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Faculdade de Engenharia de Alimentos Unicamp- Universidade Estadual de Campinas Relatório 6 Estudo da ação da peroxidase e catalase em alimentos Caroline Mantovani Celegatti, 155008 Gabriella Stein Durazzo Monteiro dos Santos, 155526 Isabella Peressinoto Romero, 155808 Prof. Hélia Sato TA 610 Transformações Bioquímicas em Alimentos Turma B - Grupo 2 2º Semestre 2016 Campinas, 4 de outubro de 2016 1. INTRODUÇÃO As enzimas catalase e peroxidase também são exemplos de enzimas de grande interesse na área de alimentos. Elas ocorrem em plantas, animais e microrganismos. Nos animais e vegetais, acredita-se que a função delas é proteger os tecidos contra os efeitos tóxicos da água oxigenada (H2O2) formada durante o metabolismo celular, uma vez que aceleram a decomposição dessa substância em H2O e O2. A diferença entre elas está no mecanismo de ação. Enquanto a catalase reduz diretamente a água oxigenada a água e gás oxigênio, a peroxidase o faz acelerando a reação da água oxigenada com um substrato específico, por exemplo,o guaiacol, formando um composto marrom escuro, como pode ser visto na Figura 1. Figura 1. Reação do guaiacol com a peroxidase Juntamente com a polifenoloxidase, a peroxidase é tida como a responsável pelo escurecimento enzimático em frutas e vegetais. As peroxidases são enzimas classificadas como oxidorredutases, responsáveis por oxidar uma variedade de doadores de hidrogênio com consumo de peróxido de hidrogênio, funcionando também como aceptor de elétrons em reações de oxidação (SILVA, 2012). Na ausência de peróxidos podem hidroxilar compostos aromáticos e catalisar a oxidação de alguns substratos com o auxílio do oxigênio molecular (KOBLITZ, 2008) As pesquisas com esse grupo de enzima são de grande importância para a tecnologia de alimentos, visto que a continuidade da atividade enzimática ocasiona inúmeras reações oxidativas e de biodegradação, tais como, mudança na cor, degradaçnao da clorofila e auxinas, oxidação do fenóis, variações de aroma, alterações no teor de vitaminas e até modificações na textura dos frutos (LAURENTE, 2005; VALDERRAMA et al, 2001). Nos produtos de origem vegetal a peroxidase é a enzima mais termorresistente, sendo utilizada como indicadora de branqueamento, pois, por ser mais resistente, destruindo-se a peroxidase, garante-se que todas as outras enzimas deterioradoras de qualidade estarão também inativadas (CUNHA, 2005; SILVA, 2012). Os tratamentos térmicos comercialmente usados no processo de extração de frutas e vegetais, como por exemplo: temperatura elevada por curto tempo (HTST- high temperature short time), são pouco efetivos para uma inativação irreversível principalmente da peroxidase (VALDERRAMA et al., 2001). A catalase, por sua vez, é catalisadora de reações em que uma molécula de peróxido de hidrogênio atua como doador e a outra como aceptor de átomos de hidrogênio com a formação de água e oxigênio, estando presente em frutas e vegetais crus, com destaque para a batata doce, abacaxi, kiwi e melancia. A reação catalisada pela catalase está representada na Figura 2. Figura 2. Reação da decomposição do peróxido de hidrogênio pela catalase 2. OBJETIVO O objetivo desta aula prática é o estudo da inativação térmica da peroxidase e da catalase de vegetais através da determinação qualitativa da atividade de catalase e peroxidase e da determinação quantitativa de atividade de peroxidase. 3. MATERIAL E MÉTODOS ITEM I - Detecção da atividade de peroxidase em frutas frescas Foram adicionadas 3 gotas de solucão 0,2% de guaiacol em etanol 50% (Substrato A) e 3 gotas de H2O2 0,1M ( Substrato B) sobre as fatias de abacaxi, banana e maçã. Foi verificado se houve formação de pigmento marrom escuro (tetraguaiacol), que indica a presença de atividade de peroxidase. ITEM II - Determinação qualitativa de catalase e de peroxidase: Estudo da inativação térmica da peroxidase e catalase de batata e nabo Os alunos foram divididos em grupos e alguns ficaram com a determinação da atividade de peroxidase e catalase em batata e outros determinaram em nabo. O grupo II determinou a atividade residual de peroxidase e catalase em batata. A batata foi descascada e cortada em doze cubos de 1cm de aresta. As batatas foram tratadas termicamente com água destilada a 90ºC. Dois cubos não sofreram tratamento térmico e foram considerados como controle. O tratamento térmico foi realizado da seguinte forma: um béquer com 150 a 200mL de água destilada foi colocado em banho maria a 90ºC por 10 minutos. Os cubos de batata foram colocados no béquer quando a água atingiu 90ºC. Os cubos foram retirados a cada 2 minutos e colocados em placa de Petri com água destilada para resfriar. A presença de peroxidase foi testada nos cubos como descrito nos itens IIA e IIB. No item IIA, foi utilizado um cubo para o teste de catalase e, no item IIB, outro cubo foi usado para o teste de peroxidase. ITEM IIA - Teste qualitativo de catalase O cubo de batata foi cortado em três partes, fazendo dois cortes paralelos. A parte central foi colocada em tubo de ensaio com 5mL de solução ),1M de H2O2 (Substrato B). Se houve desprendimento de oxigênio, o resultado foi positivo. ITEM IIB - Teste qualitativo de peroxidase O cubo foi cortado ao meio e a parte interna foi usada para o teste. A amostra foi colocada sobre a placa de Petri e 3 gotas de solução 0,2% de guaiacol em etanol 50% (Substrato A) foram adicionadas. Foram colocadas 3 gotas de solução 0,1M de H2O2 (Substrato B). A presença de coloração marrom foi verificada, o que indica teste positivo. ITEM III - Estudo da termoestabilidade da peroxidase de batata, nabo e palmito e Determinação quantitativa de peroxidase residual ITEM IIIA - Tratamento térmico das amostras de batata, nabo ou palmito 200mL de água destilada foram colocados para aquecer em banho-maria a 90ºC. A batata foi cortada em cubos de 1cm de aresta. Foram pesados 20g de amostra, que foi adicionada ao béquer e permaneceu nele por 2 minutos. Após a incubação, o béquer foi resfriado em banho de gelo até atingir a temperatura ambiente. O material foi homogeneizado em liquidificador e posteriormente filtrado em papel de filtro. O filtrado foi recolhido em tubo de ensaio. A atividade residual da peroxidase foi determinada no filtrado como descrito no item a seguir. ITEM IIIB - Determinação quantitativa de peroxidase residual Foi pipetado 3mL de substrato C (Guaiacol 50 mM + H2O2 20 mM + 5% de etanol em tampão fosfato 0,1M pH 7,0), em uma cubeta do espectrofotômetro. O aparelho foi zerado com a solução de substrato. 0,5mL de amostra foi adicionado e foi misturado rapidamente por inversão do tubo. A cubeta foi colocada no espectrofotômetro, a absorbância inicial foi anotada e foi anotada novamente após 1 minuto de reação. Caso o aumento tenha sido muito rápido, a amostra de enzima precisaria ser diluída. A atividade enzimática foi calculada. Uma unidade de atividade foi definida como o aumento de 0,001 na absorbância a 420nm por minuto de reação por g de amostra de batata. A atividade de peroxidase também foi testada nas amostras de batata que não sofreram tratamento térmico 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO I- Detecção da atividade de peroxidase em frutas frescas (abacaxi, banana, maçã) Fruta/grupos Tabela 1- Detecção da atividade de peroxidase em frutas frescas I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV Abacaxi + + + + - + + + + + + + + Banana + + + + + + + + + + + + + Maçã + + + + + + + + + + + + + Podemos concluir observando a Tabela 1 que as frutas abacaxi, banana e maçã possuem atividade de peroxidase, uma vez que as amostras apresentaram formação de pigmento marrom escuro. II - Determinação qualitativa de catalase e de peroxidase: Estudo da inativação térmica da peroxidase e catalase de batata e nabo Tabela 2- Tratamentotérmico a 65ºC e determinação de atividade residual de catalase e da peroxidase Tempo Grupo I Batata Grupo VII Batata Grupo XIII Batata Grupo V Batata Grupo XI Batata Grupo III Nabo Grupo IX Nabo Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per 0’ ++++ + + + + + + + + + + + + + 5’ ++++ + + + +++ + + + + + + + + + 10’ ++ + + + ++ + + + - + + + + + 15’ ++ + + + ++ + + + - + + + + + 20’ + + + + ++ + + + + + + + + + 25’ + + + + ++ + + + - + + + + + Observando a Tabela 2, todos os grupos apresentaram resultado positivo para o teste da peroxidase, confirmando que tanto a batata quanto o nabo possuem atividade de peroxidase, já que a temperatura de 65º não inativou tal enzima. Concluímos também, que para inativar tal enzima, seria necessário maior tempo no banho-maria e/ou maior temperatura. Para o teste da catalase, que avalia a presença da enzima catalase e aponta resultado positivo através da presença de bolhas na superfície do nabo quando em contato com o peróxido, alguns grupos apresentaram resultados um pouco divergentes, principalmente quanto ao grupo IX, que teve inativação logo nos 10 primeiros minutos e depois de 20 minutos o comportamento da enzima mudou, voltando a ser ativada novamente. Isso pode ter ocorrido talvez por erros de procedimento no laboratório. Tabela 3- Tratamento térmico a 90ºC e determinação de atividade residual de catalase e da peroxidase Tempo Grupo II Batata Grupo VIII Batata Grupo XIV Batata Grupo IV Nabo Grupo X Nabo Grupo VI Nabo Grupo XII Nabo Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per Cat Per 0’ ++++ + +++ + + + + + ++++ + ++++ ++ 5’ + + +++ ++ - + + + +++ + ++ + 10’ + + +++ ++ - + + + ++ + + + 15’ + + ++ +++ - + - + + + + + 20’ + + ++ +++ - + - + + + + + 25’ + + + ++++ - + - + - + - + Após a mudança da temperatura do tratamento, de 65ºC para 90ºC, algumas alterações foram notavelmente verificadas. Em relação ao teste da catalase, pode ser observado que após 25 minutos de tratamento à 90ºC, a enzima catalase foi inativada no nabo. Na batata, não ocorreu inativação enzimática após aproximadamente os 25 minutos na maioria dos grupos, mostrando que a catalase na batata também é termosensível à 90ºC. Houve a exceção do grupo XV, que apresentou resultado bem divergente aos outros, pois a enzima foi inativada a 5 minutos, contradizendo os outros grupos que realizaram o teste para a batata. Isso pode ter ocorrido por erros de procedimento ou o banho-maria não estava com a temperatura exata. A peroxidase na batata e no nabo, no entanto, não foi inativada a temperatura de 90ºC após 25 minutos de tratamento na maioria os grupos, denotando que talvez fosse necessário maior temperatura ou maior tempo de exposição no banho-maria para que a inativação ocorresse. O grupo X não apresentou seus dados. III - Estudo da termoestabilidade da peroxidase de batata, nabo e palmito e Determinação quantitativa de peroxidase residual Amostra Tratamento térmico Diluição Abs inicial Abs final Atividade (U= min-1.g-1) I Batata 10' a 65ºC - 0,409 0,860 9957,14 Batata sem tratamento - 0,143 0,498 920 II Batata 2' a 90ºC - 0,947 1,076 1290 Batata sem tratamento - 0,178 0,532 3540 III Nabo 10' a 65ºC 1:10 0,040 0,384 688 Nabo sem tratamento 1:10 0,056 0,460 808 IV Nabo 2' a 90ºC 1:50 0,1 0,184 184000 Nabo sem tratamento 1:50 0,0 0,086 86000 V Palmito 10' a 65º - 0,526 0,889 7260 Palmito sem tratamento - 0,017 0,540 10460 VI Palmito 2' a 90ºC 1:10 0,049 0,094 9200 Palmito sem tratamento 1:10 0,221 0,434 42600 VII Batata 7' a 65ºC - 0,213 0,547 6680 Batata sem tratamento - 0,177 0,527 7000 VIII Batata 3' a 90ºC - 0,276 5520 Batata sem tratamento - 0,524 104800 IX Nabo 7' a 65ºC 1:10 0,031 0,311 56000 Nabo sem tratamento 1:10 0,154 0,873 143800 X Nabo 3’ a 90ºC 1:10 0,024 0,247 54600 Nabo sem tratamento 1:10 73400 XI Palmito 5' a 65ºC 1:5 0 0,108 40800 Palmito sem tratamento 1:10 0 0,581 56800 XII Palmito 3' a 90ºC - 0,403 0,686 5660 Palmito sem tratamento 1:10 0,177 0,321 28800 XIII Batata 8' a 65ºC - 0,162 0,355 3860 Batata sem tratamento - 0,157 0,544 7740 XIV Batata 4' a 90ºC - 0,372 0,418 920 Batata sem tratamento - 0,200 0,600 8000 a) Para a amostra sem tratamento da batata: Os cálculos foram feitos abaixo com base nos resultados do grupo II. Primeiramente, calculou-se a diferença entre as absorbâncias: Absfinal – Absinicial = 1,076 – 0,947= 0,129 Sabe-se que: 0,001 -------------- 1 U 0,129 -------------- x U x = 129 U Dividindo pelo tempo de reação de 2 minutos, encontramos o valor de 64,5 No entanto, também sabe-se que foram utilizadas 20g de amostra que tinha na solução, então tem-se que: 200 ml -------------- 20 g 0,5 mL --------------- y g y =0,05 g Dividindo 64,5 por 0,05 encontramos U= 1290 /min g Por último, deve-se considerar a diluição, que nesse caso não foi utilizada. Para a amostra tratada por 10 minutos a 65ºC, foram realizados os mesmos cálculos com 10 minutos. A análise quantitativa da atividade da peroxidase mostrou que houve diminuição significativa de atividade enzimática quando comparado a amostra sem tratamento e a com tratamento térmico. Verificar na literatura o tratamento térmico necessário para inativação da peroxidase de suco de maçã, maracujá, laranja, abacaxi, manga e caju. Abacaxi: Em estudo com o extrato enzimático de POD, obtido a partir do abacaxi, avaliou a atividade destas enzimas frente às diferentes condições de tempo, temperatura e pressão. Os autores observaram que a inativação enzimática foi maior quando valores mais elevados dos parâmetros tempo (45 minutos), temperatura (60 ºC) e pressão (600 MPa) foram utilizados. A máxima redução foi de 60,08 % para POD. (RODRIGUES, 2014) Caju: No suco de caju, a atividade residual de peroxidase do escorbato sofreu um declínio em sua atividade residual logo no primeiro mintuo de todos os tratamentos aplicados e depois voltou a aumentar principalmente a 55ºC atingindo menos de 80% ao final de 30 min. As demais temperaturas testadas tenderam a reduzir atividade por até 20 min, então quando se pôde observar um novo aumento. (RABELO, 2012) Maçã: Foram realizados tratamentos térmicos nas temperaturas de 60, 65, 70 e 75°C por períodos que variaram de 1 a 10 minutos, sendo observada diminuição da atividade de peroxidase com o aumento da temperatura e tempo. No entanto, a peroxidase não chegou a ser inativada em nenhum dos tratamentos realizados. (VALDERRAMA, 2001) Laranja: Foi realizado tratamento térmico a 80ºC. No entanto, a partir de seis minutos todas as frações apresentaram praticamente o mesmo comportamento, mantendo uma atividade entre 18 a 30% da atividade enzimática antes do inicio do tratamento. Portanto, pode-se concluir que não ocorreu a inativação da peroxidase, apesar da diminuição de sua atividade (BERBICS, 2001) Manga: Estudos mostraram que a enzima PDO, com dois minutos de aquecimento, a diferentes temperaturas (65º a 80ºC),a atividade da enzima caiu mais de 50%. No entanto, após 4 minutos de aquecimento, a atividade permaneceu quase constante para todas as temperaturas estudadas. A atividade residual mais baixa, atingida a 85ºc, foi de 2,30%. (ROBINSON, 1991) 5. Conclusão Concluímos que todas as frutas frescas analisadas na aula prática apresentam atividade de peroxidase. Observamos também, que tanto a batata, como o nabo, apresenta atividade de peroxidase e de catalase, e que o primeiro tratamento térmico aplicado (25 minutos a 60°C) não é suficiente para inativar essas enzimas. Mas quanto o tratamento térmico foi alterado para 90°C, observou-se que a catalase na batata e no nabo é termosensível à 90ºC. Já a peroxidase não foi inativada a 90°C, mostrando-se mais termoestável que a catalase. Agora em relação a análise quantitativa da atividade da peroxidase, concluimos que houve diminuição significativa de atividade enzimática quando comparado a amostra sem tratamento e a com tratamento térmico. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS VALDERRAMA, Patrícia; FABIANE, MARANGONI; CLEMENTE, Edmar. EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO SOBRE A ATIVIDADE DE PEROXIDASE (POD) E POLIFENOLOXIDASE (PPO) EM MAÇÃ (Mallus comunis). Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas , v. 21, n. 3, p. 321-325, 2001 . Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612001000300012&lng=en&nrm=iso>. Acesso em 30 set 2016 SILVA, Vânia Maria Barboza da et al. Características de composição química e atividades da Peroxidase e da Polifenoloxidase dos cultivares de abacaxi MD-2 e Pérola. 2012. Disponível em: <http://tede.biblioteca.ufpb.br:8080/bitstream/tede/4053/1/arquivototal.pdf>. Acesso em 30 set 2016 KOBLITZ, M. G. B. Bioquímica de alimentos. Teoria e aplicações práticas. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, v. 1. 242 p, 2008. CUNHA, G. M. A.; ALVES, J. K. P.; JÚNIOR, W. M. A.; DUARTE, W. K. C. & MAGALHÃES, M. M. A., Estudo da cinética de inativação térmica da peroxidase presente na polpa de goiaba. In: VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica, 2005. http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/enzimas.htm LAURENTE, C.; CLEMENTE, E. Avaliação da atividade da peroxidase em carambola (Oxalidacia averrhoa) em diferentes estádios de maturação. Acta Scientiarum, v. 27, n. 1, p. 159-163, 2005. http://www.sciencenter.org/chemistry/d/activity_guide_plant_power.pdf ROBINSON, D. S. Peroxidases and catalases in foods. In: ROBINSON, D. S.; ESKIN, N. A. M. Oxidative Enzymes in Foods. Elsevier Applied Science; p.1-45.; 1991. RODRIGUES, F. M.; RODRIGUES, L. G. S. M.; GOI, S. R.; MENDONÇA, C. R. B.; OLIVEIRA, E. M.; SALES, V. H. G. S. Altas pressões hidrostática na conservação de alimentos: um enfoque para o processamento de sucos. Journal of Bioenergy and Food Science, Macapá, v.1, n. 2, p.32-40, jul. / set. 2014. BERBICZ, F.; CLEMENTE, E. Avaliação da termoestabilidade e da regeneração da atividade da peroxidase extraída de laranja (Citrus spp.). Maringá, v. 23, n. 5, p. 1239-1242, 2001. RABELO, C. M.; Termoestabilidade de enzimas do suco de graviola e caju.; Universidade Federal do Ceará; Fortaleza.; p. 27-28.; 2012.
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