Aula on-line 4 estrategias purificacao

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Estratégias para purificação de uma proteína 
Os assuntos abordados nessa aula são: 
 Métodos de centrifugação e precipitação diferencial
 Dosagem de proteínas
 Métodos cromatográficos
 Análise de eficiência da purificação
BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
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Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
 A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em uma célula simples, a bactéria Escherichia coli. 
 Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas. 
 
 Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína. 
 Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica. 
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Métodos de Isolamento de Biomoléculas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
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 Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
	1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)	
 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) 
 Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas 
 moléculas:
 
 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que 
 interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
 
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
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O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura. 
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 Medida da atividade biológica
 - particular para cada proteína
 - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração.
 Medidas do conteúdo proteico (diversos)
 - absorbância de luz UV de 280 nm
 - métodos colorimétricos 
 (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação.
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Métodos para medida do conteúdo de proteína:
 O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe. 
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano. 
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
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BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250
 Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas.
 Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul, 
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato 
 Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 
 
1. Cu2+ é quelado pela proteína
 [Cu2+-proteina]
2. Reação redox 
 Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] 
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
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Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.
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Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formam complexos solúveis com as proteínas.
Detergentes podem ser iônicos e não iônicos
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sangue centrifugado: separação de plasma e células
 A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. 
 Através de sucessivas etapas de centrifugação com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos.
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R$ 3.000
US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas
200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos
(necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
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Centrifugação em gradiente de densidade
A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser utilizados
para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc.
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As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
	- adição de sais (Precipitação salina)
	- adição de solventes
	- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
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Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.
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Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. 
Os mais utilizados são etanol e acetona. 
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou 
 quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
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Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros 
 tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
início
final
Dt
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Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada.
Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. 
Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas.
Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.
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Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica 
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. 
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como:
 massa molecular
 carga elétrica
 solubilidade
 afinidade
 
Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
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Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
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Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
 grãos (beads) da resina com poros 
 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. 
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). 
 Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
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Absorbância a 280 nm
volume
Medida da ativ. biológica
Moléculas maiores
Moléculas menores
Kav
Massa molecular (kD)
 20 40 60 80 100 120 mL 
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. 
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.
Ler a massa correspondente
Observar a escala log
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Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas
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Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. 
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com 
 massa acima da resolução da resina 
onde:
O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d.
Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva.
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.
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Cromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
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O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Cromatografia de troca iônica 
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Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção
Eluição
Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 
adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 
eluição das proteínas adsorvidas.
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.
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Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica 
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI.
Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos.
Responda: em pH 7,0, qual será a carga elétrica da albumina, da mioglobina e do citocromo C ?
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Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. 
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
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Tipos de Resina de troca Iônica
 Tipos de Resina de troca Iônica 
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
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Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao 
 ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou 
 por competição com o ligante livre
Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. 
A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). 
Ex: cromatografia de imunoafinidade
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1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
	- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
	- agonistas ou antagonistas de receptores
	- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
	- ligantes com “tag” ou “marcação”
		- glutationa-S-transferase
		- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP)
 Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade 
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Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. 
 A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.
Preparo da resina de afinidade: 
Passo 1. Ativação da resina
				
				 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
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Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico.
Consiste de 2 sistemas:
Dois tipos de montagem:
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Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um valor de Rf característico. 
Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação) diferentes compostos.
Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o composto isolado.
Cromatografia de Partição
Papel
ou placa de sílica
Amostra na origem
tempo 0 t 1 t2 tn 
direção do fluxo do solvente
Compostos separados
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
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HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. 
Característica diferencial da cromatografia convencional: 
 partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) 
 aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos 	 de resina em um mesmo volume da coluna 
 fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV 	ou Vis, fluorescência, etc.
Coluna pode ser aquecida para melhorar a 		eluição diferencial na fase reversa
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Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água
	- acetonitrila, metanol, propanol
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
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Cromatografia de interação hidrofóbica
É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico.
Proteínas em solução salina concentrada “perdem” parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica
Eficiência dos sais em provocar “salting-out” varia com a série de Hofmeister:
Ânions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-
Cátions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+
Três estratégias para eluição:
 
1. diminuir a concentração de sal
2. diminuir a polaridade da fase móvel
3. adicionar detergente
Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina:
 
 Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) 
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 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
 Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida 
 através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes 
 em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
 Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína 
 de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades 
 específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
 Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de 
 partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é 	 	 inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-	 	 sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas 
 que apresentam pouca atividade). 
	 Também
podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às 	 diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes 	 
	 etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de 	 interesse. 
 
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 Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação.
 
 Se você fosse repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ? 
EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.
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 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
 A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
	Fornece informações sobre a massa molecular e composição 	 	de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida é um polímero que um gel de malha porosa.
A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo as grandes
 É formado a partir da reação de acrilamida e bisacrilamida.
 concentração de acrilamida variando de 5 a 20% determina o diâmetro dos poros
 uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resolução
 o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)
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Sódio dodecil sulfato
Desnaturação de proteínas por SDS
						Efeito do SDS
 desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida; 
 mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo;
 facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a.
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. 
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra. 
Antes da polimerização, um pente é colocado na parte superior do gel para formar os poços onde serão colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida.
As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampão, onde estão os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).
Terminada a corrida, as placas são retiradas da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata.
catodo
anodo
tampão
Poços para as amostras
amostra
Placas de vidro
1 mm
tampão
gel
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Eletroforese em Meio Redutor
Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a determinação do número de cadeias e tipo de ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium
Direção da migração
Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína
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SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas
Mobilidade relativa = 
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
Curva de calibração de SDS-PAGE
 A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína desconhecida na curva, pode-se estimar a sua massa molecular.
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Mr
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Terminamos aqui a 4ª.aula online do curso de Biofísica de Proteínas.
Os assuntos abordados nessa aula são: 
 Métodos de centrifugação e precipitação diferencial
 Dosagem de proteínas
 Métodos cromatográficos
 Análise de eficiência da purificação
Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.