Apostila Bioquímica Geral e Metabólica

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FACULDADES PEQUENO PRÍNCIPE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA DE BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
 
ROTEIROS PARA AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IDENTIFICAÇÃO DO ALUNO 
 
NOME: ___________________________________________________________ 
 
CONTATO: ________________________________________________________ 
 
CURSO DE BIOMEDICINA / FARMÁCIA 
FACULDADES PEQUENO PRÍNCIPE – 2017 
 1 
APOSTILA DE BIOQUÍMICA 
ROTEIROS PARA AULAS PRÁTICAS 
 
 
APRESENTAÇÃO 
 
 
Esta apostila inclui os roteiros para as aulas práticas de Bioquímica Geral e 
Metabólica, além do aspecto teórico das aulas ministradas em laboratório. 
A apostila também traz exercícios para estudo dirigido e questões para serem 
entregues em relatório. 
 
 
DICAS PARA OS RELATÓRIOS 
 
 
Os relatórios deverão estar nas normas da ABNT (verificar no Manual de Normas 
Técnicas Para Trabalhos Científicos da FPP) 
 
 A introdução pode e deve ser breve, englobando os aspectos básicos sobre o 
conteúdo da aula. 
 Em materiais e métodos devem estar descritos os materiais utilizados juntamente 
com os procedimentos (reagentes, tempo de aquecimento, etc.) realizados. 
 Em resultados e discussão devem ser abordados os resultados (ou seja, o que 
ocorreu durante o processo experimental e o porquê destes resultados). O porquê 
dos resultados é que constitui a discussão. 
 Na conclusão vocês retomam os objetivos da aula e concluem os resultados de 
maneira sucinta e objetiva. Na conclusão não se discute nem se aborda qualquer 
novo tópico, mas sim se afirmam os resultados discutidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 1 
PH E SOLUÇÕES TAMPÃO 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- reconhecer a importância do controle de pH na homeostase dos organismos, enfatizando 
os conceitos de pH e soluções tampão 
 
Objetivos específicos: 
- determinar o pH de soluções através de método colorimétrico, utilizando indicador 
universal 
- entender o funcionamento de soluções tampão e sua importância fisiológica 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REAGENTES 
 
- Soluções de pH determinado 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 
- Indicador universal 
0,05g de laranja de metila; 0,15g de vermelho de metila; 0,3g de azul de bromotimol; 
0,35g de fenolftaleína e álcool etílico a 66% para 1L 
- Hidróxido de sódio NaOH 0,1 mol/L 
- Ácido clorídrico HCl 0,1 mol/L 
- Solução-tampão pH 7,0 
 
B. TÉCNICA 
 
1. ESCALA PADRÃO 
 Preparar uma bateria de 8 tubos de ensaio 
Colocar em cada tubo 1 mL de solução pH 3 a 10 
Adicionar 5 gotas do indicador universal a cada tubo 
Adicionar 9 mL de água destilada a cada tubo e homogeneizar 
 
RESPONDA: Qual a função da escala padrão? 
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 
 
2. EXPERIMENTO I 
 
Preparar uma bateria de 4 tubos de ensaio, de acordo com a tabela abaixo: 
 
 Tubos 
Reagentes 
1 2 3 4 
Indicador universal 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas 
Água destilada 10 mL 9 mL 10 mL 9 mL 
Solução Tampão pH 7,0 - 1 mL - 1 mL 
pH 
 
O pH deve ser avaliado de acordo com a escala padrão preparada no item 1 e 
anotado na tabela anterior. 
 
 
 
 
 3 
3. EXPERIMENTO II 
 
Após o experimento I, adicionar os seguintes reagentes aos 4 tubos anteriores, de 
acordo com a tabela abaixo: 
 
 Tubos 
Reagentes 
1 2 3 4 
NaOH 0,1 mol/L 1 gota 1 gota - - 
HCl 0,1 mol/L - - 2 gotas 2 gotas 
pH 
Soprar o ar expirado 15 segundos 1 minuto - - 
pH - - 
HCl 0,1 mol/L - - - 
Gota a gota 
nº de gotas=_____ 
 
 Anote na tabela o pH resultante após a adição de NaOH e HCl aos tubos e depois 
sopre o ar expirado nos tubos 1 e 2 durante o tempo previsto na tabela e anote o resultado. 
 Por fim adicione HCl 0,1 mol/L gota a gota no tubo 4 até que este resulte na cor do 
tubo 3 e anote o número de gotas. 
 
 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
 
ÁGUA: AMBIENTE CELULAR 
 
- Substância mais abundante nos seres vivos 
- Perfaz 70% ou mais da massa da maioria dos organismos 
- Evolução marcada pelas propriedades do meio aquoso, onde a vida começou 
- Forças de atração entre moléculas de água 
- Pequena tendência da água se ionizar 
- A molécula de água e seus produtos de ionização influenciam profundamente a estrutura, 
a automontagem e as propriedades de todos os componentes celulares 
- A água pura é ligeiramente ionizada 
 
 H2O ↔ H+ + OH- 
 
IONIZAÇÃO DA ÁGUA 
 
 H2O ↔ H+ + OH- 
 
A ionização da água é expressa por uma constante de equilíbrio (Ka) 
 
O Ka = [H+] [OH-]/ [H2O] = 1,8 x 10-16 mol/L a 25ºC 
 
Água é ácido fraco, só uma fração muito pequena se dissocia e se considera sua 
concentração constante e = a 55,55mol/L 
 (1000g/18 = 55,55mol/L) 
 
Produto iônico da água = [H+] [OH-] = Kw = 1,8 x 10-16 . 55,55 
 
 [H+] [OH-] = Kw = 1,0 x 10-14 
 
O Kw expressa o produto da [ ] de H+ e íons OH- em soluções aquosas 
 
Em água pura a 25ºC, [H+] = [OH-] = 1 x 10-7 mol/L 
 4 
 Assim se 0,1 mol/L de HCl for adicionado à água pura, a nova [] de H+ será 0,1 mol/L 
(HCl é ácido forte, se dissocia completamente) e a de OH- 1 x 10-13, mantendo o valor de Kw 
= 1 x 10-14. 
 
 
pH: ESCALA E SIGNIFICADO 
 
Os valores de prótons e íons hidróxidos em soluções diluídas são muito pequenos 
 
Por isso foi definido o termo pH como escala logarítmica de base 10: 
 
 pH = log 1/[H+] = - log [H+] 
 
 O termo pH expressa a concentração de prótons 
 
 O pH da água pura é, então, pH = - log (10-7) = 7 
 
 É importante notar que a diferença de uma unidade na escala de pH significa uma 
diferença de 10 vezes na concentração de prótons 
 Assim, uma solução pH 4 possui [H+] = 10-4 mol/L e outra pH 5 possui [H+] = 10-5 
mol/L 
SOLUÇÃO TAMPÃO 
 
Soluções tampão consistem, basicamente, de soluções mistas de ácido fraco e sua base 
conjugada ou base fraca e seu ácido conjugado em concentrações aproximadamente iguais. 
 
Uma solução tampão corresponde a uma solução na qual o pH resiste à mudança quando 
ácidos ou bases fortes são adicionadas. 
 
 Se um ácido for adicionado: 
 
 A- + H+ → HA 
 
 Se uma base for adicionada: 
 
 HA + OH- → A- + H2O 
 
 Se a [HA] for muito menor do que a de A (mais do que 10 vezes), quando for 
adicionada uma base, o pH aumentará por falta de HÁ para neutralizá-la e vice-versa. 
 
 
EQUAÇÃO DE HENDERSON-HASSELBACH 
 
Para o ácido acético por exemplo: 
 Ka = [H+] [CH3COO-] / [CH3COOH] 
 
Aplicando-se log em ambos os lados e rearranjando: 
 
 pH = pKa + log [CH3COO-] / [CH3COOH] 
 
Para um ácido HA: 
 
 pH = pKa + log [A-] / [HA] 
 
onde A- é a base conjugada e HÁ o ácido não dissociado 
 
 5 
 Esta equação descreve a variação do pH de uma mistura de um ácido fraco não-
dissociado e sua base conjugada, relacionando pH da solução e concentrações das 
espécies químicas. 
 
 
MÉTODOS PARA SE DETERMINAR O PH 
 
Determinação colorimétrica: Indicadores universais e de papel de pH 
 
Conhecimento dos pKs dos indicadores (ácidos ou bases fracos) 
 
Dissociação de um indicador ácido 
 
Hin ↔ In- + H+ 
 
Ácido base 
Cor A Cor B 
 
A cor do indicador é uma função do pH da solução 
Os papeis são impregnados com indicadores 
 
 
MÉTODOS PARA SE DETERMINAR O PH 
 
Determinação potenciométrica: potenciômetro 
Método mais preciso 
Eletrodo de calomelano (cloreto mercuroso em solução KCl(aq) saturada) 
Eletrodo de vidro com um bulbo especial contendo solução HCl 0,1mol/L 
Eletrodo imerso em solução externa de concentração desconhecidaCria-se um potencial entre as soluções interna e externa 
Voltagem do eletrodo é cte, assim a diferença de potencial entre os 2 eletrodos é 
relacionada com a concentração de H+ da solução desconhecida 
 
 
IMPORTÂNCIA DE SISTEMAS TAMPÃO 
 
Equilíbrio ácido-base – homeostase 
 
Exemplo Sistema-Tampão Bicarbonato (pH ~ 7,4) 
 
 
 
 
 
 Quando há ácido lático produzido por exercício vigoroso (excesso de H+) 
 Quando há produção de NH3 do catabolismo de proteínas (pouco H+) 
 6 
RELATÓRIO – pH e soluções tampão 
 
O relatório de aulas práticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As 
questões que se seguem devem ser abordadas no relatório. 
1. De onde surgiu e qual a importância da escala de pH? 
2. O que é solução tampão e como funciona? 
3. Qual a importância dos sistemas tamponantes em nosso organismo? 
4. Explique o que a Equação de Henderson-Hasselbach relaciona e demonstre sua 
dedução, considerando que o equilíbrio de ionização de um ácido fraco pode ser 
representado pela equação: HA  H+ + A-, onde HA e A- correspondem a um par ácido-
base conjugada. Lembre-se dos conceitos de constante de equilíbrio de uma reação (K) e 
das constantes de ionização dos ácidos (pK). 
5. Qual a importância do estado ácido-base do líquido intracelular ser influenciado e 
influenciar o estado ácido-base do sangue? 
 
 
 7 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 2 
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- identificar proteínas, enfatizando as propriedades gerais, estrutura e isolamento destas 
moléculas. 
 
Objetivos específicos: 
- caracterizar proteínas em material biológico através de reações colorimétricas 
- verificar precipitação de proteínas em diferentes condições, correlacionando as 
observações com a estrutura das proteínas. 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REAGENTES 
 
1. Solução de proteínas a 10% 
2. Solução de ninhidrina 0,1% 
3. Hidróxido de sódio (NaOH) 2,5 mol/L 
4. Solução de sulfato de cobre (CuSO4) a 1% 
5. Ácido tricloroácetico (TCA) a 10% v/v 
6. Acetato de chumbo a (PbCH3COO-) 5% p/v 
7. Álcool etílico (CH3CH2OH) absoluto 
8. Clara de ovo “in natura” 
9. Cloreto de sódio (NaCl) 1 mol/L 
10. Solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] 76,6g% p/v 
 
B. PREPARO DOS REAGENTES 
 
1. Solução de proteínas: preparar uma solução de clara de ovo a 10% v/v em solução 
salina (NaCl 0,9g/100mL) ou tampão fosfato 10mmol/L, pH 7,0. 
2. Solução de ninhidrina: pesar 100mg de ninhidrina e dissolver em 100mL de tampão 
fosfato 0,01 mol/L, pH 7,0. Conservar em frasco escuro e em geladeira. 
 
C. TÉCNICA 
 
1. REAÇÕES DE COLORAÇÃO 
 
REAÇÃO DA NINHIDRINA 
 
TUBO 1 - 2mL de ninhidrina + 1mL proteína a 10%, banho-maria por 5 min., a 100ºC. 
Anotar o resultado. 
 
REAÇÃO DO BIURETO 
 
TUBO 2 - 1 mL de proteína a 10 % + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato 
de cobre a 1%. Anotar o resultado. 
 
TUBO 3 - 1 mL de água destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato 
de cobre a 1%. Anotar o resultado. 
 
 
 
 
 8 
2. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO 
 
AÇÃO DO CALOR 
TUBO 4 - 2 mL de proteína a 10 %, aquecer em banho-maria a 100ºC por 3 min. 
Anotar o resultado. 
 
REAÇÃO COM REAGENTES PARA ALCALÓIDES 
TUBO 5 - 1 mL de proteína a 10 % + 1mL de TCA 10%. Anotar o resultado. 
 
REAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS 
TUBO 6 - 1 mL de proteína a 10 % + 1 mL de acetato de chumbo a 5%. Anotar o 
resultado. 
 
REAÇÃO COM SOLVENTES ORGÂNICOS 
TUBO 7 - 1 mL de proteína a 10 % + 3 mL de álcool etílico. Anotar o resultado. 
 
EFEITO DA ADIÇÃO DE SAIS 
TUBO 8 - 3 mL de clara in natura + 3mL de água destilada. Agitar com bastão até a 
formação de precipitado esbranquiçado. Adicionar NaCl 1 mol/L gota a gota e 
homogeneizar o conteúdo do tubo até o precipitado redissolver. Anotar o resultado. 
 
TUBO 9 - 2 mL da solução anterior + 4 mL de solução saturada de sulfato de 
amônio. Observar. Adicionar 4 a 6 mL de água destilada e observar o efeito. Anotar o 
resultado. 
 
 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
Fundamentos das reações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 - reação da ninhidrina 
NINHIDRINA 
AMINOÁCIDO 
NINHIDRINA 
PIGMENTO PÚRPURA 
 9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONSTITUINTES DAS PROTEÍNAS 
 
Constituídas por aminoácidos 
 
Estrutura básica dos aminoácidos 
– grupos AMINO e CARBOXILA 
– cargas negativas e positivas 
– caráter dos grupamentos R (+ ou -; polares ou apolares) 
– conformação protéica 
 
LIGAÇÃO PEPTÍDICA 
 
Ligações peptídicas – desidratação e constituição da ligação 
 
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS 
 
Estrutura PRIMÁRIA – aminoácidos ligados por ligações peptídicas 
Estrutura SECUNDÁRIA – cadeias α-hélice e folha β 
Estrutura TERCIÁRIA – dobramentos 
Estrutura QUATERNÁRIA – mais de 1 proteína (subunidades; exemplo - Hemoglobina) 
 
DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
As estruturas 4ª, 3ª e 2ª podem ser desfeitas 
A estrutura 1ª é mantida 
Fig. 2 - reação do biureto 
 10 
Agentes desnaturantes promovem floculação e coagulação (precipitação) 
 
pH 
alteram as cargas dos aminoácidos 
 
calor 
alteram interações que estabilizam a estrutura tridimensional 
 
reagentes para alcalóides (ácidos) 
combinam com proteínas de carga positiva e formam complexos insolúveis 
 
sais de metais pesados 
combinam com proteínas de carga negativa e formam proteinatos insolúveis 
 
solventes orgânicos (etanol) 
promovem grande atração entre cargas opostas e precipitam (porque estes solventes têm 
constante dielétrica inferior à água) 
 
F = e+ e- / D . r2 
(D da água é maior do que do etanol) 
D= constante dielétrica (inversamente proporcional a F) 
Se D é pequeno, F tende a ser grande, por isso a F (força de atração entre as cargas e+ E 
e-) é maior e a agregação das cargas favorece a precipitação 
Se D é grande, F tende a ser pequeno, por isso a F (força de atração entre as cargas e+ E 
e-) é menor e a solubilização é favorecida 
 
SOLUBILIDADE DE PROTEÍNAS 
 
Variação da solubilidade depende da proporção dos grupos polares e apolares. 
Proteína solúvel: interação proteína-água 
Proteína insolúvel: interação proteína-proteína 
 
RECIPITAÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
Podem precipitar proteínas sem desnaturá-las: 
 
 Variação de pH 
 Alterações da força iônica do meio 
 Ação de solventes orgânicos à baixa temperatura 
 
Quando o pH varia: os radicais dos aa se dissociam e no ponto isoelétrico a força de atração 
eletrostática é máxima, tendendo a precipitar a proteína 
 
“SALTING-IN” e “SALTING-OUT” 
 
- influência de sais neutros em função da força iônica (proteínas não sofrem desnaturação) 
 
concentração reduzida de sal – “SALTING-IN” - solúvel 
diminui interação proteína-proteína (proteína- fica solúvel) 
 
concentração aumentada de sal – “SALTING-OUT” – insolúvel 
tira água de solvatação, aumenta interação proteína-proteína (proteína- fica insolúvel) 
 
 11 
IMPORTÂNCIA: diferentes concentrações de sal podem ser usadas para separar 
(precipitar/salting-out) diferentes proteínas 
 
REAÇÕES DE COLORAÇÃO 
 
São possíveis devido à presença de: 
 
GRUPOS AMINO 
LIGAÇÕES PEPTÍDICAS 
 
Reação com NINHIDRINA (aa) – coloração púrpura grupos amino 
 
Reação do BIURETO (oligo/peptídeos) – coloração lilás grupos de ligações peptídicas 
 
 
RELATÓRIO – caracterização de proteínas 
 
O relatório de aulas práticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As 
questões que se seguem devem ser abordadas no relatório. 
 
1. Quais os fundamentos das reações de coloração, as quais envolvem ninhidrina e sulfato 
de cobre? 
 
2. Qual a é importância das reações de precipitação de proteínas por reagentes para 
alcalóides e por sais de metais pesados?3. Explique os mecanismos que levam uma proteína a se dissolver quando há um pequeno 
aumento na força iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína precipitar 
quando há um grande aumento na força iônica da solução. 
 
4. As solubilidades de duas proteínas em função da concentração de sulfato de amônio 
estão mostradas no diagrama abaixo. Como esta observação pode ser usada para separar 
as proteínas A e B? 
 
 
 
 
 
 
 
 
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BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 3 
ESPECTROFOTOMETRIA: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE 
PROTEÍNAS 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- abordar a espectrofotometria como método analítico para se determinar a concentração de 
soluções 
 
Objetivos específicos: 
- elaborar curva de calibração de acordo com o método espectrofotométrico 
- determinar diferentes concentrações de proteínas em amostra-problema 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REAGENTES 
 
Solução padrão de proteína (albumina bovina) 5 mg/mL 
Amostra problema 
Reagente de Biureto 
 
B. TÉCNICA 
 
A. CURVA DE CALIBRAÇÃO 
 
1. Organizar uma bateria com seis tubos e ensaio 
2. Identificá-los com números de 1 a 6 
3. Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 
 Tubos 
Regentes (mL) 
1 2 3 4 5 6 
Solução padrão de proteína (5mg/mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - 
Reagente de Biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 
 
4. Agitar os tubos e deixar em repouso por 10 minutos 
5. Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância em 540 nm 
6. Determinar a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 e anotar na tabela abaixo 
 
Tubos 1 2 3 4 5 6 
Absorbância 1 branco 
 
B. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM AMOSTRA PROBLEMA 
 
1. Separar dois tubos de ensaio 
2. Identificá-los como tubo A e tubo B 
3. Adicionar os reagentes conforme abaixo, considerando que o volume da amostra a ser 
analisada será de 1mL. 
 
Reagentes (mL) 
Tubos 
A B* 
Amostra 1,0 0,5 
Água destilada - 0,5 
Reagente de Biureto 5,0 5,0 
 13 
 
4. Agitar os tubos e deixar em repouso por 10 minutos. 
5. Utilizar o tubo 1 do experimento A para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância em 
540 nm. 
6. Determine a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras problema 
utilizando a curva de calibração (próxima aula no Laboratório de Informática). 
7. Calcule a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras problema utilizando 
a relação AD/AP = CD/CP. Considere a absorbância do padrão de concentração igual a 
3mg/mL (tubo 4) do experimento A (curva de calibração). 
 
(* Anotar fator de diluição da amostra = __________ ) 
 
 
Tubos A B 
Absorbância 1 
 
 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade dos solutos 
absorverem luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida permite 
inferir sobre a concentração do soluto em determinada solução ou material biológico. 
 Este método físico é conhecido também por fotometria ou colorimetria, e é indicado 
para se determinar a concentração de solutos normalmente corados como também dos 
incolores, mas passíveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. 
Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros característicos ao 
ultravioleta, visível ou do infravermelho. As concentrações de soluções de compostos 
conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absorção em um ou mais comprimentos 
de onda. Reações enzimáticas podem ser frequentemente seguidas medindo-se 
espectroscopicamente o aparecimento ou desaparecimento de substrato. 
 O aparelho utilizado é o espectrofotômetro e os componentes principais são: 
A. fonte luminosa (energia radiante); B. dispositivo de focalização (colimador), o qual 
transmite um intenso feixe retilíneo de luz; C. monocromador (prisma ou grade) utilizado na 
resolução da radiação emitida pela fonte luminosa em seus vários comprimentos de onda 
(); D. dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado; E. compartimento para 
a amostra contida em um tubo de ensaio ou cubeta; F. detector com célula fotoelétrica; G. 
medidor elétrico (galvanômetro) para registrar a intensidade de energia captada pelo 
detector. 
 O monocromador permite selecionar o comprimento de onda ou faixa de 
comprimentos de onda que incide sobre a solução, usando-se um prisma ou um filtro ótico 
(vidro colorido). O prisma apresenta maior poder de resolução, permitindo análises tanto na 
região do visível quanto do ultravioleta – caso do espectrofotômetro. O filtro ótico deixa 
passar faixas de comprimentos de onda e é de uso limitado à região do visível – caso do 
fotocolorímetro, uma versão simplificada do espectrofotômetro. 
 As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela combinação de duas leis: 
- Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa 
através de um meio absorvente (sólido ou líquido), 
porções iguais deste meio irão absorver luz. 
- Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à 
concentração do soluto na solução. 
 Da conjunção das duas leis tem-se a Lei de 
Lambert-Beer, sendo que através dessa lei 
intensidades da radiação incidente e emergente 
podem ser relacionadas com as concentrações do 
material presente na solução. 
 Deve-se levar considerar que: 
Fig. 1 - Diagrama da absorção de um feixe 
de luz atravessando uma cubeta de 
tamanho l. 
 
 14 
1. São considerados desprezíveis os efeitos de reflexão, refração e espalhamento 
2. A radiação incidente deve ser monocromática 
Assim, de acordo com a Figura 1, I0 e I são, respectivamente, as intensidades da radiação 
incidente e transmitida pela amostra. Muitas vezes, a intensidade transmitida decai 
exponencialmente com o aumento do caminho percorrido na solução (comprimento l da 
Figura 1), e também com o aumento da concentração c: 
 
log I0/I =  l c 
 
sendo c a concentração do material em estudo, l o comprimento interno do recipiente que 
contém a solução e  () o coeficiente de extinção ou absortividade ou coeficiente de 
absorção, um fator característico da substância absorvedora (e o solvente), que depende do 
comprimento de onda da radiação. 
 A grandeza que medimos experimentalmente é a absorbância A, e equivale ao 
logaritmo da razão entre a intensidade incidente e a transmitida: 
 
A = log I0 / I sendo que A =  l c 
 
O logarítmo da relação inversa I / I0 (intensidade transmitida/ intensidade incidente) 
também é mensurável e definido como transmitância T: 
 
T = log I / I0  T = 10-  
l c 
 
Desta forma, destaca-se que: 
 
A =  l c 
 
A absorbância é, portanto proporcional à concentração e à espessura da solução. 
A constante  ou coeficiente de extinção corresponde à absorbância de uma solução 
de concentração unitária, por unidade de distância percorrida pela luz incidente. Quando a 
concentração (c) é expressa em mol/L e a espessura (l) é expressa em centímetros. 
 A absorbância e transmitância são lidas em escalas duplas no espectrofotômetro. A 
absorbância é lida em escala logarítmica enquanto que a transmitância é lida em 
porcentagem em uma escala linear de o a 100%. 
 
Estabelece-se a seguinte relação: 
 
A = log I0 / I  log 100/I  log 100 – log I  2 – log I 
 
 Então: 
 Quando I0 = 100% A = 2 – log I 
 Quando I = 1 A = 2 
 Quando I = 100% A = 0 
 Quando I = zero A =  
 
 A transmissão é medida em termo de luz incidente e luz emergente mas, na 
realidade, os instrumentos não medem luz incidente uma vez que, se ela for considerada 
para efeito e cálculo, a solução absorvente parecerá mais concentrada do que realmente é, 
devido à absorção do tubo (cubeta) e dos outros reagentes eventualmente utilizados. Por 
isso, é necessário descontar todas as interferências possíveis durantea medida da 
absorbância de um soluto específico. Para tanto, faz-se a calibração do espectrofotômetro 
com uma solução contendo um sistema como o estudado, exceto o composto de análise, 
em um tubo (cubeta) igual àquele que contém a solução-problema. Este tubo é conhecido 
como “branco” e com ele calibra-se o instrumento para 100% de transmitância o que 
significa zero e absorbância. 
Moléculas de substâncias diferentes têm diferentes níveis moleculares de energia, 
por isso cada substância absorve a radiação de maneira peculiar. Dito de outra forma, os 
 15 
comprimentos de onda que certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, 
enquanto outras substâncias absorverão outros comprimentos de onda. Se levantarmos 
dados referentes a intensidade de luz absorvida por uma substância, em função dos 
comprimentos de onda da radiação, estaremos obtendo uma curva chamada espectro de 
absorção da substância. O importante é que cada substância tem um espectro característico 
e, desse modo, se quisermos identificar um material desconhecido, poderemos fazê-lo a 
partir de sua curva de absorção, que pode ser construída testando-se as absorbâncias em 
diferentes comprimentos de onda em um espectrofotômetro. 
Portanto a seleção do comprimento de onda (λ) a ser utilizado nos métodos de 
quantificação de substâncias (exemplo: determinação da concentração de proteínas pelo 
método do biureto que utiliza λ igual a 540nm) é feita de acordo com a sensibilidade 
máxima, isto é, quando há maior alteração na absorbância por unidade modificada na 
concentração. 
 
CURVA PADRÃO OU DE CALIBRAÇÃO 
 
 A determinação da concentração de um soluto em uma solução-problema pelo 
método espectrofotométrico envolve a comparação da absorbância da solução-problema 
com uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral é 
utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações que têm sua absorbância 
determinada. Com os valores de absorbância e concentração conhecidos pode-se traçar um 
gráfico cujo perfil é conhecido como “curva de calibração” ou “curva-padrão”. 
A reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a proporcionalidade 
entre o aumento da concentração e da absorbância. A porção linear da reta corresponde ao 
limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão. Caso os 
valores de absorbância das amostras de concentração desconhecida estejam fora do limite 
de sensibilidade do método, estes valores devem ser desconsiderados, repetindo-se o 
experimento com a amostra mais diluída, no caso de absorbâncias superiores ao limite 
máximo da curva ou mais concentrada, no caso de absorbâncias inferiores ao limite mínimo 
da curva de sensibilidade. Pois valores fora da sensibilidade não permitem confiabilidade na 
concentração final resultante. 
Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbância da amostra-
problema no gráfico da curva de calibração pode-se, por projeção, determinar a 
concentração do soluto. Isto só será válido se a absorbância, tanto do padrão quanto da 
solução-problema for determinada utilizando-se as mesmas condições experimentais 
[comprimento de onda (λ), espessura (l) e coeficiente de extinção molar (α)]. 
Considerando-se então duas soluções, padrão (P) e desconhecida (D), temos: 
 
A
P
 = α . l . C
P AD = α . l . CD 
 
Como α e l são iguais para as duas situações: 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO – espectrofotometria 
 
O relatório de aulas práticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As 
questões que se seguem devem ser abordadas no relatório. 
 
1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica? 
 
2. O que significa faixa de sensibilidade do método espectrofotométrico e como ela é 
determinada? 
 
 16 
3. Que critério deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda para uma 
técnica espectrofotométrica? 
 
4. Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”? 
 
5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta um 
máximo de absorção em 545nm e para uma concentração de 3mg/mL foi obtida uma 
absorbância de 0,22, calcule a concentração deste composto correspondente a uma 
absorbância de 0,15, sabendo-se que o limite de sensibilidade do método utilizado é de 0,5 
a 5mg/mL. 
 
 
 
 
 
 
 17 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 4 
LABORATÓRIO DE INFORMÁTICA: CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO 
PARA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS 
(ESPECTROFOTOMETRIA) 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- aprender a construir curvas de calibração no programa Excel®, utilizando-se de 
ferramentas para conferir a confiabilidade da curva 
 
Objetivos específicos: 
- elaborar curva de calibração para determinar a concentração de proteínas das amostras 
problema da aula anterior 
- relembrar cálculos de concentrações 
- resolver exercícios 
 
CÁLCULOS DE CONCENTRAÇÃO 
 
Calcular a concentração em cada um dos tubos da curva de calibração, de acordo com a 
tabela utilizada para a construção da curva (aula 3 - espectrofotometria): 
 
TABELA UTILIZADA PARA CONSTRUIR A CURVA DE CALIBRAÇÃO 
 
 Tubos 
Regentes (mL) 
1 2 3 4 5 6 
Solução padrão de proteína (5mg/mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - 
Reagente de Biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 
 
Cálculos de concentração para o tubo 3, por exemplo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ci . Vi = Cf . Vf 
 
5 mg/mL 0,4 mL = Cf (?) . 1 mL (0,6 + 0,4mL) 
 
5 x 0,4 = Cf 
 1 
 
Cf = 2 mg/mL 
 18 
 
ROTEIRO PARA UTILIZAR O EXCEL® 
 
1. Após encontrar as concentrações de proteína para cada tubo da curva de calibração 
deve-se correlacioná-las com a absorbância e cada tubo. Inserindo estes dados numa 
planilha do Excel, como se segue: 
 
TUBO [ ] mg/mL ABS. (nm) 
1 0 0,000 
2 1 0,07 
3 2 0,15 
4 3 0,23 
5 4 0,31 
6 5 0,39 
 
2. Selecionar primeiramente a coluna [ ] mg/mL (eixo de X, abscissa) e depois a coluna ABS. 
(nm) (eixo de Y, ordenada). 
Para selecionar as colunas: pressionando o botão esquerdo do mouse arraste-o sobre a 
primeira coluna a ser selecionada e então pressionando a tecla CTRL seleciona-se a outra 
coluna. 
 
3. Com as colunas selecionadas solicita-se que o programa monte o gráfico: 
a. No menu INSERIR selecione a opção GRÁFICO 
b. No ASSISTENTE DE GRÁFICO selecione: Tipo de gráfico DISPERSÃO e o 
subtipo DISPERSÃO COM PONTOS DE DADOS CONECTATO POR LINHA SUAVES e 
clique em AVANÇAR 
c. A opção Intervalo de dados deve estar selecionada na opção SÉRIES EM 
COLUNAS e então clique em AVANÇAR 
d. Preencha os dados do seu gráfico, clicando nas diferentes fichas que estão 
disponíveis: TÍTULO (título do gráfico, eixo X e eixo Y); EIXOS (preencha as duas 
quadrículas de opções para que pareçam os dois eixos); LINHAS DE GRADE (desmarque 
todas as quadrículas); LEGENDA (desmarque a quadrícula de legenda); RÓTULOS DE 
DADOS (deixe todas as quadrículas desmarcadas também) e finalmente clique em 
AVANÇAR e depois CONCLUIR 
e. Selecione o quadro cinza do gráfico resultante e delete apertando a tecla DELETE 
no teclado 
 
4. Clique na curva do gráfico resultante com o botão direito do mouse e então clique na 
opção ADICIONAR LINHA DE TENDÊNCIA: 
 a. selecione o tipo LINEAR na ficha TIPO 
 b. e na ficha OPÇÕES selecione as três últimas quadrículas (Definir interseção = 0, 
Exibir equação no gráfico e Exibir o valor de R-quadrado no gráfico) e clique em OK 
 c. Então, utilizando-se da equação do gráfico verifique a confiança através da análise 
do valor de R-quadrado exibido. Quanto mais próximo de +1 o valor do R2, mais confiável 
está sua curva de calibração. 
 
 Partindo da equação do gráfico é possível descobrir a concentração da amostra 
problema, pois: 
 y = ax + b, logo y corresponde ao valor de absorbância da amostra problema, 
enquanto o valor de x será correspondente à concentração da amostra problema. Portanto 
basta colocar o valor da absorbância da amostra problema e isolar x, desta forma encontra-
se a concentração da amostra em questão. Posto que a equação gerada pelo programa 
Excel nos permite obter os valores de a e b. Sendo que o valor de b não foi gerado devido a 
opção Definir interseção = 0 que obriga que a curva passe no ponto e origem, desta forma 
a curva cruza o eixo y em 0, logo b é zero. 
 
 
(Exemplo com valores hipotéticos de absorbância) 
 19 
EXERCÍCIOS 
 
1. Construa a curva padrão para os seguintes dados experimentais: 
 
Conc. (mg/mL) Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs 4 Abs 5 Abs Média (nm) 
1 0,08 0,07 0,09 0,05 0,06 
2 0,15 0,17 0,15 0,13 0,16 
3 0,23 0,25 0,22 0,26 0,21 
4 0,30 0,31 0,33 0,30 0,32 
5 0,37 0,40 0,40 0,35 0,44 
 
Considere que as absorbâncias, em triplicata, das amostras-problema foram: 
 
Amostra Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs Média (nm) 
A 0,09 0,07 0,08 
B 0,15 0,17 0,16 
C 0,31 0,33 0,32 
 
Sendo a amostra A, a amostra C diluída (fator de diluição = 4), calcule as concentrações das 
amostras A, B e C utilizando dois métodos: 
- da relação AD / AP = CD / CP 
- equação da reta obtida com a construção da curva-padrão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 5 
CINÉTICA ENZIMÁTICA I 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- entender como se dá a compreensão dos mecanismos de ação das enzimas, através do 
estudo da cinética enzimática, a qual permite determinar a velocidade da reação e como 
esta se altera em função das mudanças nos parâmetros experimentais 
 
Objetivo específico: 
- analisar o efeito da variação concentração da enzima e do tempo de incubação sobre a 
atividade enzimática 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REAGENTES 
 
1. Solução de enzima invertase a10% (v/v) 
2. Substrato: Sacarose 0,2 mol/L 
3. Solução tampão acetato 0,05 mol/L, pH 4,7 
4. Solução alcalina de 3,5-dinitro-salicilato 
5. Soluções pH 4, 5, 6, 7 e 8 
 
B. PREPARO DOS REAGENTES 
 
1. Solução de enzima invertase (0,1 mg proteína/mL): isolamento a partir de leveduras. 
Pesar 50 mg de leveduras secas (fermento de pão), suspender em 250 mL de bicarbonato 
de sódio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37ºC durante 6 horas, com agitação 
ocasional. Centrifugar o sobrenadante por 20 min. a 3.500 rpm. Coletar o sobrenadante, o 
qual contém a enzima ativa. Conservar a temperatura de 4ºC. Normalmente a concentração 
de enzimas para os ensaios é de 0,1 mg proteína/mL. 
 
2. Substrato: Sacarose 0,2 mol/L (68 g para 1L de água, balão volumétrico) usar esta 
solução para obter as soluções mais diluídas. 
 
3. Solução tampão acetato 0,05 mol/L, pH 4,7: Acetato de sódio 0,05 mol/L(A), ácido 
acético 0,05 mol/L (B). Misturar 150 mL da solução A e 300 mL da solução B. 
 
4. Solução alcalina de 3,5-dinitro-salicilato: dissolver sob aquecimento 5g de ácido 3,5-
dinitro-salicílico em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente dissolver sob aquecimento 
150 g de tartarato duplo de sódio e potássio em 250 mL de água destilada. Misturar as duas 
soluções e completar o volume para 500 mL com água destilada. 
 
 
 
ATENÇÃO!!! 
OS GRÁFICOS DESTA AULA, DEVERÃO SER PLOTADOS NA AULA NO LABORATÓRIO 
DE INFORMÁTICA 
 
 
 21 
C. TÉCNICA 
 
1. EFEITO DA VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA 
 
Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6 e adicionar os 
reagentes de acordo com a tabela: 
 
ATENÇÃO: A ENZIMA É SEMPRE A ÚLTIMA ADIÇÃO!! 
REAGENTES (mL) 
TUBOS 
1 2 3 4 5 6 
1 Tampão acetato (0,05 mol/L pH4,7) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
2 Água destilada 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 - 
3 Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
4 Solução de Enzima (0,1 mg/mL) - 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0 
5 Banho-maria a 25°C por 5 minutos 
6 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
7 Banho-maria 100ºC por 5 minutos e deixar resfriar por 5 minutos 
8 Água destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 
 
9. Calibrar o espectrofotômetro a 540nm com o TUBO 1 
10. Proceder a leitura das absorbâncias dos demais tubos 
11. Trace o gráfico: concentração de enzima (g/mL) X absorbância (Obs. Utilize a 
relação C1.V1=C2.V2, para encontrar a concentração final de enzima (proteína) em cada 
tubo, sendo o volume final (V2) igual a 2,5mL. Interprete os resultados) 
 
TUBOS 1 2 3 4 5 6 
ABSORBÂNCIA branco 
 
 
2. EFEITO DA VARIAÇÃO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO 
 
Organizar uma bateria de 5 tubos de ensaio, numerando de 1 a 5 e adicionar os 
reagentes de acordo com a tabela: 
 
ATENÇÃO: A ENZIMA É SEMPRE A ÚLTIMA ADIÇÃO!! 
REAGENTES (mL) 
TUBOS 
1 2 3 4 5 
1 Tampão acetato (0,05 mol/L pH4,7) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
2 Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 
3 Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
4 Solução de Enzima (0,1 mg/mL) - 0,2 0,2 0,2 0,2 
5 Banho-maria a 25°C durante os tempos indicados abaixo para os tubos 2, 3, 4 e 5 
6 TEMPO (min) - 0 5 10 15 
7 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
8 Banho-maria 100ºC por 5 minutos e deixar resfriar por 5 minutos 
9 Água destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 
 
10. Calibrar o espectrofotômetro a 540nm com o TUBO 1 
11. Proceder a leitura das absorbâncias dos demais tubos 
12. Trace o gráfico: tempo (min) X absorbância e interprete os resultados 
 
TUBOS 1 2 3 4 5 
ABSORBÂNCIA branco 
 
 
 22 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 6 
CINÉTICA ENZIMÁTICA II 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- entender como se dá a compreensão dos mecanismos de ação das enzimas, através do 
estudo da cinética enzimática, a qual permite determinar a velocidade da reação e como 
esta se altera em função das mudanças nos parâmetros experimentais 
 
Objetivo específico: 
- analisar o efeito da variação o pH e da concentração de substrato sobre a atividade 
enzimática 
- enfatizar a importância do estudo da cinética enzimática para aplicação da ação das 
enzimas 
 
EXPERIMENTO 
 
TÉCNICA 
 
3. EFEITO DA VARIAÇÃO DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
 
 Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6 e adicionar os 
diferentes tampões e os demais reagentes conforme a tabela: 
 
ATENÇÃO: A ENZIMA É SEMPRE A ÚLTIMA ADIÇÃO!! 
 
REAGENTES (mL) 
TUBOS 
1 2 3 4 5 6 
1 
Tampão acetato (0,05 
mol/L pH 4,0) 
1,0 1,0 - - - - 
2 
Tampão acetato (0,05 
mol/L pH 5,0) 
- - 1,0 - - - 
3 
Tampão fosfato (0,05 
mol/L pH 6,0) 
- - - 1,0 - - 
4 
Tampão fosfato (0,05 
mol/L pH 7,0) 
- - - - 1,0 - 
5 
Tampão fosfato (0,05 
mol/L pH 8,0) 
- - - - - 1,0 
6 Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 
7 
Sacarose 
(0,2 mol/L) 
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
8 
Solução de Enzima 
(0,1 mg/mL) 
- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 
9 Banho-maria a 25°C por 5 minutos 
10 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
11 Banho-maria fervente por 5 minutos e resfriar por 5 minutos 
12 Água destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 
 
13. Calibrar o espectrofotômetro a 540nm com o TUBO 1 
14. Proceder a leitura da absorbância dos demais tubos 
15. Trace o gráfico: variação do pH X absorbância e interprete o resultado 
 
TUBOS 1 2 3 4 5 6 
ABSORBÂNCIA branco 
 23 
 
4. EFEITO DA VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO 
 
 Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6. Adicionar os 
reagentes de acordo com a tabela: 
 
ATENÇÃO: A ENZIMA É SEMPRE A ÚLTIMA ADIÇÃO!! 
 
REAGENTES (mL) 
TUBOS 
1 2 3 4 5 6 
1 
Tampão acetato 
(0,05 mol/L pH 4,7) 
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
2 Água destilada 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 
3 
Sacarose (0,01M) 
4mM 
- 1,0 - - - - 
4 
Sacarose (0,02M) 
8mM 
- - 1,0 - - - 
5 
Sacarose (0,05M) 
20mM 
- - - 1,0 - - 
6 
Sacarose (0,1M) 
40 mM 
- - - - 1,0 -7 
Sacarose (0,2M) 
80mM 
- - - - - 1,0 
8 
Solução de Enzima 
(0,1 mg/mL) 
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 
9 Banho-maria a 25°C por 5 minutos 
10 3,5 dinitro-salicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
11 Banho-maria fervente por 5 minutos e resfriar por 5 minutos 
12 Água destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 
 
13. Calibrar o espectrofotômetro a 540nm com o TUBO 1 
14. Proceder a leitura da absorbância dos demais tubos 
15. Trace o gráfico: concentração final de substrato (mM) X absorbância 
16. Trace o gráfico Duplo-Recíproco e calcule o Km (constante de Michaelis) 
 
TUBOS 1 2 3 4 5 6 
ABSORBÂNCIA branco 
 
Interprete os resultados 
 
 24 
 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
TÉCNICA 
 A invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da molécula de sacarose. As 
unidades de hexose resultantes (-D-glucose e -D-frutose), em meio alcalino e a quente, 
formam enedióis que cedem elétrons para reduzir o reagente 3,5-di-nitrosalicilato (DNS) (de 
cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitrosalicilato (de cor laranja-marrom forte). Cada mol de 
açúcar redutor presente na solução formará 1 mol de 3-amino-5-nitrosalicilato. Portanto, 
pela determinação da luz absorvida a 540nnm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, pode-se 
determinar a concentração de açúcar redutor presente na solução. 
 A sensibilidade da técnica de determinação de açúcar redutor pelo DNS é de 1-
20mols de glucose. 
 
Fig. 1 – Hidrólise da sacarose pela enzima invertase 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2 – Reação de detecção dos produtos da hidrólise da sacarose empregando o 3,5-di-nitrosalicilato 
 25 
 
CINÉTICA ENZIMÁTICA 
 Enzimas são proteínas catalisadoras de reações que sob condições naturais seriam 
muito lentas. O aumento da velocidade de uma reação se deve à diminuição da energia livre 
de ativação. O estudo da velocidade das reações químicas chama-se cinética e a cinética 
enzimática tem por objetivo a compreensão do mecanismo de ação das diferentes enzimas 
e da velocidade das reações por elas catalisadas. Este estudo avalia também as alterações 
na velocidade da reação em resposta a modificações de parâmetros experimentais, como a 
concentração do substrato, o tempo de incubação, a temperatura de incubação ou a 
variação de pH. A quantidade de enzima utilizada em experimentos é indicada como 
“unidades de enzima” e é definida como “a quantidade de enzima necessária para 
transformar 1mol de substrato em produto por minuto e sob condições adequadas”. Esta 
definição é dita “Unidade Internacional” ou simplesmente “Unidade”. A atividade pode ser 
também definida como a “atividade específica” em que se considera a relação entre 
unidades de enzima e a quantidade de proteína. 
Atividade enzimática específica = unidade/mg de proteína 
Atividade enzimática específica = mols de produto/minuto/mg de proteína 
 
 Em 1913 Leonor Michaelis e Maud L. Menten propuseram uma teoria geral para a 
atividade enzimática, em que: 
Enzima + Substrato  Complexo Enzima-Substrato  Enzima + Produto 
 
E + S  [ES]  E + P 
 
 Um procedimento comum para se determinar a velocidade de uma reação 
enzimática consiste em se misturar enzima com substrato e se observar a formação de 
produto imediatamente após se fazer a mistura. Desta forma, evita-se a interferência da 
variação da concentração do substrato e tem-se que a concentração deste será muito 
próxima do valor inicial. Esta situação aplicada a um experimento cinético permite a medida 
da velocidade inicial (V0) da reação, quando [S] é geralmente muito maior que [E], ou seja, 
pode-se considerar a concentração de substrato como sendo sempre saturante. 
 O estudo do efeito da variação da [S] na velocidade inicial da reação, quando [E] e 
tempo de incubação são constantes, fornece um gráfico com um perfil de hipérbole 
retangular perfeita: 
 Analisando o gráfico para a condição: concentração de enzima constante X aumento 
da concentração de substrato 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 – Efeito da concentração do substrato 
sobre a velocidade da reação (Km = constante 
de Michaelis-Menten) 
 
 
 
 26 
 
Em baixa concentração de substrato [S] tem-se quase toda a enzima na forma livre e 
a velocidade será proporcional à concentração de substrato porque o equilíbrio de E + S  
ES será deslocado para ES à medida que [S] aumenta. A velocidade máxima (Vmáx) desta 
reação será atingida quando toda a E está presente como ES e a concentração de enzima 
livre, [E], é infinitamente pequena. Nestas condições E está saturada por S e cada molécula 
de enzima estará catalisando a formação de produto tão rapidamente quanto as condições 
experimentais o permitirem. Neste caso, qualquer aumento em [S] exercerá um efeito 
desprezível sobre Vmáx. Esta condição existirá quando [S] for suficientemente elevada para 
que toda E esteja na forma de ES. Quando E é inicialmente misturada com um excesso de 
S, há um período inicial de aumento da concentração de ES. Esta etapa é geralmente muito 
rápida para ser facilmente detectada. A reação então atinge um estado no qual a [ES] 
permanece aproximadamente constante num certo período de tempo. Este é o período onde 
a velocidade da reação é conhecida como Velocidade Inicial (v0) relativa a Vmáx. 
 O tratamento matemático da reação E + S  [ES]  E + P permitiu o 
desenvolvimento da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
 
 Em que: 
 Km é conhecida como constante de Michaelis e representa concentração de 
substrato necessária para se atingir a metade da velocidade máxima. Km é expressa em 
mols de substrato por litro de solução. 
 Uma vez que no plot de Michaelis-Menten os valores de Vmáx e Km não podem ser 
precisamente determinados, em 1934, H. Lineweaver e D. Burk desenvolveram um 
tratamento adequado à sua determinação. Este tratamento considera o inverso da 
concentração de substrato (1/[S]), ou seja, é a recíproca do plot de Michaelis-Menten. 
Obtém-se então uma equação linear na forma y = mx + n cnhecida como Equação de 
Linewever-Burk ou Equação do Duplo-recíproco. 
 
 
 
 
 
Analisando a equação em relação ao gráfico (Figura 2): 
y = 1/Vmáx 
mx = Km/Vmáx . [S] 
n = 1/Vmáx (intersecção) 
m = Km/Vmáx (inclinação da reta) 
Abcissa é dada por 1/[S] 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2 – Gráfico do duplo-recíproco: 1/v0 é posto 
em gráfico como função de 1/[S]. A inclinação é 
Km/Vmáx, intersecção com o eixo vertical é 
1/Vmáx, e a intersecção com o eixo horizontal é 
-1/Km. 
 
 
 
 Quando 1/v0 = zero (ou y = zero) tem-se que 1/[S] = -1/Km 
 27 
 
 O valor numérico de Km é de interesse por diversas razões: 
- Km é uma constante particular de cada enzima para um determinado substrato e 
seu valor fornece um meio de comparação entre as enzimas; 
- um variação no valor real de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular 
a atividade enzimática; 
- quando se conhece Km, pode-se ajustar as condições experimentais para se obter 
[S] >> Km e se determinar a velocidade máxima da reação; 
- Km indica a interação de substratos alternativos para uma determinada enzima. O 
substrato com menor valor de Km tem uma afinidade maior para a enzima; 
- Km permite avaliar se a um nível intracelular de substrato a enzima estará ativa. 
 
 
 
MOTTA, V.T. Bioquímica Básica: Enzimas, Capítulo 3. Autolab Análises Clínicas; p. 68-101, 2000-2004. In: 
 
 
RELATÓRIO – cinética enzimática I e II 
 
O relatório deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questões devem estar 
respondidas e/ou abordadas no relatório (as questões que não forem abordadas no corpo 
do relatório deverão estar apresentadas em ANEXO): 
 
1. Descreva a ação enzimática da invertase. 
2. Como se pode determinar a concentração dos produtos da reação catalisada pela 
invertase? 
3. Qual o Km obtido para a invertasee qual o seu significado? 
4. Qual o pH ótimo determinado para a invertase e qual o seu significado? 
5. Pesquise a importância de se compreender os mecanismos de ação das enzimas e 
correlacione este fato com o uso industrial destas proteínas. 
 
ATENÇÃO AOS GRÁFICOS QUE FORAM SOLICITADOS E ÀS SUAS INTERPRETAÇÕES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 28 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 7 
LABORATÓRIO DE INFORMÁTICA: ENZIMOLOGIA 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- demonstrar o estudo da cinética enzimática utilizando-se os dados obtidos dos 
experimentos realizados nas aulas 8 e 9 com a enzima invertase (enzima modelo) 
 
Objetivos específicos: 
- analisar do efeito da variação da concentração de enzima, do tempo de incubação, do pH 
e da concentração de substrato sobre a atividade enzimática após traçar os gráficos que 
correlacionam a velocidade inicial com estes parâmetros experimentais 
- traçar o gráfico duplo-recíproco da variação experimental concentração de substrato 
- relembrar e aprimorar os conceitos e métodos da utilização do programa Excel na 
produção de plotagens gráficas 
 
ATIVIDADES 
 
Utilizando-se dos dados obtidos nas aulas anteriores 5 e 6: 
 
A. Traçar o gráfico: Concentração de Enzima (g/mL) X Absorbância* (nm) 
 
GRÁFICO 1 – EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA NA VELOCIDADE INICIAL DA 
REAÇÃO DE HIRÓLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 
 
*Absorbância equivale a Velocidade Inicial (V0) 
 
1. Encontrar a concentração da enzima em cada um dos tubos de ensaio e correlacioná-las 
com a absorbância e cada um. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se 
segue: 
 
TUBO [E] g/mL ABS. (nm) 
1 0 0,000 
2 4 0,161 
3 8 0,373 
4 16 0,798 
5 32 1,500 
6 40 1,990 
 
 
2. Selecionar primeiramente a coluna [E] g/mL (eixo de X, abscissa) e depois a coluna 
ABS. (nm) (eixo de Y, ordenada). 
Para selecionar as colunas: pressionando o botão esquerdo do mouse arraste-o sobre a 
primeira coluna a ser selecionada e então pressionando a tecla CTRL seleciona-se a outra 
coluna. 
 
3. Com as colunas selecionadas solicita-se que o programa monte o gráfico: 
a. No menu INSERIR selecione a opção GRÁFICO 
b. No ASSISTENTE DE GRÁFICO selecione: Tipo de gráfico DISPERSÃO e o 
subtipo DISPERSÃO COM PONTOS DE DADOS CONECTATOD POR LINHA SUAVES e 
clique em AVANÇAR 
c. A opção Intervalo de dados deve estar selecionada na opção SÉRIES EM 
COLUNAS e então clique em AVANÇAR 
d. Preencha os dados do seu gráfico, clicando nas diferentes fichas que estão 
disponíveis: TÍTULO (título do gráfico, eixo X e eixo Y); EIXOS (preencha as duas 
Ci . Vi = Cf . Vf 
 
0,1mg/mL 0,1mL = Cf . 2,5mL 
 
0,1 0,1 = Cf 
 2,5 
 
Cf = 0,004 mg/mL = 4 g/mL 
 29 
quadrículas de opções para que pareçam os dois eixos); LINHAS DE GRADE (desmarque 
todas as quadrículas); LEGENDA (desmarque a quadrícula de legenda); RÓTULOS DE 
DADOS (deixe todas as quadrículas desmarcadas também) e finalmente clique em 
AVANÇAR e depois CONCLUIR 
e. Selecione o quadro cinza do gráfico resultante e delete apertando a tecla DELETE 
no teclado 
 
4. Compare o gráfico resultante com o modelo do gráfico teórico que relaciona a 
Concentração de Enzima com a Velocidade da reação enzimática e então interprete e 
discuta os resultados. 
 
B. Traçar o gráfico: Tempo (min) X Absorbância 
 
GRÁFICO 2 – EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO DA ENZIMA A 25ºC NA 
VELOCIDADE INICIAL DA REAÇÃO DE HIRÓLISE CATALISADA PELA ENZIMA 
INVERTASE 
 
1. Relacionar os tempos de incubação da enzima com as absorbâncias de cada um dos 
tubos de ensaio. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue: 
 
TUBO TEMPO (min.) ABS. (nm) 
1 _ 0,000 
2 0 0,784 
3 5 0,788 
4 10 0,789 
5 15 0,789 
 
2. Selecionar primeiramente a coluna TEMPO (min.) (eixo de X, abscissa) e depois a coluna 
ABS. (nm) (eixo de Y, ordenada). 
Seguem-se então as mesmas orientações para o GRÁFICO 1 (Pontos 2 e 3). 
 
3. Compare o gráfico resultante com o modelo do gráfico teórico que relaciona o Tempo e 
incubação com a Velocidade da reação enzimática e então interprete e discuta os 
resultados. 
 
C. Traçar o gráfico: Variação do pH X absorbância 
 
GRÁFICO 3 – EFEITO DA VARIAÇÃO DO pH NA VELOCIDADE INICIAL DA REAÇÃO 
DE HIRÓLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 
 
1. Relacionar a ABS. encontrada em cada tubo com seus respectivos valores de pH. 
Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue: 
 
TUBO pH ABS. (nm) 
1 _ 0,000 
2 4 0,391 
3 5 0,558 
4 6 0,320 
5 7 0,093 
6 8 0,072 
 
2. Seguem-se então as mesmas orientações para o GRÁFICO 1 e 2. 
3. Compare o gráfico resultante com o modelo do gráfico teórico que relaciona a Variação 
de pH com a Velocidade da reação enzimática e então interprete e discuta os resultados. 
 
D. Traçar o gráfico: Concentração final de substrato (mmol/L) X absorbância 
 
 30 
GRÁFICO 4 – EFEITO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE SUBSTRATO NA VELOCIDADE 
INICIAL DA REAÇÃO DE HIRÓLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 
 
1. As concentrações de substrato já constam na tabela do roteiro de aula prática, mas caso 
não estivesse elas poderiam ser calculadas da mesma forma que no Gráfico 1 para a 
concentração de enzima. Portanto, basta correlacionar as concentrações de substrato com 
as absorbâncias de cada um dos tubos. Insira estes dados numa planilha do Excel, como 
segue: 
 
TUBO [S] (mM) ABS. (nm) 
1 0 0,000 
2 4 0,045 
3 8 0,083 
4 20 0,245 
5 40 0,364 
6 80 0,450 
 
2. Seguem-se então as mesmas orientações para os gráficos 1, 2 e 3. 
3. Compare o gráfico resultante com o modelo do gráfico teórico que relaciona a 
Concentração de substrato com a Velocidade da reação enzimática e então interprete e 
discuta os resultados. 
 
E. Traçar o gráfico Duplo-Recíproco da concentração final de substrato X absorbância 
(V0). Não esquecer de inverter os valores de [S] (1/[S]) e Absorbância (1/Abs. = 1/V0). 
 
GRÁFICO 5 – DUPLO-RECÍPROCO DO EFEITO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE 
SUBSTRATO NA VELOCIDADE INICIAL DA REAÇÃO DE HIRÓLISE CATALISADA 
PELA ENZIMA INVERTASE 
 
1. Deve-se inverter a concentração de substrato e os valores de absorbância e então 
coloca-los na planilha do Excel: 
 
TUBO 1/[S] mM 1/ABS. (nm) 
1 0 0,000 
2 0,2500 22,22 
3 0,1250 12,05 
4 0,0500 4,08 
5 0,0250 2,75 
6 0,0125 2,22 
 
2. Seguem-se então as mesmas orientações para os gráficos 1, 2, 3 e 4. 
3. Clique na curva do gráfico resultante com o botão direito do mouse e então clique na 
opção ADICIONAR LINHA DE TENDÊNCIA: 
 a. selecione o tipo LINEAR na ficha TIPO 
 b. e na ficha OPÇÕES selecione as duas últimas quadrículas (Exibir equação no 
gráfico e Exibir o valor de R-quadrado no gráfico) e clique em OK 
 c. Então, utilizando-se da equação do gráfico encontre a Vmáx e depois o Km, 
lembrando-se da equação de Lineweaver-Burk. 
 d. Lembre-se que o valor de Km é expresso em concentração, pois refere-se a 
concentração de substrato presente quando a Vo é igual a Vmáx pela metade. Por isso a 
concentração deve ser ajustada para mmol/L de solução, pois no experimento tínhamos um 
volume final de 10mL o eu equivale a 0,01L. 
 
 
 
 
 
 31 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 8 
CARACTERIZAÇÃO DE TRIACILGLICERÓIS 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- caracterizar lipídios de acordo com suas características físico-químicas, enfatizando a 
importância biológica destas moléculas 
 
Objetivos específicos: 
- identificar triacilgliceróis através de reações de hidrólise alcalina: reação de saponificação 
- evidenciar a formação dos produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades 
- identificar a presença de ácidos graxos insaturados por reação de halogenação 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REATIVOS 
- solução alcoólica de hidróxido de sódio: 1 volume de hidróxido de sódio a 40% e1 volume 
de etanol a 95% 
- óleos vegetais 
- ácido acético concentrado 
- solução de cloreto de cálcio a 10% 
- solução saturada de cloreto de sódio 
- éter etílico (H3C-CH2-O-CH2-CH3) 
- hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M 
 
 
B. TÉCNICA 
 
1. TESTE DE SOLUBILIDADE 
 
Colocar 20 gotas da amostra em cada um de 3 tubos de ensaio 
Acrescentar 2ml dos seguintes solventes: 
- primeiro tubo: água destilada 
- segundo tudo: éter etílico 
- terceiro tubo: hidróxido de sódio 0,1M 
 
Agitar, observar e anotar na tabela a solubilidade da amostra nos respectivos solventes: 
 
Tubo Solvente Solubilidade 
1 água destilada 
2 éter etílico 
3 hidróxido de sódio 
 
 
2. REAÇÃO DE SAPONIFICAÇÃO 
A. Em um tubo de ensaio grande colocar: 
- 30 gotas de óleo vegetal 
- 10mL de solução alcoólica de hidróxido de sódio 
B. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 min. 
 Nestas condições, o óleo é saponificado obtendo-se uma solução opalescente de 
sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol. 
 
 
 
 
 32 
 
3. PROPRIEDADES DOS SABÕES 
A partir da solução de sabões realizar os seguintes testes: 
 
ABAIXAMENTO DA TENSÃO SUPERFICIAL 
ERLENMEYER: adicionar 2mL de sabão a um erlenmeyer e adicionar água destilada 
(até ~20mL). Agitar a solução de sabões e verificar a formação de espuma. 
 
PRECIPITAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS 
TUBO 1: a um tubo de ensaio adicionar 1mL de sabão e depois adicionar gota a gota 
ácido acético concentrado (na capela) até notar o aparecimento de um precipitado branco 
de ácidos graxos, que são insolúveis devido ao seu baixo grau de dissociação. 
 
PRECIPITAÇÃO DE SABÕES DE CÁLCIO 
TUBO 2: ao segundo tubo de ensaio adicionar 1mL de sabão e depois adicionar 
cloreto de cálcio a 10% gota a gota até notar o aparecimento de um precipitado de sabões 
de cálcio 
 
PRECIPITAÇÃO POR EXCESSO DE ELETRÓLITOS 
TUBO 3: ao terceiro tubo de ensaio adicionar 1mL de sabão e igual volume de 
solução saturada de cloreto de sódio. Observar a formação de um precipitado de sabão por 
excesso de sais neutros, sendo explicada pelo efeito do íon comum, que reprime a 
dissociação dos sabões fazendo que as micelas percam a carga e precipitem. 
 
 
4. TESTE DO IODO 
 
REAGENTES 
 
- amostra (óleo) 
- solução de lugol fraco: iodo 1g, iodeto de potássio 5g, água destilada para completar 
100mL 
 
TÉCNICA 
 
TUBO 4: 
Colocar num tubo de ensaio 1mL da amostra (óleo) 
Adicionar 3 gotas de lugol 
Aquecer CAUTELOSAMENTE em banho-maria fervente 
 
Observe e analise, descrevendo as alterações do meio reacional abaixo: 
 
Coloração ANTES do banho-maria Coloração DEPOIS do banho-maria 
 
 
 
 33 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
TESTE DE SOLUBILIDADE 
Este teste permite identificar a presença de lipídios nas amostras. Para isso 
utilizamos algumas substâncias como éter, clorofórmio, água, ácido clorídrico e hidróxido de 
sódio. 
Sabendo que os lipídios são moléculas apolares e conhecendo a lei de dissolução 
"semelhante dissolve semelhante", certamente as amostras que contém lipídios formarão 
soluções de apenas uma fase com as substâncias apolares; e com as substâncias polares 
soluções onde observaremos mais de uma fase. Testando a Solubilidade da amostra que 
contém lipídio, temos: 
 
- Éter; Clorofórmio – Solúvel 
- Água; Ácido clorídrico; Hidróxido de sódio - Insolúvel 
 
TESTE DE SAPONIFICAÇÃO 
O teste da saponificação identifica a presença de ácido graxo. Para isso coloca-se a 
amostra na presença de uma base como KOH (hidróxido de potássio) ou NaOH (hidróxido 
de sódio). 
Os compostos resultantes, sais de ácido graxo (fig. 1), são moléculas anfipáticas, 
com uma "cabeça" polar (COO- Na+) e uma cauda apolar formada pelo radical "R". Quando 
em meio aquoso, moléculas anfipáticas tendem a se agrupar formando estruturas 
esferóides, as micelas. Este é o princípio da limpeza de gorduras produzida pelo sabão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 – Reação de Saponificação 
 
 
 34 
 
TESTE DO IODO 
Este teste identifica a presença de ácido graxo insaturado. Ocorre uma reação de 
halogenação, em que o iodo reage com as duplas ligações do ácido graxo insaturado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2 – Reação de Halogenação 
 
Se houver dupla ligação, o iodo será consumido e a coloração característica da 
solução de iodo diminuirá de intensidade. 
 
 
UM POUCO MAIS SOBRE O LIGAÇÕES SATURADAS E INSATURADAS 
 
Óleos são lipídios constituídos principalmente por ligações duplas, ou seja, 
insaturadas, enquanto que gorduras (pastosas, consistentes) são constituídas por ligações 
simples entre os carbonos das longas cadeias carbônicas, por isso são chamadas gorduras 
saturadas. 
 A margarina é de origem vegetal, advinda da hidrogenação de óleos poliinsaturados. 
A reação de hidrogenação caracteriza-se pela quebra das duplas ligações (insaturadas) 
sendo que a ligação quebrada é substituída por duas moléculas de hidrogênio, por isso 
hidrogenação, adição de hidrogênios. Reações de hidrogenação são produzidas 
artificialmente com catalisadores inorgânicos e altas temperaturas, portanto os hidrogênios 
são adicionados inespecíficamente e desta forma podem formar as gorduras do tipo 
TRANS. 
 
Antes todas as insaturações eram hidrogenadas, mas com a descoberta de que 
triglicerídeos saturados aumentam os riscos de desenvolvimento de problemas circulatórios 
e cardíacos, nem todas as insaturações são hidrogenadas, apenas as necessárias para 
atingir a consistência da margarina. 
 
 
RELATÓRIO – caracterização de triacilgliceróis 
 
O relatório deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questões devem estar 
respondidas e/ou abordadas no relatório (as questões que não forem abordadas no corpo 
do relatório deverão estar apresentadas em ANEXO): 
 
1. Explique cada uma das reações ocorridas no ERLENMEYER e nos tubos 1, 2, 3 e 4, 
fundamentando-as. 
2. Cite as principais funções biológicas dos lipídios correlacionando-as com a estrutura 
destas moléculas. 
3. Por que se utiliza etanol na reação de saponificação? 
4. Explique a ação detergente dos sabões. 
5. Explique o que ocorre na reação de halogenação no teste com iodo. 
 35 
6. Os lipídios podem ser saturados (apenas ligações simples) ou insaturados (ligações 
duplas). As gorduras são lipídios consistentes, pois as moléculas apresentam apenas 
ligações simples, enquanto os óleos são líquidos devido às insaturações. 
A manteiga e a margarina são produzidas com gordura animal e óleos vegetais, 
respectivamente. Então como se explica que ambas sejam consistentes, posto que óleos 
são caracteristicamente líquidos? 
 
CURIOSIDADE: Sabões na indústria farmacêutica... 
 
ZANIN, S. M. W.; MIGUEL, M. D.; BUDEL, J. M.; DALMAZ, A. C., Desenvolvimento de 
sabão base transparente. Revista Visão Acadêmica, Curitiba, v. 2, n. 1, p.19-22, Jan./Jun, 
2001. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
BIOQUÍMICA GERAL E METABÓLICA 
AULA 9 
HIDRÓLISE E CARACTERIZAÇÃO DO AMIDO 
 
OBJETIVOS 
Objetivo geral: 
- caracterização do amido, enfatizando dois diferentes tipos de hidrólise e suas implicações 
 
Objetivo específico: 
- caracterizar o amido através de hidrólise ácida 
- revisar os conceitos de estrutura desse carboidrato juntamente com as propriedades das 
enzimas 
 
EXPERIMENTO 
 
A. REATIVOS 
 
1. Solução de amido a 1 % 
2. Solução de lugol fraco 
3. Reativo de DNS (3,5-dinitrosalicilato) 
4. HCl concentrado 
 
B. TÉCNICA 
 
HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO: teste do iodo e reação do DNS 
 
1. Colocar 5mL de solução de amido em um tubo de ensaio (tubo de hidrólise) e levá-lo ao 
banho-maria fervente. Deixar 1 minuto para homogeneizar a temperatura. Observar se a 
solução passa a ficartranslúcida. 
 
2. Para dar início à hidrólise, adicionar ao tubo 0,2 mL de HCl concentrado, misturar e retirar 
em outros 2 tubos de ensaio: 
0,2mL para o teste do iodo 
0,2mL para o teste de açúcares redutores (DNS) 
ESTE É O TEMPO ZERO DA REAÇÃO 
 
3. Imediatamente após a retirada das alíquotas do tempo zero (item 2), recolocar o tubo de 
hidrólise (solução de amido mais HCl concentrado) no banho-maria fervente. A seguir nos 
tempos 5, 10, 20 e 30 minutos de hidrólise, retirar novas alíquotas de 0,2mL para o teste do 
iodo e dosagem do açúcar redutor. 
 
PROTOCOLOS PARA OS TESTES DO IODO DE DO DNS: 
 
 
O teste do iodo é realizado tomando-se: 
0,2mL da amostra (amido + HCl) 
3 gotas de lugol 
5mL de água destilada. 
 
A dosagem de açúcar redutor (teste do DNS), consiste em adicionar: 
0,2mL da amostra (amido + HCl) 
1,0mL de água 
1,0mL de DNS 
Deve-se aquecer em banho-maria fervente por 5 min e então adicionar 3mL de água 
destilada. 
 
 37 
A intensidade das colorações resultantes deve ser anotada na tabela abaixo: 
 
TEMPO (min) 0 5 10 20 30 
TESTE DO IODO 
(indicar a intensidade da cor) 
 
DNS 
(indicar a intensidade da cor) 
 
 
Interpretar os resultados 
 
 
ASPECTOS TEÓRICOS 
 
O monossacarídeo glucose é a mais importante unidade de formação de 
polissacarídeos na natureza. Os polissacarídeos de reserva das plantas (amido), dos 
animais (glicogênio) e os polissacarídeos estruturais das plantas (celulose) são formados 
exclusivamente de glucose. 
O amido encontra-se largamente distribuído no reino vegetal, sendo encontrado em 
sementes, tubérculos, etc. Dentro das células encontra-se na forma de grânulos, sendo 
característica a aparência microscópica dos amidos de diferentes fontes. Os principais 
constituintes do grânulo de amido são a amilose e a amilopectina, polissacarídeos que 
diferem na estrutura molecular. Quando se aquece uma suspensão de amido em água os 
grânulos se desintegram e formam uma solução coloidal de amido. 
Quando se adiciona uma solução de iodo ao amido desenvolve-se uma coloração 
azul, que é devida a formação de um complexo de amido com o iodo. 
O amido é um grão formado por dois polissacarídeos: amilose e amilopectina. Estes 
polissacarídeos de reserva vegetal constituem-se em unidades de glucose ligadas por 
ligações glicosídicas do tipo  (14) (amilose) e unidades de glucose ligadas por ligações 
glicosídicas do tipo  (14) e  (16), a amilopectina, que possui pontos de ramificação. 
 A reação com iodo é utilizada para a pesquisa do amido (carboidrato), que forma um 
complexo colorido com o iodo. A amilose dá origem a uma coloração negro-azulada, 
enquanto que a amilopectina dá origem a uma coloração vermelho-violácea. Este complexo 
se dissocia por aquecimento e torna a se formar quando a solução é resfriada. A explicação 
para este fenômeno advém do fato das cadeias lineares de amilose apresentarem uma 
conformação helicoidal capaz de ocluir o iodo, resultando no desenvolvimento da coloração 
azul-intensa típica. Para cada 6 resíduos glicosil ligados por  (14) da amilose estabelece-
se um passo da hélice. O aquecimento da solução de amido deve então alterar esta 
conformação e como conseqüência abolir a coloração resultante da interação amilose-iodo. 
A amilopectina apresenta uma reação semelhante mas a formação da hélice fica em parte 
dificultada pelos pontos de ramificação da molécula (= ligações  (16). Por esta razão a 
intensidade da cor iodo-amilopectina é menor e seu matiz (máximo de absorção) é também 
diferente (violáceo-avinhado). No glicogênio, ainda mais ramificado que a amilopectina, este 
impedimento é maior e a cor resultante é acastanhada. 
Numa solução de amido em presença de ácido (HCl) e aquecimento, ocorre hidrólise 
das ligações glicosídicas dos polissacarídeos. Em função do tempo de hidrólise encontram-
se produtos intermediários (oligossacarídeos), sendo que o produto final da hidrólise ácida é 
a glucose. 
 
Coloração do amido com lugol (iodo): 
- Amido: negro-azulado 
- Oligossacarídeos maiores: azul à púrpura 
- Oligossacarídeos menores: avermelhados 
- Glucose: não desenvolve cor com lugol 
 
 
 
 
 38 
Fig. 1 – Amilopectina: ligações glicosídicas  (14) e 
  (16) 
 
ligação glicosídica 
α (1→4) 
ligação glicosídica 
α (1→6) extremidade redutora 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO – hidrólise e caracterização do amido 
 
O relatório deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questões devem 
estar respondidas e/ou abordadas no relatório (as questões que não forem abordadas no 
corpo do relatório deverão estar apresentadas em ANEXO): 
 
1. Com relação à natureza dos produtos de hidrólise, diferencie a ação de um ácido mineral 
da -amilase salivar sobre o amido. 
 
2. Explicar os resultados obtidos na hidrólises ácida do amido, em função da evolução das 
cores obtidas (aos zero, 5, 10, 0 e 30 minutos) com o iodo. 
 
3. Fundamento do método do 3,5-di-nitrosalicitato para dosagem de açúcares redutores. 
 
4. Supondo que a hidrólise ácida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o 
isolamento preferencial de dissacarídeos qual seria a estrutura dos mesmos (tipos de 
ligações glicosídicas)?