imgres?imgurl=http://animasc.com/wp-content/uploads/2011/08/pensar1.gif&imgrefurl=http://animasc.com/category/m2p/&h=303&w=320&tbnid=rGxnU8HAAFwLoM:&docid=7Dp1wFBEwk0K8M&ei=BYG8VuqYC8vjUYLKoJgE&tbm=isch&ved=0ahUKEwiqr8W93e_KAhXLcRQKHQIlCEM4ZBAzCA8oDDAM
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 25 
 
Os solutos eluem da coluna por ordem decrescente do seu tamanho - as moléculas maiores 
primeiro, seguidas das mais pequenas (Figura 4.1) – as moléculas maiores que os poros são eluídas 
ao mesmo tempo, independentemente do seu tamanho. 
 
Figura 4.1. Ilustração esquemática da cromatografia de exclusão molecular. 
(a) Um leito de gel formado pela matriz do gel (linhas onduladas) que contém um espaço de solvente interno. As 
moléculas mais pequenas podem entrar livremente no espaço do solvente interno do leito de gel. Moléculas maiores 
são demasiado grandes para entrar nos poros do gel. (b) A solução amostra começa a entrar na coluna de gel (os poros 
de gel são agora representados por círculos). (c) As moléculas mais pequenas entram livremente no gel e 
consequentemente migram através da coluna mais lentamente que as moléculas maiores, que são excluídas do gel. (d) 
As moléculas maiores emergem da coluna e são recolhidas separadas das mais pequenas, que necessitam de solvente 
adicional para emergirem da coluna. (e) Diagrama de eluição, ou cromatograma, indicando a separação completa dos 
dois componentes, com o componente de maior peso molecular a eluir primeiro. 
 
O peso molecular (PM) da molécula mais pequena que não entra nos poros de um gel permite 
definir o limite de exclusão do gel (LE). O volume total de uma coluna de gel (VT) é a soma do volume 
da matriz de gel (Vg), do volume de eluente dentro das partículas de gel (Vi) e do volume de eluente 
fora das partículas de gel (Vo). 
VT = Vg + Vi + Vo 
 
Vo é conhecido por volume morto e é igual ao volume de eluição de moléculas que são 
completamente excluídas das partículas de gel, por serem maiores que os poros maiores (PM > LE). 
O volume de eluição de um soluto, Ve , é o volume de eluente necessário para eluir esse soluto 
da coluna, a partir do momento em que ele entra em contacto com o gel. 
Ve = Vo + Kd Vi 
 
Kd é o coeficiente de distribuição (entre a fase estacionária e a fase móvel) e representa a 
fração de Vi que é acessível a um dado soluto. É independente da geometria da coluna e depende, 
para um dado gel, do tamanho e forma das moléculas do soluto. 
Da equação anterior vem: 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 26 
 
Kd = (Ve - Vo) / Vi 
 
Se o soluto é completamente excluído do gel (PM = LE) 
 Kd = 0; Ve = Vo, isto é, o soluto é eluído no volume morto. 
Se o soluto tem acesso a todos os poros: 
 Kd = 1; Ve = Vo + Vi. 
 
Kd está compreendido entre 0 e 1 e, num determinado gel, é tanto maior, quanto menor for o 
peso molecular do soluto - base da cromatografia de exclusão molecular. 
Se Kd >1, houve adsorção do soluto ao gel, provocada por exemplo, por interações iónicas. O 
comportamento de um determinado soluto num dado gel pode ser expresso pelo volume de eluição 
relativo (Vr = Ve / Vo), que é independente da coluna usada. 
 
A cromatografia de exclusão molecular tem uma vasta gama de aplicações, sendo 
frequentemente usada como o primeiro passo de um processo de purificação para separar 
moléculas de interesse de outras que tenham caraterísticas (tamanho) muito diferentes. Também 
pode ser empregue para mudar o tampão ou para retirar o sal de uma amostra, como por exemplo, 
a remoção de sal em amostras contendo proteínas precipitadas por salting-out, sendo um processo 
menos moroso que a diálise. A cromatografia de exclusão molecular também pode ser usada para 
determinar parâmetros moleculares como o raio hidrodinâmico e o peso molecular, o que é 
conseguido usando, por exemplo, moléculas de peso molecular bem conhecido e traçando uma 
curva de calibração. Os conceitos anteriormente enunciados podem ser facilmente compreendidos 
considerando as seguintes aplicações: 
i) Troca de tampão- As moléculas do sal têm acesso a todos os poros (Kd = 1) e as 
macromoléculas são excluídas (Kd = 0). Há assim uma boa separação entre o sal e a proteína. A 
proteína elui arrastada pelo eluente, o novo tampão. É um método mais rápido que a diálise. 
ii) Dessalinização de soluções de macromoléculas- É, digamos, o caso i, em que o eluente é 
água (ou, mais raramente, outro solvente, não salino). 
iii) Separação de misturas contendo várias macromoléculas de diferentes pesos moleculares- 
Moléculas de diferentes tamanhos entram em menos ou mais poros percorrendo assim trajetos 
menores ou maiores até atingirem a base da coluna (0 ≤ Kd = 1). 
iv) Determinação do peso molecular de macromoléculas- Para a calibração usa-se um 
conjunto de macromoléculas de peso molecular conhecido. Há uma relação linear entre o volume 
de eluição relativo (Ve / Vo) de uma substância e o logaritmo do seu peso molecular. 
 
4.1.2.Parâmetros que condicionam o processo cromatográfico 
Para se conseguir uma boa resolução cromatográfica (a resolução de uma coluna mede a sua 
capacidade de separação) é fundamental ter em conta o tipo de gel (matriz), o eluente, o 
comprimento da coluna, o volume da amostra e a qualidade de enchimento da coluna. 
i) Amostra 
O volume de amostra condiciona a escolha das dimensões da coluna a utilizar. A viscosidade 
da amostra não deve ser demasiado elevada para não provocar problemas de instabilidade 
hidrodinâmica. É a viscosidade que determina o limite máximo da concentração da amostra. 
ii) Coluna 
O modo como o gel é empacotado é determinante para o adequado funcionamento de uma 
coluna de exclusão molecular. O empacotamento deve ser regular, de modo a que a densidade do 
gel seja homogénea e a que não se observem bolhas de ar na coluna (o eluente deve ser 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 27 
 
desgaseificado). O comprimento da coluna de gel (l) afeta a resolução cromatográfica, que é 
proporcional a (l), assim como o tempo de eluição. O volume da coluna está relacionado com a sua 
capacidade de carga e é escolhido de acordo com o volume de amostra. 
iii) Eluente 
A composição do eluente deve ser escolhida de modo a não interferir no processo de 
separação. Há que ter cuidado com a escolha do pH, de modo a garantir que i) se mantenha a 
estabilidade e a atividade biológica dos componentes da amostra e ii) que não ocorram 
precipitações. A precipitação dos componentes da amostra na coluna pode provocar um bloqueio 
irreversível. Além disso, para evitar interações iónicas (indesejáveis) entre os solutos e a matriz do 
gel, a força iónica é em geral mantida a cerca de 0,15 mol/L. 
iv) Escolha do gel 
Neste trabalho será usado gel de Sephadex, tipo G, constituído por dextrana (um 
polissacarídeo de α-D-glucose em ligação 1,6, de elevado peso molecular) entrecruzado com 
epicloro-hidrina, de modo a formar uma rede tridimensional. A porosidade dos géis de Sephadex é 
controlada pelo peso molecular da dextrana usada e pela quantidade de epicloro-hidrina que 
entrecruza os grupos hidroxilo das unidades de glucose. Há assim vários géis com diferentes gamas 
de fracionamento. A escolha do tipo de Sephadex é feita em função do tamanho das moléculas a 
separar (Tabela 4.1). Por exemplo, considerando os analitos objeto de estudo do presente trabalho 
laboratorial (hemoglobina e fosfato de sódio), sabe-se que se se usar o gel Sephadex G-75, a 
hemoglobina, de peso molecular 64500 Da, entrará em alguns poros e não entrará noutros (0 < Kd 
< 1). Se se usar Sephadex G-10, G-15, G-25 ou G-50, a hemoglobina será completamente excluída 
(Ve = Vo) enquanto o fosfato de sódio pode entrar em todos os poros (Kd = 1). 
 
Tabela 4.1. Gamas de fracionamento de alguns géis de exclusão molecular. 
Tipo de Gel Gama de Fracionamento de 
Proteínas (kDa) 
Sephadex G- 10 > 0,7 
Sephadex G- 15 > 1,5 
Sephadex G- 25 1 - 5 
Sephadex G- 50 1,5 - 30 
Sephadex G- 75 3 – 80 
Sephadex G- 100 4 - 150 
Sephadex G- 150 5 - 300 
Sephadex G- 200 5 - 600 
 
4.1.3. Metodologias para monitorização dos analitos objeto de estudo - Condutimetria 
Para a realização do presente trabalho laboratorial serão realizadas medições de absorvência 
e de condutividade para monitorizar a hemoglobina e o fosfato de sódio, respetivamente. De 
seguida serão apresentados alguns conceitos relacionados com a condutimetria (método de análise 
de iões que se baseia na medida da condutividade elétrica de uma solução). 
Quando se aplica uma diferença de potencial entre dois elétrodos imersos numa solução de 
um eletrólito, os iões dissolvidos migram para os elétrodos: os catiões migram para o elétrodo 
negativo e os aniões para o elétrodo positivo. Esta migração de iões constitui o fluxo de corrente 
elétrica através da solução. A intensidade da corrente depende do número de iões que se movem, 
da sua carga e da sua velocidade. A condutividade elétrica de uma solução depende da 
concentração e da natureza das várias espécies iónicas presentes. Por exemplo, uma solução de 
fosfato de sódio 1 mol/L conduz melhor a corrente elétrica - tem maior condutividade - que uma 
solução 0,1 mol/L em fosfato de sódio, pois a solução mais concentrada contém um maior número 
de iões por unidade de volume. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 28 
 
Para medir a condutividade elétrica de uma solução mergulha-se nela uma célula 
condutimétrica, que consiste em dois elétrodos de um metal inerte, em geral platina, de igual 
tamanho e forma, colocados paralelamente um ao outro. Nestas condições, entre os dois elétrodos 
fica uma coluna de líquido e a resistência elétrica (R) será função das dimensões dessa coluna, da 
natureza da solução e da temperatura. A resistência de uma coluna de solução de secção 
transversal uniforme, com área A (cm2), entre dois elétrodos distanciados de d (cm) é dada por: 
 R=  d/A 
A constante de proporcionalidade () é a resistência específica ou resistividade. À grandeza 
d/A chama-se constante da célula. Para este trabalho ela não precisa de ser conhecida; basta apenas 
que não varie no decorrer das medições. 
A condutividade, L, é o inverso da resistência e é expressa em ohm-1 (ou siemens, S). 
 L = 1/R = 1/  A/d = K  A/d 
K é o inverso da resistência específica e denomina-se condutividade específica; é função da 
concentração, Ci, de cada ião e da condutividade equivalente (i), uma constante característica de 
cada ião que depende da sua carga, tamanho e velocidade. A condutividade específica é 
proporcional a  Ci i,. A condutividade específica da água pura é 510-8 ohm-1 cm-1. Neste trabalho 
será monitorizada a eluição do fosfato de sódio por medição da condutividade do eluato. Nas 
frações que contêm o sal é expectável que a condutividade seja mais elevada. 
 
4.2. Objetivo do trabalho 
Neste trabalho parte-se de uma solução de hemoglobina em tampão fosfato e pretende-se 
obtê-la dissolvida em solução de tampão Tris (tris-hidroximetilaminometano)-HCl (pH 8,5). Trata-
se, portanto, do caso i) referido anteriormente - troca de tampão de uma solução de proteína. Dada 
a grande diferença de tamanho entre as moléculas de hemoglobina e do fosfato de sódio, a 
cromatografia de exclusão molecular deverá ser particularmente eficiente na troca de tampão da 
solução de hemoglobina. A hemoglobina apresenta uma massa molecular de 64500 Da. Se o gel 
tiver um limite de exclusão inferior a este valor, a proteína é completamente excluída e elui mais 
rapidamente do que se se usar uma matriz para a qual Kd > 0. Assim sendo, a forma mais rápida de 
trocar o solvente fosfato por Tris-HCl será fazer passar a solução por uma coluna de exclusão 
molecular com poros de dimensão tal que excluam completamente as moléculas de proteína, e 
usando Tris-HCl como eluente. O limite de exclusão do gel deverá ser inferior a 64500 Da. As 
moléculas de fosfato de sódio, muito mais pequenas, entram nos poros e são retardadas em relação 
às de proteína. 
Os resultados de uma cromatografia de exclusão molecular são em geral expressos na forma 
de um diagrama de eluição, i. e. cromatograma, em que no eixo das abcissas é representado o tempo 
ou volume de eluição e no das ordenadas a intensidade do sinal associado aos componentes da 
amostra (por exemplo absorvência e condutividade) (Figura 2.2). A deteção de proteínas é 
geralmente efetuada por medição do valor da absorvência a 280 nm. No caso do trabalho 
laboratorial que vai realizar, o facto de a hemoglobina ser corada permite que esta seja detetada na 
zona do espectro visível da luz. Assim, o fosfato é detetado por medição da condutividade do 
eluato e a hemoglobina pela determinação da absorvência a 540 nm. 
 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 29 
 
 
Figura 4.2. Comatograma típico obtido por cromatografia de exclusão molecular, com deteção por 
Abs a 280 nm (proteína) e condutividade (sal). Vo - volume morto; VT - volume total da coluna 
(Handbooksfrom GE Healthcare Life Sciences - www.gelifesciences.com/handbooks). 
 
 
4.3. Parte Experimental 
Equipamentos 
Espetrofotómetro UV/Vis Condutivímetro 
 
Materiais 
Coluna de vidro Tubos de ensaio 
Cuvetes Pipetas de Pasteur 
Copos de 50 mL Suporte de coluna e garras 
 
 
Reagentes 
Sephadex G-50 (1,5 – 30 kDa) ; 
Solução de hemoglobina em tampão fosfato, 5mg/mL; 
Tampão Tris (tris-hidroximetilaminometano)-HCl (pH 8,5), 10 mM. 
 
Procedimento Experimental 
 
4.3.1. Preparação do gel (por limitações de tempo esta fase não se faz na aula) 
1. O Sephadex é fornecido em forma de pó seco e deve ser posto a hidratar em excesso de 
solvente. Nesta operação deve evitar-se agitação excessiva e nunca se devem usar agitadores 
magnéticos, para não danificar o gel. Este processo é demorado (3h para G-10, G-15, G-25 e G-
50, 24 h para G-75 e 72h para os restantes), mas pode acelerar-se usando um banho de água 
em ebulição (1 a 5h), o que tem a vantagem adicional de desarejar o eluente. 
http://www.gelifesciences.com/handbooks
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 30 
 
2. O gel que vai ser usado neste trabalho já foi sujeito a este tratamento e está em suspensão em 
solução Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. 
3. Decantar para um copo limpo, seco e rotulado, uma parte do líquido sobre o gel, de modo a ficar 
com uma suspensão relativamente compacta, mas ligeiramente fluida. Agitar ligeiramente, sem 
vareta, para não danificar os poros. 
 
4.3.2. Empacotamento da coluna 
1. Montar a coluna num suporte, em posição vertical. 
2. Fechar a torneira da coluna. 
3. Num copo rotulado colocar eluente e uma pipeta 
Pasteur com a respetiva tetina. 
4. Adicionar a suspensão de gel toda de uma vez ao 
longo das paredes da coluna, com ajuda de uma 
vareta. 
5. Abrir ligeiramente a torneira. 
6. Recolher o eluente para um copo. 
7. Se necessário, adicionar eluente com uma pipeta 
Pasteur, de modo a manter sempre uma coluna de 
líquido sobre o gel (NUNCA DEIXAR SECAR O TOPO 
DA COLUNA). 
Quando todo o gel estiver sedimentado (cerca de 15 
cm), fechar a torneira. 
 
 
4.3.3. Acondicionamento da coluna 
1. Quando se aplica a amostra, as condições experimentais na coluna devem ser as condições de 
eluição. Em todo o leito, a fase móvel deve ser o eluente. Deve, pois, fazer-se o que se chama o 
acondicionamento da coluna, i.e., faz-se passar em contínuo um volume de eluente equivalente 
a 2 ou 3 volumes da coluna. Neste caso, porém, por uma questão de tempo e tendo em vista 
que o gel já está em suspensão no eluente, faz-se passar apenas um volume de eluente 
correspondente ao volume de coluna. Estimar previamente o volume da coluna. 
2. Manter o nível do eluente sempre no topo da coluna até ter eluído quase todo o volume 
pretendido. Nessa altura, parar a adição de eluente e deixá-lo correr até ca. 1 cm acima do nível 
superior do gel. Fechar a torneira. 
3. Guardar esta fração de eluente que passou pela coluna. Ler a condutividade e Abs 540 nm. 
Estes valores serão usados como os valores de referência e darão indicação sobre o momento 
em que deve ser terminada a cromatografia, i.e., em que já foram eluídos completamente a 
proteína e o fosfato. 
 
4.3.4. Aplicação da amostra e eluição 
1. Medir 2 mL de água para um tubo de ensaio e marcar o nível corresponde aos 2 mL em vários 
tubos de recolha das frações. 
2. Recolher o eluente em frações de 2 mL, em tubos de ensaio numerados onde foi previamente 
marcado o nível correspondente a 2 mL. Recolher 3 tubos antes da aplicação da amostra. 
3. Para aplicar a amostra, abrir a torneira e deixar escoar o resto do eluente, tendo o cuidado de 
não deixar secar o leito. 
eluente
fase estacionária 
(gel)
placa porosa
eluente
fase estacionária 
(gel)
placa porosa
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 31 
 
4. Fechar a torneira e usar uma micropipeta para aplicar 
0,4 mL de solução de hemoglobina. Aplicar a amostra ao 
longo das paredes, distribuindo-a uniformemente por 
toda a secção. 
5. Abrir a torneira e com uma pipeta Pasteur lavar com 
eluente a amostra que ficou à superfície do gel e nas 
paredes da coluna. 
6. Deixar a amostra entrar completamente no leito, nunca 
o deixando secar. 
7. Quando toda a amostra tiver entrado, adicionar 
suavemente eluente de modo a deixar uma coluna de 
líquido - até ao topo da coluna, para evitar turbulência 
no leito do gel. 
8. Adicionar continuamente mais eluente de modo a 
manter o seu nível, pelo menos 1 cm, acima do topo da 
coluna. 
9. Eluir até um volume 10 mL superior ao volume da coluna 
ou até obter valores de condutividade e Abs 540 nm 
iguais aos valores iniciais de referência (ver tópico 3.3). 
 
4.3.5. Análise das frações de eluato 
1. Preparar uma tabela no caderno de laboratório para registo dos resultados (condutividade e Abs 
540 nm). 
2. Para cada fração tem que fazer a leitura da condutividade e da absorvência. 
3. Ler a condutividade e guardar cada fração outra vez no mesmo tubo. Após cada medição, 
mergulhar a célula condutimétrica num copo com água destilada até a condutividade baixar até 
< 50 µS e secar ligeiramente com papel absorvente. 
4. Ler a absorvência a 540 nm, contra o eluente (branco). Guardar cada fração outra vez no mesmo 
tubo. Após cada medição, lavar a célula com água destilada e secar ligeiramente com papel 
absorvente. 
Nota: Só deve deitar fora as várias frações depois de interpretados os resultados. Pode ter que 
repetir alguma leitura. 
 
Arrumações Finais 
- Lavar todo o material e deixá-lo a secar pendurado nos suportes. 
- Os restos de soluções e resíduos devem ser despejados nos frascos indicados para o efeito. Em 
caso de dúvida consultar sempre o docente. 
 
4.4. Questionário 
a) Para esta aula deve, se possível, trazer um computador. Introduzir os dados experimentais no 
programa de computador (Excel ou equivalente). Construa o cromatograma de Abs 540 nm e 
condutividade versus volume de eluição (mL). A tabela com o registo dos dados e o 
cromatograma devem ser incorporados no seu caderno. 
b) Que apreciação faz dos dados obtidos? 
c) Confirme se ocorreu efetivamente a troca de tampão da solução de hemoglobina, com indicação 
do(s) tubo(s) em que recolheu a hemoglobina no tampão Tris-HCl. 
d) Que tipo de célula usou para fazer as leituras de Abs 540 nm? Justifique. 
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 4 32 
 
4.5. Bibliografia 
Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. J (2012) Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein 
Biotherapeutics and their Aggregates, Liquid Chromatography and Related Technologies, 35(20), 
2923-2950. 
Plummer D.T. (1978) Separation methods. In: An introduction to practical biochemistry, 2nd Edition, 
McGRAW-HILL Book Company, UK, Cap 3, pp 47-98 
Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods, In: Handbooks from GE Healthcare Life 
Sciences, www.gelifesciences.com/handbooks, consultado em 1 de março de 2017. 
Walker J. (2000) Protein structure, purification and characterisation. In: Principles and techniques of 
practical biochemistry, 5th edition, Keith Wilson and John Walker Eds., Cambridge University 
Press, Cap 6, pp 312-356). 
 
http://www.gelifesciences.com/handbooks
Laboratório B1-MIA / Componente B1 Trabalho 5 33 
 
Invertase: preparação do extrato não purificado da enzima e estudo cinético da 
catálise da invertase 
 
(trabalho laboratorial a realizar em 2 aulas) 
 
 
Conceitos a rever para a preparação da aula: 
- Cinética enzimática 
- Equação de Michaelis-Menten 
- Representações gráficas de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk 
- Método do Biureto 
 
5.1. Introdução 
5.1.1. Conceitos gerais sobre cinética enzimática 
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações enzimáticas. Todas as 
enzimas apresentam em comum alguns aspetos estruturais e funcionais, independentemente da 
reação que catalisam. Todas elas são proteínas e contêm um local funcional que se designa por 
centro ativo, onde os reagentes (substratos) são convertidos