Determinação de ALA em URINA

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TOXICOLOGIA 
Prática 2 – DOSAGEM DE ÁCIDO DELTA AMINOLEVULÍNICO – ALA-U 
 
Ácido δ-aminolavulínico (ALA-U) 
 Na síntese do grupo heme o ALA-U é o primeiro composto formado e, por ação 
da ALA-desidratase (ALA-D), é transformado em protoporfirina IX, complexado com o 
ferro (por ação da enzima ferro-quelase), transformando-se no grupo heme. A 
intoxicação por chumbo (Pb) e mercúrio (Hg), dentre outros efeitos, interfere nesta 
biossíntese, inibindo as enzimas que dela participam devido sua forte afinidade por 
grupamentos sulfidrilas. A primeira enzima que fica exposta ao metal é a ALA-D e 
posteriormente a ferro-quelase. Com a inibição desta primeira enzima o grupo heme não 
é sintetizado, pois não há a biotransformação do ácido δ-aminolavulínico em 
protoporfirina IX, conforme figura abaixo. 
 
 
 
Dada esta inibição, o nível sanguíneo de ALA-U aumenta e força para uma 
excreção renal. Este ciclo é retroalimentado a partir da não formação do grupo heme 
que estimula maior produção de ALA-U e, consequentemente, aumenta ainda mais sua 
concentração sérica e excreção renal. 
Este indicador biológico para contaminação por estes metais pesados possui uma 
sensibilidade de 92% e especificidade de 90%. 
 
 
 
 
 
A) Relação de Equipamentos Necessários: 
Equipamentos 
Espectrofotômetro 
Vórtex 
Banho maria fervente 
 
B) Descrição do Preparo de Soluções e Reagentes: 
1. Solução padrão estoque de ácido delta aminolevulínico (0,1mg/mL): 
Ácido delta aminolevulínico ---------- 100 mg 
Água destilada qsp ----------------------1 L 
 
2. Solução tampão acetato pH 4,6: 
Pesar 13,6 g de acetato de sódio tri-hidratado e dissolver em cerca de 70 mL de água destilada. 
Adicionar aproximadamente 5,7 mL de ácido acético glacial, ajustando o pH para 4,6 com 
auxílio de um pHmetro. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume 
com água destilada. Conservar em geladeira. 
3. Reativo de Ehrlich modificado: 
Em um bequer, pesar 0,5 g de p-dimetilaminobenzaldeído, e dissolver em pequena porção de 
ácido acético glacial. Transferir para um balão volumétrico de 25 mL. Adicionar 2,5 mL de ácido 
perclórico 60-70 % e 2,5 mL de água destilada. Completar o volume para 25 mL com ácido 
acético glacial, lavando o bécker. Preparar no momento do uso. 
C) Objetivo: 
Oportunidade de desenvolver um procedimento experimental, considerado como uma 
das análises toxicológicas realizadas em monitorização biológica da exposição 
ocupacional para chumbo, além da interpretação dos dados com base nos parâmetros da 
Toxicologia Analítica. 
 
D) Procedimentos Experimentais: 
1. Preparar os padrões de uso: 
 
 
1.1 Solução padrão uso 20mg/L: Diluir 1 mL da solução padrão estoque para 5 mL com água 
destilada em balão volumétrico. 
1.2. Solução padrão uso 10mg/L: Diluir 1 mL da solução padrão estoque para 10 mL com água 
destilada em balão volumétrico. 
As soluções padrões USO devem ser preparadas no momento da análise. 
1.3 Solução padrão uso 4 mg/L: Diluir 1 mL da solução padrão estoque para 25mL com água 
destilada em balão volumétrico. 
2. Procedimento 
 Em tubo de ensaio adicionar 1 mL de urina, 1 mL de solução tampão pH 4,6 e 0,2 mL de 
acetoacetato de etila; 
 Fazer, em outro tubo, um branco para a urina contendo 1 mL de urina e 1 mL de solução 
tampão pH 4,6; 
 Para a curva de calibração adicionar em três tubos de ensaio (um para cada concentração) 
1 mL da solução padrão uso - 4mg/L, 10mg/L e 20mg/L , mais 1 mL da solução tampão 
acetato pH 4,6 e 0,2 mL de acetoacetato de etila; 
 Preparar um branco para o padrão, colocando em um tubo de ensaio 1 mL de água 
destilada, 1 mL de solução tampão pH 4,6 e 0,2 mL de acetoacetato de etila. 
 Colocar todos os tubos em Banho-Maria fervente durante 10 minutos; 
 Resfriar e em seguida adicionar 3 mL de acetato de etila em todos os tubos; 
 Tampar os tubos e agitar em vórtex por 1 minuto; 
 Centrifugar à 2000 rpm durante 3 minutos, se necessário; 
 Transferir 2 mL da fase orgânica (fase superior) para um tubo de ensaio. Desprezar a fase 
aquosa 
 Adicionar 2 mL do reativo de Ehrlich modificado; 
 Agitar. 
 Deixar em repouso por 10 minutos e fazer as leituras em espectrofotômetro das 
absorbâncias em 553nm contra os respectivos brancos. 
 
Resumo do preparo: 
REAGENTES/AMOSTRA TESTE BRANCO CURVA CURVA (ZERO) 
Urina 1,0 mL 1,0 mL ----- ----- 
Padrão ----- ----- 1,0 mL ----- 
Água destilada ----- ----- ----- 1,0 mL 
Tampão acetato 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 
Acetoacetato de etila 0,2 mL ----- 0,2 mL 0,2 mL 
BANHO DE ÁGUA FERVENTE POR 10 MINUTOS 
RESFRIAR ATÉ TEMPERATURA AMBIENTE 
Acetato de etila 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 
TRANSFERIR 2 mL DA FASE ORGÂNICA PARA OUTRO TUBO 
Reativo de erlich 2 mL 2 mL 2mL 2 mL 
REPOUSO POR 10 MIN E LEITURA EM 553nm CONTRA OS RESPECTIVOS BRANCOS 
 
 
4. Cálculos: 
A determinação da concentração de ácido delta aminolevulínico na urina é feita a partir da 
curva de calibração. Para cada ponto da curva é calculado um fator, dividindo-se o valor da 
concentração do padrão pela respectiva leitura de absorbância. A média dos fatores é usada 
para o cálculo. A concentração de ácido delta aminolevulínico na amostra é igual a absorbância 
da mesma multiplicada pela média dos fatores. 
 
5.Valores de Referência para Ácido δ-aminolavulínico (ALA) em urina: 
Normal até 6mg/L 
Aceitável 6 a 20mg/L 
Excessivo 20 a 40mg/L 
Perigoso acima de 40mg/L 
 
E) Limpeza e Organização: 
Utilizar o Papel toalha para forrar a bancada 
O professor deve usar EPIS (Avental, luvas, máscaras e óculos de proteção). 
Os alunos devem usar EPIS (Avental, luvas, máscaras, óculos de proteção e toucas 
descartáveis), trazidos por eles próprios. 
Cabelos compridos devem estar presos ou cobertos por toucas descartáveis. 
Vestes: sapatos fechados, salto baixo, calça comprida.