Apostila_de_bioquimica_Odontologia

Prévia do material em texto

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA
BIOQUÍMICA
Prof: Ricardo Menon
21
INDICE
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO 
AULA PRÁTICA Nº 01
-Técnicas de Laboratório
AULA PRÁTICA No. 02
-Cromatografia de Aminoácidos em papel
AULA PRÁTICA No. 03
- Propriedades das Proteínas
AULA PRÁTICA No. 04
-Propriedades das Enzimas
AULA PRÁTICA No. 05
-Identificação de Carboidratos
AULA PRÁTICA No. 06
- Fermentação Alcoólica
AULA PRÁTICA No. 07
-pH, Tampões
AULA PRÁTICA No. 08
· Extração e Caracterização de Lípideos
AULA PRÁTICA No. 09
· Pesquisa Quantitativa dos constituintes químicos do Leite
AULA PRÁTICA No. 10
· Constituinte do Ovo
A - OBJETIVOS GERAIS DAS AULAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO
As aulas práticas de Bioquímica têm como objetivo criar condições para que os estudantes ao final do curso sejam capazes de:
1) Reconhecer e manipular o equipamento frequentemente utilizado em laboratório de Bioquímica.
2) Manipular material biológico: extrair, fracionar e identificar.
3) Conhecer, por meios de reações efetuadas no laboratório, propriedades químicas das substâncias que compõem os organismos vivos.
4) Interpretar os resultados experimentais.
B - LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA
1) Os estudantes se organizarão em bancadas que ocuparão sempre o mesmo lugar no laboratório.
2) Cada lugar no laboratório será equipado com o material necessário à execução do trabalho programado.
3) Em dias e horas destinadas aos trabalhos práticos, os estudantes terão à sua disposição professor encarregado de orientá-los na execução e interpretação dos exercícios de laboratório.
4) Após o uso de gás ou água, não deixar as torneiras abertas, tomando o cuidado de fechá-las completamente.
5) Ao lançar nas pias das mesas os produtos das reações, fazê-lo simultaneamente com descarga de água, para evitar a corrosão dos encanamentos.
6) Não lançar nas pias e calhas papéis de filtro usados ou substâncias sólidas que possam obstruir os encanamentos.
7) Não lançar fósforos acesos nos locais destinados à coleta de lixo.
8) Fotocolorímetros, peagâmetros, balanças analíticas, centrifugadores, microscópios ou outros aparelhos somente deverão ser usados pelos alunos depois de instruídos nas respectivas manipulações a fim de se evitar danos irrecuperáveis.
C - MATERIAL DO ESTUDANTE
Cada estudante deverá trazer para os trabalhos práticos o material abaixo relacionado:
1) Avental - necessário para proteger a sua roupa e lhe facultar desembaraço na execução das operações. Não será permitida a presença do aluno sem avental.
2) Guia dos trabalhos práticos - sem o qual é impossível realizar qualquer trabalho no laboratório. O Guia é individual.
3) Pincel atômico - para marcar adequadamente a vidraria durante a execução dos trabalhos práticos.
4) Lápis, borracha e régua.
D - GUIA DOS TRABALHOS PRÁTICOS
Este Guia dos Trabalhos Práticos é constituído de roteiros para a execução das tarefas programadas. O roteiro de cada trabalho prático deverá ser estudado previamente pelo estudante para facilitar sua execução no laboratório. As dúvidas deverão ser resolvidas antes do início dos trabalhos. O roteiro consta dos seguintes itens:
a) Objetivos específicos - relação dos objetos que deverão ser alcançados após o término de cada aula.
b) Material necessário - relação do material necessário à execução do trabalho.
c) Reagentes - relação dos reagentes necessários à execução do trabalho.
d) Procedimento - marcha do trabalho a ser seguida, etapa por etapa.
e) Interpretação - explicação de reações, detalhes de técnica ou cálculos a serem feitos durante o trabalho prático.
f) Relatório – deverá ser preenchido logo após o término de cada trabalho prático, no laboratório. A presença do aluno só será computada depois do relatório ter sido examinado e visado pelo professor responsável.
E - MATERIAL RECEBIDO E SUA LIMPEZA
1) Para a execução de cada trabalho prático as bancadas de estudantes receberão o material relacionado no roteiro.
2) O aluno não deverá utilizar o material de seus colegas, sobretudo quando eles estiverem ausentes.
3) Cada bancada é responsável pela manutenção da ordem em seu lugar e conservação de seu material de trabalho.
4) No caso de inutilização de algum material recebido, o estudante deverá dar conhecimento ao professor responsável, a fim de ser providenciada a sua substituição.
5) O aluno não deverá jogar fora o material que julga inutilizado, pois às vezes o mesmo poderá ser recuperado.
6) Terminados os trabalhos, o estudante deverá proceder à limpeza de seu material, deixando inteiramente limpos e em condições de ser utilizado novamente. Somente será dado o visto no relatório após a observação desta recomendação.
7) A limpeza da vidraria deverá ser procedida imediatamente após o seu uso. Quando necessário, empregar sabão. Em seguida, lavar abundantemente com água corrente e água destilada. O material é posto para secar espontaneamente, e no caso dos tubos de ensaio, os mesmos devem ficar emborcados no respectivo suporte.
F - REAGENTES
1) Para cada trabalho prático haverá à disposição dos estudantes uma provisão dos reagentes relacionados no roteiro
2) Imediatamente após o uso, cada reagente deverá ser colocado, para que possa ser utilizado por outro colega, na prateleira acima das mesas ou em seu lugar próprio.
3) Devem ser tomados os seguintes cuidados com os vidros de reagentes e as soluções neles contidas a fim de se evitar contaminações:
· Não trocar as rolhas;
· Não introduzir pipetas nas soluções padrões. Deve-se transferir um pouco da solução (volume aproximado ao que vai ser gasto) para um tubo de ensaio ou um béquer limpo de onde se pipetará a quantidade indicada.
· Não restituir ao frasco original as soluções retiradas em excesso.
· Caso seja autorizado, pipetar diretamente do vidro do reagente, usar sempre uma pipeta limpa.
G - EXECUÇÃO DOS TRABALHOS PRÁTICOS
1) Todos os trabalhos práticos devem ser executados com atenção rigor técnico e disciplina.
2) A inobservância de qualquer dos requisitos enumerados no item anterior pode introduzir erros que invalidam, parcial ou totalmente, o trabalho realizado. Isto significa desperdício de tempo, reagentes e material.
3) Para que o aluno alcance a eficiência desejada é necessário que tenha conhecimento prévio do trabalho prático a ser executado e seja pontual, assíduo e ordeiro.
4) Cálculos e anotações devem ser efetuadas no próprio guia de trabalhos práticos.
H - PREVENÇÃO DE ACIDENTES
1) Trabalhar sempre protegido por avental.
2) Não fumar dentro do laboratório.
3) Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira antes de ter à mão a chama que deve acendê-lo.
4) Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter, etc.) nas proximidades de uma chama.
5) Os reagentes tóxicos ou corrosivos, como álcalis ou ácidos fortes e concentrados não deverão ser pipetados, porém medidos em cilindros graduados ou, em alguns casos, em buretas.
I - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Durante as aulas práticas de laboratório o estudante tem a oportunidade de travar contato com algumas técnicas empregadas não só em análise de constituintes de líquidos fisiológicos, como também na pesquisa. Ao mesmo tempo, o estudante fica a par de alguns princípios teóricos suficientes apenas para uma compreensão e interpretação dos resultados experimentais. Para um conhecimento mais aprofundado da teoria e de outros métodos de dosagens, o estudante poderá consultar:
1. COOPER, T.G.; The Tools of Biochemistry. New York: John Willey & Sons. 1977. 423p.
2. VILELA, G.G.;BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.
3. WHARTON, D.C. McCARTY, R.E., Experiments and Mthods in Biochemistry. New York: The MacMillan Company. 1972. 350p.
COMO ESCREVER UM RELATÓRIO?
Deve conter uma breve introdução teórica sobre o assunto a ser estudado no laboratório. É importante que esta introdução não seja uma cópia de livros e, principalmente, da apostila, mas sim, represente o que o aluno assimilou sobre a teoria envolvida no assuntoestudado.
Os dados obtidos nas experiências realizadas no laboratório devem ser mostrados de forma clara. Junto aos resultados, deve vir uma discussão sobre os erros obtidos, a eficiência dos métodos utilizados etc, e a conclusão referente ao experimento.
A bibliografia utilizada deve ser mencionada em um capítulo à parte. Um esquema de relatório é mostrado abaixo:
I. Introdução teórica.
II. Objetivos da Aula.
III. Metodologia e Desenvolvimento
IV. Resultados e conclusões. 
V. Bibliografia.
Bibliografias
NOME DO(S) AUTOR(ES) Título da obra. Edição. Local da Publicação: Nome da Editora, Ano da publicação número de páginas ou volume da obra.
Exemplo:
VILLELA, G. G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e experimentos de Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.
AULA PRÁTICA No. 01: TÉCNICAS DE LABORATÓRIO
A – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Identificar balão volumétrico, bureta, pipeta, proveta, béquer, erlenmeyer, tubo de ensaio e funil de vidro.
2) Ler as graduações de pipetas, buretas e provetas
3) Usar pipeta, bureta, proveta e balão volumétrico para medir, transferir e completar volumes definidos de soluções.
4) Reconhecer as zonas na chama de gás.
5) Aquecer água em tubos de ensaio no bico de gás, sem risco de acidentes.
6) Lavar o material de acordo com as instruções
B - MATERIAL E SUAS CARACTERÍSTICAS
O estudante deve conhecer o material que será usado no laboratório, saber manipulá-lo e ter conhecimento dos cuidados relativos à sua conservação.
1) Balões Volumétricos - vidro comum ou pirex, com diversas capacidades. Contém um volume exato, a determinada temperatura (geralmente 20oC), podendo ser utilizados sem erro apreciável em temperaturas mais ou menos 8oC acima e abaixo da indicada. Utilizados para o preparo de soluções. Tratando-se de equipamento volumétrico aferido, não o submeter a altas temperaturas.
2) Buretas - vidro comum ou pirex, de diversas capacidades. Utilizados em titulações e para medidas precisas de volume. Antes de ser usada, a bureta deve ser lavada com água corrente; em seguida várias vezes com água destilada e depois três vezes com pequenas porções do líquido a ser medido. Não usar escova para lavar a bureta nem a colocar na estufa para secar.
3) Pipetas - vidro comum ou pirex. Distinguem-se dois tipos fundamentais:
· Volumétricas, destinadas à transferência de volumes em múltiplos inteiros de 1 ml (ex. pipetas Volumétricas de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 25 ml).
· Graduadas, usadas para transferência de volumes que envolvem frações de 1 ml (ex. pipetas graduadas de 1 ou 2 ml com divisões de 0,01 ml; de 5 ml ao 0,1 ml). Antes de serem usadas devem ser lavadas com os mesmos cuidados indicados anteriormente para as buretas. Devem ser lavadas inclusive com água destilada, logo após o uso.
4) Cilindros graduados ou provetas - vidro comum ou pirex com diversas capacidades, com ou sem rolhas esmerilhada, utilizada para medir volumes com precisão até 0,5%.
5) Béqueres ou copos de Griffin - geralmente de vidro pirex, diversas capacidades. São destinados a conter e não a medir volumes.
6) Frascos erlenmeyers - vidro pirex; diversas capacidades. Destinados principalmente a conter volumes, para serem titulados.
7) Tubos de ensaio - vidro pirex ou comum, com ou sem orla; de diversos tamanhos. Utilizados para reações.
8) Funis de vidro - de diversos diâmetros. Usados para filtrações ou transferência de líquidos para recipientes de boca estreita.
9) Bicos de gás - possuem uma entrada para gás ajustável e uma entrada de ar, que permite regular a composição da mistura gás e ar. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a entrada de gás antes de ter à mão a chama para acendê-lo. Na chama do bico de gás distinguem-se três zonas: uma neutra (sem combustão do gás, sendo, portanto, relativamente fria); uma redutora (onde a combustão do gás é ainda incompleta) e uma oxidante (onde se dá a combustão completa do gás).
C – REAGENTES
Solução corada
D – INTERPRETAÇÃO
1) Na parte I aprende-se: a técnica de pipetar soluções incolores e coradas; a preparar uma série de soluções de reagentes de volume conhecido e de concentrações diferentes; a técnica de misturar soluções em tubos de ensaio; a correlacionar altura de líquido no tubo de ensaio com o volume do mesmo, o que é útil para testes qualitativos.
2) Na parte II aprende-se: a técnica de diluir uma solução de concentração conhecida; a forma pela qual se completa o volume num balão volumétrico; a técnica de misturar soluções em balão volumétrico. Esta técnica é utilizada no preparo ou na diluição de soluções de concentrações definidas (molar, normal, etc.).
3) Na parte III aprende-se: como usar corretamente uma bureta, minimizando as causas de erro como deixar bolhas de ar no seu interior; e fazer transferências de volumes exatos, o que é aplicado para medida de reagentes tóxicos ou corrosivos, como soluções de cianeto ou ácidos concentrados; que volumes medidos em provetas são menos exatos que os medidos em bureta, fonte de erro que deve ser evitada.
4) Na parte IV aprende-se: a usar adequadamente um bico de gás; a aquecer líquidos em tubos de ensaio, observando-se o volume contido no mesmo, que não deve ser superior a metade da capacidade do tubo; a seguir as regras de segurança a fim de se evitar acidentes e perda de material. Não se deve deixar ferver até evaporação completa do líquido. Geralmente a primeira ebulição é suficiente.
E - PROCEDIMENTO
I – Emprego de Pipetas Graduadas
1) Treinar a técnica de pipetar usando água destilada. Observar: a leitura do menisco (solução incolor parte inferior do menisco) se faz ao nível do olho; não se sopra a pipeta; no fim do escoamento toca-se a ponta da mesma na parede interna do recipiente; mantêm-se sempre a pipeta na posição vertical. Mede-se a quantidade de 1íquido escoado, por isto deve-se partir sempre da marca zero.
2) Completar as tabelas dadas no relatório (item F1).
3) Transferir para o béquer uma quantidade de solução corada um pouco maior do que a que se vai utilizar. Transferir água destilada para o erlenmeyer.
4) Marcar 20 tubos de ensaio, de mesmo diâmetro e altura para cada série, de 1 a 5, de 6 a 10, de 11 a 15 e de 16 a 20
5) Usando a pipeta graduada de 1 ml ao 0,01, pipetar alíquotas da solução corada (ler o menisco na parte superior) para os respectivos tubos, seguindo o esquema do relatório (item F-1 série A).
6) Lavar a pipeta com água comum e água destilada.
7) Utilizando a mesma pipeta, adicionar água destilada de modo a se completar o volume final da pipeta em questão (1 ml).
8) Misturar bem os dois líquidos, sem inversão.
9) Observar e correlacionar a altura do líquido contido nos tubos com o seu volume. Registrar em cm na tabela correspondente.
10) Repetir as operações 5 a 8 com as outras pipetas graduadas (itens F-1 séries B e D).
II – Emprego de Pipeta Volumétrica e Balão Volumétrico
1) Medir com pipeta volumétrica 10 ml da solução corada.
2) Transferir esta alíquota para um balão volumétrico de 100 ml.
3) Adicionar cerca de 80 ml de água destilada.
4) Completar cuidadosamente o volume com água destilada até a marca (parte inferior do menisco), empregando pipeta ou pissete.
5) Misturar bem invertendo o balão pelo menos 10 vezes. Conservar a solução para uso posterior.
6) Ler a interpretação.
III – Operação com Bureta e Proveta
1) Lavar a bureta segundo as instruções do item B.
2) Transferir para a bureta, com o auxílio do funil, uma pequena porção da solução preparada acima. Remover o funil. Enxaguar a bureta e escoá-la totalmente. Repetir a operação.
3) Encher novamente a bureta com a solução de modo que o líquido ultrapasse a marca zero. Remover o funil.
4) Retirar as bolhas de ar da extremidade inferior e acertar o menisco em zero (a altura do olho).
5) Transferir sucessivamente alíquotas de 1,00 - 2,50 - 5,65 - 10,38 ml para tubos de ensaio. Fazer as leituras a altura do olho para evitar erro de paralaxe.
6) Acertar o menisco para o próximo número inteiro e transferir 20,00 ml da solução para a proveta.
7) Confrontar o volume transferidoda bureta (20,00) com o marcado na proveta. Registrar.
8) Ler a interpretação.
IV – Operação com Bico de Gás
1) Colocar cerca de 5 ml de água destilada em um tubo de ensaio.
2) Aquecer a água na chama de gás com agitação até a primeira fervura, empregando a pinça para segurar o tubo de ensaio. Observar: agitação contínua do tubo para evitar projeção do líquido; nunca manter a boca do tubo dirigida para si ou seu colega.
3) Ler a interpretação.
F - RELATÓRIO
Responder o relatório. Lavar todo o material recebido. Apresentar o relatório ao professor responsável.
Esquema que deve ser preenchido e seguido no item F.
	
Série A Tubos
	Pipeta de 1,00 ml
	
	Pipeta de 2,00 ml
	
	Solução corada (ml)
	H2O (ml)
	Série B Tubos
	Solução corada (ml)
	H2O (ml)
	1
	0
	1,00
	1
	0
	2,00
	2
	0,26
	0,74
	2
	0,53
	1,47
	3
	0,40
	0,60
	3
	1,00
	1,00
	4
	0,55
	0,45
	4
	1,55
	0,45
	5
	0,80
	0,20
	5
	1,80
	0,20
	
Série C Tubos
	Pipeta de 5,00 ml
	
Série D Tubos
	Pipeta de 10,00 ml
	
	Solução corada (ml)
	H2O (ml)
	
	Solução corada (ml)
	H2O (ml)
	1
	0
	5,0
	1
	0
	10,0
	2
	1,7
	3,3
	2
	2,4
	7,6
	3
	2,5
	2,5
	3
	4,0
	6,0
	4
	3,0
	2,0
	4
	6,3
	3,7
	5
	4,2
	0,8
	5
	8,0
	2,0
01. Dar as características do material que encontrou em seu lugar, principalmente quanto a vidraria: tipo de graduação, capacidade e temperatura de calibração.
02. Indicar que material deve ser utilizado para as seguintes operações:
a. Preparo de soluções normais.
b. Medir volumes exatos de	soluções tóxicas corrosivas ou	muito concentradas.
c. Medir volumes com precisão de 0,5%.
d. 20,00 ml de solução escoada da bureta corresponderam a 	 na proveta.
03. Ao pipetar-se líquidos incolores emprega-se como referência a parte__________do menisco (superior ou inferior).
04. Ao pipetar-se líquidos corados emprega-se como referência a parte___________do menisco (superior ou inferior).
05. Indicar qual o tipo de pipeta que deve ser utilizado para se medir os seguintes volumes com maior e menor precisão, lembrando que habitualmente não são usadas pipetas volumétricas de volumes inferiores a 1 ml.
a) 5,00 ml	e 	 b) 1,00 ml	e 	 c) 0,50 ml	e 	 
d) 0,32 ml__________________e __________________
AULA PRÁTICA No. 02
CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS EM PAPEL A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia de aminoácidos.
02. Fazer a aplicação de aminoácido no papel de filtro.
03. Executar com precisão as operações necessárias à cromatografia ascendente.
04. Revelar um cromatograma.
05. Identificar aminoácidos de um cromatograma calculando seu Rf.
06. Ordenar solventes empregados em cromatografia de aminoácido baseado em sua polaridade.
07. Definir coeficiente de partição, fase móvel, fase fixa.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· tubo de ensaio de 25 x 200 mm com uma rolha de cortiça com percevejo.
· papel de filtro Whatman no.1, em tiras de 17 x 170 mm.
· tubos capilares
· 1 forro de papel.
· lápis e régua
· estufa a 90o – 100o C
· 1 placa de Petri
C - REAGENTES
· Mistura de três amino-ácidos padrões (+ 0,2 M)
· Mistura de amino-ácidos desconhecidos (+ 0,2 M)
· Solvente: mistura butanol - ácido acético - água (4:1:5)
· Revelador: solução de ninhidrina 0,25% em acetona.
D - INTERPRETAÇÃO
Cromatografia é uma técnica de grande importância na bioquímica moderna por permitir a separação, identificação e até dosagem de misturas que são de difícil resolução, como por exemplo: amino-ácidos, glúcides, ácidos graxos, assim como todos os seus derivados ou polímeros.
01. Princípio - A distribuição (partição) das substâncias (solutos) ocorre entre a fase aquosa estacionária e a fase solvente em movimento. O soluto move-se na direção do fluxo do solvente a uma velocidade que dependerá da sua atração, seja pela fase aquosa estacionária POLAR, seja pela fase orgânica (apolar) implica numa velocidade maior de migração.
02. Suportes - O sistema de soluto e solvente necessita de um suporte inerte, que variará com o objetivo da cromatografia. Pode-se utilizar papel de filtro, resinas e sais inorgânicos.
03. Tipos - Há várias formas de se efetuar uma cromatografia, donde os diversos tipos, de acordo com:
a) suporte usado: papel, camada fina (silica gel), coluna e troca iônica (resinas e sais inorgânicos).
b) fluxo do solvente: ascendente mono - e bidimensional, descendente mono- e bidimensional; disco. Adota-se geralmente as bidimensionais para os casos em que há acúmulo de solutos num único local na monodimensional.
04. Fatores - A migração do soluto é influenciada por: seu peso molecular, tipo de suporte, temperatura ambiente, sistemas de solventes, pH, polaridade, ação capilar, tempo de corrida, quantidade de soluto, etc.
05. 05. Identificação - são vários os métodos para identificar e até dosar os componentes de mistura cromatografada. Sua aplicação dependerá apenas do objetivo proposto e do tipo da cromatografia adotado. No caso da cromatografia em papel, deve-se fazer uma revelação. Isto é, aplica-se sobre o cromatograma um reagente que dê com o soluto uma reação corada, tornando-o portanto visível. No caso dos amino-ácidos emprega-se como revelador uma solução de ninhidrina que dá um produto azul com todos eles, exceto a prolina, cuja mancha é amarelada. No caso de se desejar fazer uma determinação quantitativa deve-se localizar a mancha e eluir a mesma.
06. Índice - Quando se realiza uma cromatografia em papel obtém-se um índice adicional que é característico para cada substância, desde que se fixe as condições da técnica. Este índice, Rf (ratio front) é dado pela relação existente entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente, a partir do ponto onde foi colocada a mistura. O Rf deverá ser sempre maior que zero. Se for igual a zero ou a 1, significa que a substância ou não se moveu, ou migrou com o solvente. Nestes casos, deve-se então modificar o sistema de solventes. Devido aos fatores mencionados acima, é aconselhável correr-se sempre que possível um padrão em paralelo com as misturas.
E - PROCEDIMENTO
IMPORTANTE: Em todas operações abaixo evitar tocar no papel de filtro com os dedos. Contaminações aparecerão, como manchas que prejudicarão o resultado da cromatografia. As bancadas de estudantes deverão executar as duas partes (I e II) em paralelo.
I - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS PADRÕES
01. Em uma das extremidades de tira de papel de filtro, a uma distância de 25 mm traçar a lápis uma linha transversal como referência para o ponto de origem.
02. Tocar com a ponta do tubo capilar contendo a mistura de três amino-ácidos padrões, o meio da linha transversal traçada (ponto de origem), deixando escoar um pouco da mistura, evitando que o mesmo se espalhe por uma área maior de 5 mm. Secar.
03. Repetir a mesma operação por duas vezes, tendo o cuidado de secar a mistura depositada antes do toque seguinte. Os três toques colocarão 2,5 a 20 l de mistura a ser cromatografa.
04. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrária é quela onde foi feita a aplicação da amostra. Fixar a tira de papel de filtro na face inferior da rolha de cortiça por meio de um percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seu diâmetro.
05. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada à tira de papel de filtro, tendo o cuidado de não deixar que a tira permaneça em contato com a parede interna do tubo.
06. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente + 1,5 cm, evitando que o ponto de aplicação da mistura permaneça em contato com o solvente.
07. Esperar o tempo suficiente para a frente do solvente chegar até + 1,5 cm da rolha.
08. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente o tubo.
09. Marcar imediatamente a lápis o ponto atingido pela frente do solvente.
10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a 90-100o C.
11. Revelar o cromatograma. Para isto mergulhar rapidamente a tira de papel de filtro em uma placade Petri contendo o revelador.
12. Secar a estufa a 90-100o C.
13. Calcular os Rf . Para isto observar a figura abaixo
A
Rf =
B
II - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS DESCONHECIDOS
01. Repetir todo o procedimento anterior usando agora uma mistura de amino-ácidos desconhecidos.
02. Identificar estes amino-ácidos desconhecidos utilizando os dados de Rf determinados para os aminoácidos padrões.
F - RELATÓRIO
01. Qual é a ordem crescente de polaridade das três substâncias presentes no solvente?
02. Como é calculado o Rf ?
03. Citar três aplicações práticas de cromatografia em papel.
04. Citar três condições que interferem em uma cromatografia em papel.
05. Registrar os Rf dos amino-ácidos padrões e dos desconhecidos, identificando-os:
	Padrões Rf
	
	Desconhecidos - Rf
	
	
	
	
	
	
	
	
	
AULA PRÁTICA No 03 PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática, o estudante deverá saber:
01. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento das propriedades das proteínas.
02. Definir os termos: desnaturação e precipitação salina.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
1- Tipos de ensaio
· - Pinça para tubos de ensaio
· Pipetas graduadas: 1 ml, 2 ml, 10 ml
· Papel de filtro
· Funis de vidro
· Espátula
· Bequeres
· 1 termômetro
C - REAGENTES
Solução de albumina de ovo a 0,5% em tampão acetato de sódio a 0,025 M, pH = 4,5.
· Solução de glicina a 2%
· Solução de ácido tricloroacético a 2%
· Solução de ácido pícrico a 5%
· Solução de cloreto férrico a 1%
· Solução saturada de (NH4)2SO4
· leite
· Solução de gelatina
· Tampão acetato de sódio pH 6,0; 4,7 e 3,5
· álcool etílico a 95%
· NaOH 2N
· Solução de HCl 2N
· Espátula
· Solução de CuSO4 1%
D - INTERPRETAÇÃO
01. Neste procedimento verifica-se a desnaturação das proteínas pelo calor. A intensidade de desnaturação pode ser observada através da reação das proteínas aquecidas a diferentes temperaturas, com o Biureto (que contém CuSO4 e NaOH): polipeptídeos contendo mais que 2 ligações peptídicas reagem com o Biureto formando compostos coloridos, enquanto os aminoácidos não reagem com o Biureto.
02. São reagentes alcalóides: ácido pícrico, ácido fosfomolíbdico, ácido tricloroacético, ácido ferrocianico, ácido sulfosalicílico e outros.
Os ânions destes ácidos combinam-se com as proteínas que possuem carga positiva, formando sais insolúveis. (As proteínas apresentam-se carregadas positivamente quando estão em meio mais ácido em relação ao seu ponto isoelétrico (pH < pI).
03. Proteínas quando colocadas em solução de pH situado no lado alcalino ao seu ponto isoelétrico (pH > pI) estão carregadas negativamente e combinam-se com cátions de metais pesados formando proteinatos insolúveis.
04. Neste procedimento estamos fracionando as proteínas pela remoção da fase sólida de uma ou mais frações deixando outras na fase líquida, por adição de um sal neutro. As proteínas que ficaram no precipitado e aquelas que passaram no filtrado são testadas neste procedimento pelo reagente de Biureto.
05. As proteínas tem solubilidade mínima no pH correspondente ao seu ponto isoelétrico. Entretanto, a gelatina mesmo no pH do PI é parcialmente solúvel. Desta maneira, para melhor visualizar a precipitação no pH isoelétrico da gelatina, acrescenta-se um agente que compete com a proteína pelo solvente, num processo semelhante ao "salting-ou". Naturalmente, a maior precipitação é observada no pH correspondente ao pH isolétrico, devido a maior afinidade proteína-proteína.
E - PROCEDIMENTO
01. Desnaturação pelo calor
· Tomar 4 tubos de ensaio e numerá-los 1, 2, 3, 4.
A cada um dos 4 tubos adicionar 4 ml de solução de albumina de ovo a 1% em tampão acetado de sódio 0,025 M pH = 4,5.
· Aquecer cada um dos tubos durante dois minutos nas seguintes temperaturas. (veja primeiro a observação)
Tubo 1 – 100oC Tubo 2 – 80oC Tubo 3 – 60oC Tubo 4 – 40oC
Observação: Para conseguir as diversas temperaturas, proceda do seguinte modo:
Aqueça 250 ml de água até a ebulição. Nesta temperatura, aqueça o tubo 1. Após aquecer o tubo 1, adicione água fria até atingir 80oC(use termômetro); aqueça então o tubo 2. Adicionar água fria até atingir 60oC; aqueça o tubo 3. Adicionar água fria até atingir 40oC, aqueça o tubo 4. Filtrar no tubo utilizando papel de filtro pré-umidecido em água.
Retirar de cada tubo 0,3 ml e fazer a reação de biureto do seguinte modo:
A cada tubo contendo 0,3 ml adicionar 1 ml de NaOH 2N e, gota a gota, CuSO4 a 1% (ler a interpretação).
02. Precipitação pelos agentes dos alcalóides
02.1. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos tubos adicionar 3 ml de ácido tricloroacético a 2% observar se ocorre precipitação
02.2. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina, e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos tubos de ensaio colocar 2 ml de NaOH 2N. Adicionar 3 ml de ácido tricloroacético a 2%. Observar se ocorre precipitação.
02.3. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos 2 tubos adicionar 1 ml de ácido pícrico. Observar se ocorre precipitação (ler a interpretação).
03. Precipitado de proteínas pelos Sais de Metais Pesados
03.1. Em 2 tubos de ensaio separados adicionar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo. Adicionar, gota a gota, solução de cloreto férrico a 1%. Verificar a formação de precipitação.
03.2. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente. A cada um dos 2 tubos adicionar 2 ml de HCl 2N. E gota a gota, solução de FeCl a 1%. Observar se ocorre precipitação. (ler a interpretação).
04. Precipitação Salina
04.1. Em um tubo de ensaio adicionar: 5 ml de leite, 5 ml de solução saturada de (NH4)2SO4. Filtrar. Recolher o filtrado. (ler a interpretação)
04.2. Tomar 2 tubos de ensaio e marcá-los F e P. No tubo F adicionar 1 ml do filtrado
No tubo P;
Com uma espátula remover um pouco do precipitado e transferí-lo para o tubo P. Adicionar água para dissolver o precipitado.
Nos tubos F e P realizar o teste de Biureto, procedendo da seguinte maneira: A cada um dos tubos adicionar:
A 1 ml de NaOH 2N, gota a gota CuSO4 a 1%. (ler a interpretação).
05. Precipitação no Ponto Isoelétrico
Preparar uma série de tubos da seguinte maneira:
	Tubos
	 Tampão	
	Acetato de sódio	
	
	Solução	de
Gelatina
	
	PH = 6,0
	PH = 4,7
	PH = 3,5
	
	1
	2 ml
-
-
	-
2 ml
-
	-
-
2 ml
	2 ml
	2
	
	
	
	2 ml
	3
	
	
	
	2 ml
Homogenizar. Adicionar 7 ml de Etanol a 95% a cada um dos 3 tubos. Observar os tubos após 20 minutos e concluir qual é o valor de pI da gelatina.
F - RELATÓRIO
01. Discutir os resultados obtidos em cada item da prática.
02. Fazer um gráfico no qual se estabeleça a relação entre temperatura e perda de cor das soluções obtidas no procedimento 1.
03. Explicar o fenômeno da precipitação salina.
04. Construir um gráfico de pH em função da solubilidade para procedimento 5, mostrando que a solubilidade é mínima no pH correspondente ao pI da gelatina.
05. Em que condições de pH, as proteínas são melhor precipitadas:
a) por reagentes de alcalóides?
b) por sais de metais pesados?
AULA PRÁTICA No 04 PROPRIEDADES DAS ENZIMAS A - OBJETIVOS ESPECIFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Manipular experimentalmente soluções de enzimas.
02. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidades.
03. Manipular reações catalizadas por enzimas com a finalidade de determinar semi- quantitativamente a influência da concentração de enzima, da temperatura e do pH na atividade enzimática.
04. O significado das operações e reações realizadas.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· pipetas graduadas de 1 ml
· tubos de ensaio e suporte
· banho maria a 37o C e banho de gelo
· 1 bico de gás
· 1 termômetro
· algodão
· 1 espátula
· 1 béquer de 200 ml
· 3 béqueres 100 ml
· suporte de pipeta
· pinça de tubo de ensaio
· conta-gotas
C - REAGENTES
· Éter ou parafina
· Solução de sacarase (levedo de padaria 1g%)
· Solução de sacarosea 1%
· Solução de amido a 5%, 0,5%
· Reagente de Benedict
· Lugol
D – INTERPRETAÇÃO
A saliva contém uma enzima digestiva chamada amilase salivar que hidrolisa amido e glicogênio até maltose (dissacarideo redutor). A sacarase é também uma enzima digestiva presente no suco intestinal que hidrolisa a sacarose até glicose e frutose (monossacarideos redutores).
Na pesquisa I, observa-se a propriedade "especificidade enzimática", isto é, a sacarase não hidrolisa o amido e a amilase salivar não hidrolisa a sacarose.
Os resultados obtidos na pesquisa II mostram que as enzimas são termolábeis, isto é, perdem sua atividade quando aquecidas a altas temperaturas.
A pesquisa III demonstra que quanto maior é a concentração da enzima maior é a intensidade de hidrólise evidenciada pela maior quantidade de redução de cobre. O 4o e 5o tubos funcionam como controles.
Com a pesquisa IV é constatada a influência da temperatura sobre a atividade das enzimas.
A pesquisa V mostra a influência do pH na atividade enzimática. Todas as enzimas possuem um pH ótimo, cuja atividade é máxima. No caso de pepsina este pH é em torno de 1,5.
E – PROCEDIMENTO
Coletar 1 ml de saliva e adicionar 9 ml de H2O destilada.
I - ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA
01. Colocar respectivamente em quatro tubos de ensaio numerados:
· 1o - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de sacarose a 1%
· 2º - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de amido a 5%
· 3º - 1 ml de saliva + 1 ml de sacarose a 1 %
· 4º - 1 ml de saliva + 1 ml de amido a 5%
02. Deixar ` temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos.
03. Adicionar, em seguida, a cada um dos tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
04. Observar os resultados notando em quais tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).
II - TERMOLABILIDADE
01. Colocar respectivamente em dois tubos de ensaio numerados. 1o - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada. Ferver e resfriar. 2o - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada.
02. Adicionar a ambos os tubos 1 ml de sacarose a 1%.
03. Incubar os dois tubos em banho maria a 37oC por 10 minutos.
04. Adicionar aos 2 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
05. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).
III - INFLUÊNCIA EM CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
01. Colocar respectivamente em 5 tubos de ensaio numerados:
1º - 0,2 ml de sacarase + 0,8 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%. 2º - 0,5 ml de sacarase + 0,5 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%. 3º - 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de sacarose.
4º - 1,0 ml de H O destilada + 1,0 ml de sacarose. 5º 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de H O destilada.
02. Adicionar aos 5 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.
03. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).
IV - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver as seguintes técnicas:
	Tubos
	Amido 5% (ml)
	Água Destil. (ml)
	Enzima (ml)
	Temperatura para Incubação
	1
	2,5
	2,5
	-
	30 – 37oC
	2
	2,5
	2,0
	0,5
	30 – 37oC
	3
	2,5
	2,0
	0,5
	0 – 10oC
	4
	2,5
	2,0
	0,5
	70 – 100oC
Agitar os tubos e incubá-los nas respectivas temperaturas durante 15 minutos. Adicionar 2 gotas de lugol em cada tubo e agitá-los virogorosamente. Observar os resultados.
V - INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÀTICA
Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver a seguinte técnica:
	Tubos
	Amido	5% (ml)
	Tampão pH 3,0 (ml)
	Tampão pH 7,0 (ml)
	Tampão pH 12 (ml)
	H2O	dest. (ml)
	Enzima (ml)
	1
	2,5
	-
	-
	-
	2,5
	-
	2
	2,5
	2,0
	-
	-
	-
	0,5
	3
	2,5
	-
	-
	-
	-
	0.5
	4
	2,5
	-
	2,0
	2,0
	-
	0,5
Agitar os tubos e incubá-los em condições ambientais (30 - 37 C) durante 15 minutos.
Adicionar 1 gota de lugol em cada tubo e agitá-los vigorosamente. Observar os resultados.
VI - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver a seguinte técnica:
	Tubos
	Amido 5% (ml)
	H2O destilada (ml)
	Enzima (ml)
	1
	1,0
	3,5
	0,5
	2
	2,0
	2,5
	0,5
	3
	3,0
	1,5
	0,5
	4
	4,0
	0,5
	0,5
Agitar os tubos e incubá-los em condições ambientais (30 - 37 C) durante 15 minutos.
Adicionar 2 gotas de lugol em cada tubo e agitá-los vigorosamente. Observar os resultados.
F - RELATÓRIO
01. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função da concentração de enzima.
02. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função da temperatura.
03. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função do pH.
04. Das propriedades estudadas nesta aula prática qual é mais característica da catálise enzimática?
05. Explicar porque o aquecimento até fervura determina perda de atividade das enzimas.
06. Citar as enzimas, seus respectivos substratos e produtos que foram utilizados neste trabalho prático.
	
	Enzimas
	Substratos
	Produtos
	a.
	
	
	
	b.
	
	
	
	c.
	
	
	
07. Mostrar os resultados observados em cada experimento.
AULA PRÁTICA No. 05 IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Executar testes qualitativos para reconhecimento de glúcides.
02.O significado dos seguintes testes: iodo, Benedict, Seliwanoff, Molish. 03.Aplicar os testes acima para identificar três glúcides desconhecidos.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· tubos de ensaio e suporte
· 1 bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca
· 1 pinça para tubo de ensaio
· 1 bastão de vidro fino
· lâmina e microscópio
C - REAGENTES
· Soluções padrões de glúcides (ver relatório)
· Soluções de 3 glúcides desconhecidos,
· Solução de lugol: 0,5 g iodo metálico, 1,0 g iodeto potássio, dissolvidos em 100,0 ml de água
· Regente de Benedict: 17,3 g sulfato de cobre, 173,0 g citrato de sódio e 100,0 g carbonato de sódio anidro dissolvidos em 1.000,0 ml de água
· Reagente de Seliwanoff: 0,05 g ressorcinol dissolvidos em 100,0 ml HCl + 6 N.
· Solução alcoólica de alfa-naftol a 1%
· H2SO4 concentrado.
D – INTERPRETAÇÃO
Este experimento pode servir de modelo para caracterizá-1o dos constituintes de material biológico por meio de um conjunto de reações qualitativas. Pelo sistema de identificação e eliminação progressiva pode-se dizer, ao final do trabalho prático, quais foram os glúcides fornecidos dentre os seguintes: glicerose, glicose, frutose, lactose, manose, sacarose e amido, por exemplo.
01. O teste de iodo serve para diferenciar homopolissacárides dos outros glúcides. Os homopolissacárides, do tipo amido, formam com o iodo um complexo (produto de adsorção) colorido.
Pela coloração resultante pode-se identificar, por exemplo: azul-amido; avermelhado-glicogênio; roxo avermelhado-dextrinas, incolor-inulina.
02. O teste de Benedict serve para diferenciar glúcides redutores de não redutores. Glúcides que tenham 1 carbono anomérico livre dão reações positivas, pois podem sofrer oxidação. A solução de Benedict contém um complexo de citrato e cobre. Em presença de açúcar redutor o Cu+2 (azul) é reduzido a Cu+, que é menos solúvel em solução alcalina, e precipita sob a forma de Cu2O (amarelo ou vermelho). O açúcar, por sua vez, é oxidado, quebrado e polimerizado na solução.
03. O teste de Seliwanoff serve para diferenciar cetoses (por exemplo: frutose, sacarose) de aldoses (glicose, lactose).
Cetoses, quando em solução ácida e aquecimento, formam composto 4- Hidroximetil furfural que reage com o resorcinol (reagente de Seliwanoff) dando um produto de cor vermelha, cuja estrutura não é bem conhecida.
Açúcar
H2SO4	 composto vermelho

As Soluções concentradas de Aldoses também dão reação positiva, porém a velocidade da reação é pequena. Assim, corre-se um padrão contendo cetose (frutose, por exemplo) para, se fazer um controle do tempo de formação do produto colorido.
04. O teste de Molish serve para diferenciar açúcares de 5 ou mais átomos de carbono dos de menor número de átomos de carbono. Os de maior número de carbono (5 ou mais), sob a ação desidratante ao H2SO4, transformam-se em furfural ou Hidroximetil furfural. Estes reagem com os fenóis(no caso, o -naftol) dando origem a um composto marron-avermelhado. Para o bom êxito desta reação é necessário que o tubo de ensaio esteja bem seco e que haja a menor agitação possível.
E - PROCEDIMENTO
Para esta unidade prática o estudante deverá preparar antes de começar a mesma o quadro geral de reações de glúcides que consta no Relatório. Quando houver dúvida num resultado de reação, deve- se realizar o mesmo teste empregando a solução do glúcide padrão suposto. Não há necessidade de se medir com pipetas os reagentes fornecidos. Usar gotas, considerando que 1 ml = 20 gotas. Para as Soluções de glúcides desconhecidas, tomar volumes aproximados.
I - TESTE DE IODO
01. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução de glúcide a ser identificado.
02. Adicionar 1 gota da solução lugol. O aparecimento de coloração azul, indica reação positiva.
03. Ler a interpretação.
II - TESTE DE BENEDICT
01. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.
02. Adicionar 1 ml do reagente de Benedict e misturar.
03. Aquecer, com agitação e diretamente, na chama. Deixar em ebulição por + 1 minuto.
04. Observar a solução. A mudança de coloração (azul para verde até vermelho tijolo) e/ou formação de precipitado (cor de tijolo) indica reação positiva.
05. Ler a interpretação.
III - TESTE DE SELIWANOFF
01. Colocar em um tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.
02. Colocar em um tubo + 0,5 ml da solução de frutose (C = controle).
03. Acrescentar a cada um dos tubos 1 ml de reagente de Seliwanoff e misturar.
04. Colocar os tubos num banho de água em ebulição.
05. Observar periodicamente. No momento em que a coloração do tubo C ficar vermelha, retira-se os tubos do banho.
06. Comparar o tubo D com o controle. O aparecimento da cor vermelha indica reação positiva.
07. Ler a interpretação.
IV - TESTE DE MOLISH
01. Colocar em um tubo de ensaio seco + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.
02. Acrescente 3 gotas da solução alcoólica de alfa-naftol e misturar.
03. Gotejar + 2 ml de H2SO4 concentrado pela parede do tubo inclinado, de modo que os dois líquidos não se misturem. Voltar, cuidadosamente, o tubo à posição vertical.
04. Deixar em repouso. O aparecimento de estrias ou de anel roxo na superfície da separação dos dois líquidos indica reação positiva.
05. Ler a interpretação.
F - REALTÓRIO
Preencher a tabela abaixo, marcando os testes positivos com (+) e os negativos com (-).
	
	IODO
	BENEDICT
	SELIWANOFF
	MOLISH
	Glicerose Glicose Frutose Lactose Maltose
Sacarose Amido
	
	
	
	
	Desconhecido A-
B-
C-
	
	
	
	
AULA PRÁTICA No 06 FERMENTAÇÃO ALCÓOLICA I- INTRODUÇÃO
Glicólise é o processo pelo qual os organismos vivos degradam glicose em ácido lático na ausência de oxigênio molecular, para propósitos de obtenção de energia química. É uma das várias vias usadas por diferentes espécies de organismos para degradar glicose anaerobicamente e que são conhecidos genericamente como fermentações. A glicólise é o tipo de fermentação anaeróbica da glicose que ocorre nas células dos animais superiores e em muitas plantas e microrganismos.
Um outro tipo de fermentação da glicose é a fermentação alcoólica de leveduras em que a glicose é degradada em Etanol e Dióxido de Carbono. A glicólise e a fermentação alcoólica possuem vias aproximadamente idênticas. A via comum é a formação de Piruvato. Na glicólise o Piruvato é reduzido a lactato:
Piruvato + NADH + H +  lactado + NAD+
Na fermentação alcoólica o Piruvato é descarboxilado em presença da enzima Piruvato descarboxilase:
CH3 – C – COO- + H+  CH3 – C-H + CO2
||	||
O	O
No passo final da fermentação alcoólica o Acetaldeído é reduzido a Etanol pela NADH + H+, uma reação catalizada pela desidrogenase alcoólica.
CH3C – H + NADH + H+  CH3 – CH2OH + NAD+
|| O
A equação global da fermentação alcoólica pode ser escrita:
C6H12O6 + 2Pi + 2ADP  2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O
Em adição, podemos dizer que todos os organismos heterotróficos obtêm sua energia de reações de oxidação-redução, isto é, reações nas quais elétrons são transferidos de um composto, o doador de elétrons, ou agente redutor para um aceptor de elétrons, o agente oxidante. Na fermentação alcoólica o oxidante final ou aceptor de elétrons é alguma molécula orgânica, produzida no próprio processo de fermentação que no caso é o Acetaldeído.
II- MATERIAL E MÉTODOS
Em um balão de fundo de 1000 ml(A) acrescentar 200 ml de solução aquosa de Sacarose a 15%. À parte, num gral, suspender 1/2 tablete de fermento Fleischmann (fermento de padaria) finamente esmiuçado, em 100 ml de água destilada. Juntar suspensão de fermento a solução aquosa de Sacarose; agitar para que a suspensão se torne uniforme. Obturar a boca do balão com uma rolha atravessada por um tubo curvo(B) que vai até no fundo do tubo (C), passando pela rolha que a obtura. O tubo C (25 x 180mm) contém aproximadamente 20 ml de uma solução saturada de Hidróxido de bário (Ba(OH)2.8H2O) (aproximadamente 6 g%), a rolha deste tubo é ainda atravessada por um tubo com bulbo contendo Hidróxido de bário (D).
Agitar, em um agitador magnético, a suspensão celular, para homogeinização. Notar a passagem de gás na solução de Hidróxido de bário. Como o gás (CO2) borbulha, um precipitado de carbonato de bário (BaCO3) será formado. Deixar fermentando aproximadamente por 2 (duas) horas.
Desmontar o aparelho. Deixar o tubo C em repouso para sedimentação. Decantar o sobrenadante e lavar por decantação com água destilada o precipitado de Carbonato de bário formado.
Suspender o precipitado em aproximadamente 15 ml de água destilada. Colocar 1 ml da suspensão, em tubo de ensaio, e juntar gotas de ácido clorídrico a 10%. Notar a efervescência (produção de CO2).
III- REAÇÕES
1. Formação de Carbonato de bário: Ba(OH)2 + CO2  BaCO3 + H2O
2. Liberação de CO2:
BaCO3 + 2HCl  BACl2 + H2O + CO2
Conectar o balão a um condensador (ver figura abaixo) e destilar, recolhendo as primeiras porções do destilado (aproximadamente 15 ml).
Pesquisar álcool etílico no destilador. Para isso colocar 1 ml em um tubo de ensaio e alcalinizar com 3 gotas de solução de Hidróxido de sódio a 10%. Adicionar Lugol diluído (ver abaixo) gota a gota, com agitação, até persistência de coloração amarelada (excesso de iodo). Deixar em repouso para sedimentação.
Inicialmente, pela adição de Lugol, a solução torna-se opalescente. Em excesso do iodo forma- se iodofórmio, um precipitado amarelo de cheiro característico. Com auxílio de pipeta, retirar pequena porção do precipitado a verificar ao microscópio os cristais formados.
LUGOL DILUÍDO
Iodo metálico	0,5 g
Iodeto de potássio	1,0 g
água destilada	100 ml Reações para formação de iodofórmio:
CH3CH2OH + I2 + 2NaOH  CH3CHO + 2NaI + 2H2O CH3CHO + 3I2 + 4NaOH  CHI3 + 3H2O + 3NaI + HCOONa
IV- TESTE ADICIONAL
A uma pequena porção do destilado inicial, em vidro de relógio, acender chama verificando ser inflamável (teste inicial). Proceder aos testes para comprovar formação de Etanol, usando iodo, e verificar produção de Carbonato de bário no tubo coletor e gás.
V- QUESTÕES PARA RESPONDER NO LABORATÓRIO
01. Qual a enzima responsável pela hidrólise de Sacarose, presente na levedura?
02. A frutose produzida pela hidrólise será metabolizada? Como?
03. Qual o Saldo em ATP's formados a partir de um mol de Sacarose?
04. Lactato produzido no músculo é 1utilizado par formação de Glicose? Etanol, em presença de levedura, é substrato para formar Glicose? Por quê?
05. Se adicionarmos Iodoacetato ou Fluoreto ao balão contendo levedura e Sacarose haverá produção de Etanol? Por quê? Qual o composto que se acumula no meio de reação?
06. Um substrato do Ciclo dos ácidos tricarboxilicos, poderia formar Etanol em presença de levedura? Explicar dando exemplo.
07. Qualquer componente da via glicolítica pode servir como substrato para fermentação alcoólica? Por quê?
08. Em ausência de NADH + H+ a fermentação se processaria? Porque?
AULA PRÁTICA No 07 pH, TAMPÕES
A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta parte da aula práticao estudante deverá saber:
01. Definir pH e reconhecer sua importância nos sistemas biológicos.
02. Transformar concentração de H em pH e vice-versa.
03. Definir indicadores e usá-los adequadamente.
04. Definir sistemas tampões, explicar como funcionam e observar seu efeito.
05. Usar a equação de Henderson-Hasselbalch.
B - MATERIAL
· Tubos de ensaio e suporte
· Pipetas graduadas de 1,00 - 5,0 e 10,0 ml
· Bequer de 100 ml
C - REAGENTES
· Ácido clorídrico 0,1 N
· Ácido acético 0,1 N
· Hidróxido de sódio 0,1 N
· Reativo de Topfer: solução alcoólica de p-dimetilaminoazobenzeno a 0,5%.
· Soluções Tampões de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.
· Indicador Universal: 0,05 g laranja de metila; 0,15 g vermelho de metila; 0,30 g azul de bromotinol; 0,35 g fenolftaleina, dissolvidos em 1 litro de álcool 66%.
D - INTERPRETAÇÃO
Os seres vivos são equipados com mecanismos que regulam o pH de seus líquidos intra e extra celulares dentro de limites muito estreitos. Embora ácidos e bases sejam formados constantemente no metabolismo, a concentração hidrogeniônica varia muito pouco, em virtude da presença de sistemas tampões eficientes nos tecidos e líquidos do organismo. O pH do sangue, por exemplo, deve se conservar entre 7,0 e 7,8 para ser compatível com a vida. É portanto, importante que o estudante compreenda o significado de pH, o papel e o mecanismo da ação dos tampões.
01. Concentração hidrogeniônica (pH) - A acidez de uma solução pode ter DUAS significações. Primeira: medida da quantidade total de íons H , dissociadas ou dissociáveis, encontrados em uma solução. É chamada acidez titulável ou total e depende apenas da concentração do ácido. Segunda: medida de quantidades de íons H+ livres na solução. Esta depende da concentração do ácido e de sua constante de dissociação. Costuma-se expressar a concentração de íons H em moles por litro. Mas nos sistemas biológicos seus números são muito pequenos, por isso Sobrensen sugeriu que se adotasse a termo pH, definindo-o da seguinte forma:
pH  log
1
H  
  logH  
Exemplos de transformações de [H ] em pH e vice-versa:
a) Dada a concentração hidrogeniônica igual a 0,00634 M ou 6,34 x 10-3M, calcular o pH.
[H+] = 6,34 x 10-3M
log [H+] = log (6,34 x 10-3) = log 6,34 + log 10-3
log [H+] = 0,8021 + (-3) = - 2,1979
- log [H+] = 2,20; portanto pH = 2,20
b) Dado o pH 2,20, determinar a concentração hidrogeniônica. [H+] = 10-pH = 10-2,20 = 10-3,0 x 10+0,8
Se log = 0,8, então y = 6,3l
portanto [H] = 6,31 x 10-3 M ou 0,00631 M
02. Indicadores - São substancias usadas para determinar valores de pH, podendo ser por isso utilizadas também em alcalimetria e acidimetria. Quimicamente são ácidos ou bases orgânicos fracos cuja forma dissociada apresenta uma cor diferente de forma não dissociada.
Exemplo: HIn -------- H+ + In- vermelho	amarelo
Por isso a predominância de uma ou outra das cores dependerá da concentração de íons H+ no meio. Quando o indicador está 50% dissociado e 50% não dissociado, diz-se que o mesmo está no seu ponto de viragem. Isso ocorre num intervalo definido para cada indicador, como pode-se observar na tabela abaixo:
Tabela 1 - Características dos indicadores (Clark e Lubs)
	Indicador
	PKIn
	Cores e Zonas do pH
	Azul de timol Amarelo de metila Laranja de metila Azul de bromofenol Verde de bromocresol Vermelho de metila Clorofenol
Púrpura de bromofenol Azul de bromotimol Vermelho de fenol Cresol
Azul de timol Fenolftaleina
	1,7
3,3
3,5
4,0
4,7
5,0
6,0
6,2
7,1
7,8
8,3
8,9
9,7
	Vermelho 1,2 – 2,8 amarelo
Vermelho 2,9 – 4,0 amarelo
Vermelho 3,1 – 4,4 amarelo
Amarelo 3,1 – 4,7 azul
Amarelo 3,8 – 5,4 azul
Vermelho 4,2 – 6,3 amarelo
Amarelo 5,1 – 5,7 vermelho
Amarelo 5,4 – 7,0 púrpura
Amarelo 6,1 – 7,7 azul
Amarelo 7,0 – 8,6 vermelho
Amarelo 7,4 – 9,0 vermelho
Amarelo 8,0 – 9,6 azul
Incolor 8,3 – 10,0 vermelho
Se adicionarmos algumas gotas de solução de um dos indicadores mencionados na tabela à uma solução de pH desconhecido, um deles se encontrará em sua zona de transição apresentado cor intermediária, tendo-se desta forma, medida aproximada do pH da solução.
a) Indicador Universal - é uma mistura adequada de indicadores que apresenta variação de cor em toda escala de pH. é usado na determinação aproximada do pH.
Tabela 2 - Coloração do Indicador Universal em vários pH
	PH
	Cor
	PH
	Cor
	3 ou menos
4
5
6
7
	Vermelho Vermelho-laranja Laranja
Amarelo Verde amarelo
	8
9
10
11 ou mais
	Verde-azulado Azul
Violeta púrpura
b) Papel indicador - em vez da solução de indicador costuma-se usar também um papel impregnado de indicador, que também determina aproximadamente o pH. É o papel indicador.
NOTA: O pH de uma solução pode ser também determinado de modo muito preciso por meio de potenciômetros, aparelhos que medem a diferença de potencial entre uma solução contendo uma quantidade conhecida de íons H e a solução desconhecida. Esta diferença é diretamente proporcional à concentração de íons H .
03. Tampões - Soluções tampões são sistemas que tendem a manter constantes seu pH quando a eles é adicionado ácido ou alcali. Este sistema consiste geralmente de uma mistura de ácido fraco e seu sal. O pH de uma solução tampão depende das proporções relativas de seus componentes. A dissociação de um ácido fraco HA pode ser expressa por:
AH	A- + H+
Introduzindo a constante de dissociação (K ), rearranjando e tomando os logaritmos,
tem-se:
A   H  	1	1	A  
K a 
AH
1
, donde
1
H  
 K . AH , e
A  
log		
H
= log
+ log
K
 
AH
por definição, pH = log
1
H  
. Chamando log 1
K
de pK,
tem-se:
pH = pK + log
A  
 
AH
Em uma mistura de ácido fraco e seu sal de alcali forte, praticamente todos os ânions provém do sal, pois o ácido está pouco dissociado. Pode-se então escrever:
sal
pH = pK + log acido
Vê-se que o pH de uma solução tampão depende não das concentrações absolutas mas das concentrações relativas do ácido e do sal. A relação acima é a clássica equação de Henderson-Hasselbalch para as soluções tampões e deve ser empregada na resolução dos problemas.
E - PROCEDIMENTO
I- CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO E pH
01. A partir de HCl 0,1 N, preparar 0,01N, 0,001 N, 0,0001 N, 0,00001 N, 0,000001 N.
02. Calcular o pH aproximado de cada solução, supondo que o ácido esteja completamente dissociado (consultar a parte teórica).
03. Adicionar a cada tubo 1 gota de reativo de Topfer e misturar, sem inversão.
04. Observar a cor correspondente a cada tubo e conservá-los para comparação.
05. Determinar o pH aproximado de uma solução de ácido acético 0,1 N, usando o indicador de Topfer e comparando com os tubos de HCl de pHs conhecidos (usar 9 ml de ácido acético 0,1 N e 1 gota de reativo de Topfer). Anotar os resultados.
06. Ler a interpretação.
II- DEMONSTRAÇÃO DO EFEITO TAMPÃO
01. Tomar 8 tubos de ensaio iguais. Colocar no primeiro 1,0 ml de tampão pH 3, no segundo 1,0 ml de tampão pH 4 e assim sucessivamente, até tampão pH 10. Acrescentar a cada tubo 9,0 ml de água destilada. Adicionar a cada tubo 5 gotas de indicador universal. Misturar sem inversão. Observar as cores formadas e comparar esta escala com as cores indicadas na tabela 2 do item D-2. Conservar esta escala de pH.
02. Tomar outros 4 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 4. Colocar 5 gotas de indicador universal em cada um.
03. Aos tubos 1 e 3 adicionar 10 ml de água destilada.
04. Aos tubos 2 e 4 adicionar 1,0 ml de tampão pH 7 e 9,0 ml de água destilada.
05. Acrescentar aos tubos 1 e 2, 2 gotas (2) de NaOH 0,1 N. Misturar, sem inversão. Observar se há mudanças de pH, comparando com a escala preparada no item 1. Anotar.
06. Por meio de uma pipeta de 1 ml soprar ar através da solução do tubo até que não se verifique mais mudança de cor da solução. Determinar o pH, comparando a escala e anotar.
07. Com a mesma técnica descrita no item anterior, soprar no tubo 2 por um tempo mais prolongado. Anotar o que foi observado.
08. Tratar os tubos 3 e 4 como no item 5, usando HCl 0,1 N em vez de NaOH 0,1 N.
09. Continuar a adição de HCl 0,1 N ao tubo 4,gota a gota. Determinar quantas gotas de ácido devem ser acrescentadas até que se obtenha a mesma cor do tubo 3.
10. Ler a interpretação.
F – RELATÓRIO
TRABALHO ITEM I
a) Qual é o pH aproximado do ácido Acético 0,1 N?
b) Como se explica a diferença de pH entre o ácido acético 0,1 N?
c) A acidez titulável de volumes iguais de HCl e CH3 COOH na mesma concentração é (igual/diferente).
Trabalho Item II
a) Houve variação detectável de pH pela adição de NaOH ao 	
 	(tubo	1/tubo	2).	Porque?	 	
b) Soprando através de uma pipeta nos tubos 1 e 2 houve maior variação de pH no
 	(tubo 1/tubo 2).
c) Soprando no tubo 2 durante muito tempo 	 (conseguiremos/não conseguiremos) abaixar seu pH do tubol. Isso se explica porque
d) Quantas gotas de HCl 0,1 N foram adicionadas ao tubo 4 para atingir o mesmo pH atingindo no tubo 3 com 2 gotas de HCl 0,1N?
EXERCÍCIOS PARA CASA
Estes problemas devem ser resolvidos em casa e constituem uma aplicação da equação de Henderson-Hassalbach.
Considerando-se o sistema tampão ácido acético/acetato e sabendo-se que pK do ácido acético é 4,70, calcular:
a) O pH de uma solução resultante da adição de 30 ml de ácido acético 0,1 M a 30 ml de acetato de sódio 0,1 M.
b) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5 ml de HCl 0,1 N à solução obtida em a.
c) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5 ml de HCl 0,1 N a uma solução obtida diluindo-se 7 ml do tampão obtido em a com 93 ml de H2O destilada.
d) O pH da solução resultante da adição de 70 ml de ácido acético 0,2 M a 30 ml de acetato de sódio 0,2 M.
e) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5ml de HCl 0,1 N à solução obtida em d.
f) A concentração de H da solução obtida em d.
AULA PRÁTICA No 08
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDIOS A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Caracterizar triacilgliceróis através de hidrólise alcalina (saponificação).
02. Evidenciar a formação de produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades.
03. Caracterizar um esterol através de suas reações de coloração.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· 1 béquer de 100 ml
· 1 béquer de 250 ml
· buretas
· tubos de ensaio grandes
· agitador
· pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 ml)
· papel de filtro (2)
· bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca
· funil (2)
· termômetro
· balança analítica
· papel manteiga
· fotocolorímetro (filtro vermelho)
C - REAGENTES
· Soja moída e seca
· Acetona
· Solução de potassa alcoólica: - 1 volume de KOH a 40% + 1 volume etanol a 95%.
· óleo vegetal (ou gordura)
· ácido acético concentrado
· Solução de Cloreto de cálcio a 10%
· Solução saturada de cloreto de sódio
· Solução clorofórmica de colesterol a 0,1%
· ácido sulfúrico concentrado
· Soro humano.
D - INTERPRETAÇÃO
O termo lipídeo aplica-se a uma grande variedade de compostos que se caracterizam em geral:
01. Pela insolubilidade em água e pela solubilidade em solventes orgânicos tais como o clorofórmio, éter, benzeno, mistura de FOLCH (clorofórmio + metanol), etc.
02. Pela presença de ácidos graxos esterificados;
03. Pela sua utilização por parte dos seres vivos, onde desempenham importantes funções fisiológicas.
A grande maioria dos lipídios apresenta ácidos graxos esterificados em sua estrutura, abrangendo os acilgliceróis ou glicerídeos, os cerídeos, os fosfolipídios e os glicolipídeos.
Esta família de compostos mediante aquecimento na presença de bases fortes como o NaOH ou KOH produzem os sais de sódio ou potássio dos ácidos graxos que participam da estrutura original, ou seja, os sabões alcalinos. Devido a esta propriedade, essa classe corresponde aos LIPÍDIOS SAPONIFICÁVEIS que podem então ser caracterizados, entre outros ensaios, pela saponificação.
Outros compostos enquadrados como lipídios são os ESTERÓIDES e os TERPENOS, os quais em sua forma livre, são denominados de LIPÍDIOS não SAPONIFICÁVEIS. Sua caracterização pode ser procedida por reações de formação de cor. Certos esteróides hidroxilados (= esteróis como por exemplo o colesterol) podem em parte, ocorrer nos organismos vivos sob forma esterificada e sua hidrólise ácida ou alcalina libera o esterol livre.
01. Com o procedimento de extração acima descrito obtemos o óleo da semente de soja utilizando da acetona como solvente. Pode-se utilizar também o dietil éter.
02. O teste de caracterização. No teste de Saponificação (hidrólise alcalina) de triacil-gliceróis ou triglicerídeos, o óleo é saponificado (significando, formação de sabão), obtendo-se uma solução opalescente de sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol. Esta é a primeira reação química envolvida na produção de sabões para uso doméstico a partir de triacilgliceróis.
Exemplo:
	
	
	CH3
|
	CH3

	
	
	
	(CH2)7 CH2OH
|
	(CH2)7
|
	
	H2C-O-CO-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH3

	Etanol
100oC, 30 min
Oleato de (sabão)
	3.CH + CHCO(3)
||
	CH	+
||
	CH2OH
|
	HC-O-CO-(CH2)7.CH=(CH2)7CH3+3KOH

	
	CH CH2OH

	CH
|
	HOCH
|
	H2O-O-CO-(CH2)7.CH=CH(CH2)7CH3
Trioleil glicerol ou trioleína
	
	(CH2)Glicerol 7

	(CH2)7
|
	CH2OH
	
	
	C=O
	C = 0
|
	Glicerol
	
	
	OK
	OK
	
	
	
	K
	Oleato de
Potássio (sabão)
	
03. Propriedades dos sabões. A formação de espuma é devido a uma diminuição da energia de coesão das moléculas (tensão superficial).
O aparecimento de um precipitado branco de ácidos graxos é que a reação tende para a formação de ácidos graxos que são insolúveis devido ao seu baixo grau de dissociação sendo portanto, compostos muito menos polares que os sabões.
Exemplo:
CH3
CH3.(CH2)7.CH=CH.(CH2)7COOK+ + |  CH3.(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH	+	CH3.COO-K+
COO-K+
Oleato de potássio	ácido acético	ác. Oleico	acetato
(insolúvel)	(insolúvel)	de K
O aparecimento de um precipitado de sabões de cálcio resulta de que os sabões de metais alcalino terrosos são insolúveis porque se encontram praticamente não dissociados.
Exemplo:
2CH3.(CH2)7.CH=C.CH(CH2)7COO-K++CaCl2CH3(CH2)7.CH=CH(CH2)7COOCa + 2KCl
oleato de potássio		cloreto	Oleato de	Cloreto de K de cálcio		Cálcio
A precipitação de sabões pela adição de excesso de sais neutros pode ser explicada pelo efeito do íon comum, que reprime a dissociação dos sabões, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem.
04. Os esteróides formam um grupo de compostos biológicos que apresentam em sua estrutura um grupo químico comum: o ciclopentanoperidrofenantreno (corresponde à estrutura anelar geminada C1 até C10 da figura (a)).
(a) colesterol	ácido graxo	(b)
Por suas propriedades de solubilidade análoga à dos lipídeos, os esteróides são classificados entre estes, embora sua estrutura e propriedades biológicas sejam diferentes.
Os esteroídes mais abundantes são os esteróides que são alcóois de esteróides. O colesterol é o principal esterol nos tecidos animais (estruturas completa representada acima). Observa-se pela figura que o colesterol apresenta uma função alcoólica em C3, uma insaturação entre C 5 e C6 e uma cadeia alquil substituintes em C17. No organismo o colesterol pode se apresentar livre ou esterificado com ácidos graxos, através do grupo alcoólico em C3 (ester de colesterol, figura (c).
O colesterol é percursor de outros esteróides importantes como ácido biliares, esteróides fecais (coprostanol e colestan) e hormônios esteróides.
O colesterol e outros esteróis podem ser evidenciados através de reações de coloração.
Reação de Salkowski (qualitativa). Essa reação é comum para os esteróis de uma maneira geral. O aparecimento da cor vermelha é própria de esteróis que são insaturados no anel A ou B ou em ambos dando origem a cromóforos, fato que serve para distingui-los dos que possuem anel A ou B saturados.
E – PROCEDIMENTO
I - EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DE SEMENTES DE SOJA
01. Em um erlenmeyer de 100 ml pesar 10 g de soja moída e seca.
02. Adicionar 25 ml de acetona e agitar por 5 minutos. (shoker).
03. Filtrar através de papel de filtro, para um béquer, de peso conhecido, anotando seu valor.
04. Lavar o resíduo com 5 ml de acetona por 2 vezes, e evaporar o filtrado em banho-maria, à temperatura de 97oC com agitaçãoconstante até a eliminação total da acetona.
05. Observar o resíduo amarelo e oleoso, pesar novamente o béquer e por diferença de peso calcular o rendimento da extração.
06. Este óleo será 1utilizado como material para as provas de caracterização.
07. Ler a interpretação.
II - CARACTERIZAÇÃO
Saponificação (hidrólise alcalina) de triacil-gliceróis ou trigliceróis.
01. Em um tubo de ensaio grande, colocar 15 gotas de óleo vegetal e 5 ml de solução de potassa alcoólica.
02. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos.
Propriedades dos sabões
01. Repartir a solução de sabões obtida na experiência anterior em 3 tubos de ensaio e realizar os seguintes testes.
a) Diminuição da tensão superficial - Agitar a solução de sabões e verificar a formação de espuma.
b) Precipitação de ácidos graxos - A este mesmo tubo adicionar, gota a gota, ácido acético concentrado até notar o aparecimento de um precipitado branco de ácidos graxos.
c) Precipitação de sabões de cálcio - Ao segundo tubo adicionar cloreto de cálcio a 10%, gota a gota, até notar aparecimento de um precipitado de sabões de cálcio.
d) Precipitação por excesso de eletrólitos - Ao terceiro tubo, adicionar um volume igual de solução saturada de cloreto de potássio . Observar a formação de um precipitado de sabão por excesso de eletrólitos.
III - ESTERÓIDES: CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DO COLESTEROL
Reação de Salkowski (qualitativa)
01. Em um tubo de ensaio bem seco pipetar 1 ml da solução de colesterol a 0,1% + 1 ml de ácido sulfúrico concentrado.
Observar o desenvolvimento de cor vermelha.
F - RELATÓRIO
I- Dizer o que foi observado em cada teste feito. II- Responder
01. Escrever a reação de hidrólise alcalina de um triglicerídeo (ou triacilglicerol; TAG, diferente do exemplo).
02. Explicar a ação detergente dos sabões.
02. Explicar a precipitação de sabões por excesso de eletrólitos.
AULA PRÁTICA No 09
PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO LEITE A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Separar proteínas do leite por precipitação e decantação.
02. Identificar a presença de proteínas sem líquidos biológicos pelo teste de biureto.
03. Identificar em líquidos biológicos a presença de gordura, lactose, fósforo, cálcio e cloretos.
04. Definir pI.
05. Explicar o significado das reações e operações realizadas.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· 1 erlenmeyer de 250 ml
· 1 bequer de 100 ml
· 1 bequer de 250 ml
· tubos de ensaio e suporte
· pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 ml)
· bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca
· algodão: filtração em algodão
· funil
· vidro de relógio ou placa de Petri
C - REAGENTES
· leite
· água destilada
· ácido acético 5%
· álcool absoluto
· éter
· - solução de NaOH a 10%
· solução de CuSO4 a 1%
· reagente de Benedict
· solução de molibdato de amônio a 5%
· leite x
· leite y
· reagentes de Sulkovitch: 2,5 g ácido oxálico; 2,5 g oxalato de amônio; 5,0 ml ácido acético glacial; água q.s.p. 150 ml
· NHO3 concentrado
· solução de AgNO3 a 5%
D - INTERPRETAÇÃO
O leite é um dos alimentos mais completos que o homem conhece. Sua composição: 87% água; 4,9% carboidratos; 3,9% lípides; 3,5% proteínas; 0,7% sais minerais; além de vitaminas e certas enzimas. Seu pH é 6,6. Devido ao seu alto teor em água é um alimento diluído, mas seu valor nutritivo é elevado.
01. Com o procedimento de extração obteremos o seguinte:
a) precipitação isoelétrica de proteína (caseína) pela adição de ácido ao leite, obtendo-se inicialmente um precipitado que contém água, proteínas, lípides e um soro, que contém água, substâncias orgânicas e inorgânicas, nela solúveis.
b) a lavagem por duas vezes com álcool absoluto tem a finalidade de retirar a água que permaneceu junto à proteína coagulada.
c) com a segunda filtração (soro) procuramos separar lactose, cloretos, fosfatos, etc das proteínas coaguladas e outros sais que se precipitavam com o aquecimento.
02. O reagente de Benedict dá reação positiva para glúcides redutores. Aplicando-se o teste no soro do leite ele deve dar reação positiva devido a presença de alguns carboidratos, dos quais o dissacáride lactose é o mais abundante.
03. O aparecimento da cor amarelo-esverdeada na reação do soro com o molibdato de amônio é devido a formação de fosfomolibdato, indicando que o fósforo é um dos constituintes minerais do leite.
04. O reagente de Sulkowitch contém oxalato de amônio que em presença de cálcio irá formar oxalato de cálcio, insolúvel e branco. Se o teor de cálcio é baixo nota-se apenas ligeira turvação. A reação positiva para o soro indica pois que o cálcio é outro constituinte mineral do leite. Juntamente com o fósforo tem grande importância na calcificação dos recém-nascidos. Além disso, o cálcio participa da coagulação do leite.
05. O aparecimento de turvação ou precipitação branca resulta da formação de AgCl, ao reagir-se o soro com AgNO3. Evidência-se assim a presença de cloretos no leite.
E - PROCEDIMENTO I - EXTRAÇÕES
01. Adicionar 50 ml de água destilada morna e 50 ml de leite em um bequer de 250 ml.
02. Acrescentar CH3COOH 5% gota a gota, com agitação lenta até que o leite se coagule (queijo).
03. Deixar em repouso por cerca de 5 minutos.
04. Decantar o líquido sobrenadante sobre o filtro de algodão, recolhendo o filtrado no erlenmeyer de 125 ml. Lavar o precipitado 2 vezes com 5 ml de álcool absoluto.
05. Transferir o filtrado acima para o béquer de 250 ml.
Aquecê-lo diretamente na chama, até a ebulição. Deixar fervendo até reduzir o volume a 40 ml. Agitar constantemente com bastão de vidro para evitar formação de bolhas (cuidado com o rosto).
06. Filtrar em papel de filtro e deixar esfriar. (Filtrado 2)
II - PESQUISA DE GLÍCIDES REDUTORES
01. Colocar 2 ml do reagente de Benedict em um tubo de ensaio.
02. Adicionar 1 ml do filtrado 2. Misturar.
03. Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente.
04. Ler a interpretação.
III - PESQUISA DE FÓSFORO
01. Colocar 2 ml do filtrado respectivamente em 2 tubos de ensaio.
02. Adicionar 1 ml de solução de molibdato de amônio a 5% a um dos tubos. Misturar.
03. Observar o aparecimento de cor amarelo-esverdeada, comparando com o tubo controle.
04. Ler a interpretação correspondente.
IV - PESQUISA DE CÁLCIO
01. Colocar 2 ml do filtrado em um tubo de ensaio.
02. Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até o aparecimento de uma turvação ou precipitado branco.
03. Ler a interpretação correspondente.
V - PESQUISA DE CLORETOS
01. Colocar 2 ml de filtrado em um tubo de ensaio.
02. Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado.
03. Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado branco.
VI - TESTES PARA VERIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ESTRANHAS AO LEITE.
Nos 3 testes abaixo, fazer com as 2 amostras de leite.
01. Pesquisa de amido Colocar em um béquer, 5 ml de leite. Aquecer. Em seguida, adicionar 6 gotas de reativo de lugol.
02. Pesquisa de urina. Pipetar 5 ml de leite e colocar em um béquer. Juntar em seguida 5 ml de HCl, 5 ml de álcool Etílico e 0,5 ml de HNO4
03. Pesquisa de sacarose. Colocar 5 ml de leite em um béquer e 1 ml de reativo de Seliwanoff. Aquecer em banho maria durante 10 minutos. Agitar de vez em quando.
F - RELATÓRIO
01. Como a caseína do leite pode ser separada?
02. Explicar qual o mecanismo de coagulação espontânea do leite que não sofreu fervura ou pasteurização.
03.O pI da caseína é maior ou menor que 7,0? Explique.
04. Por que os lípides são extraídos do leite pelo tratamento com éter?
05. Citar as reações ou testes utilizados neste trabalho prático, bem como os seus objetivos:
06. Por que se reduz o volume de soro até 40 ml?
07. Citar as reações ou testes utilizados neste trabalho prático, bem como os seus objetivos.
08. Por que se reduz o volume do soro até 40 ml?
08. Qual leite (x ou y) é de melhor qualidade? Explique.
AULA PRÁTICA No 10 CONSTITUINTES DO OVO
A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desta aula prática o estudante deverá saber:
01. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína e lípides da gema.02. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína da clara.
03. Determinar aproximadamente o pI de proteína.
04. Identificar a presença de proteína em líquido biológico usando sua propriedade de precipitação por agentes químicos e físicos.
05. Determinar experimentalmente o valor calórico aproximado do ovo. Explicar o significado das reações e operações realizadas.
B - MATERIAL NECESSÁRIO
· 2 bequeres de 100 ml
· 1 cilindro graduado de 50 ml
· 1 cilindro graduado de 100 ml
· balança
· algodão
· 1 funil
· 2 papéis de filtro
· lâmpada infra-vermelho
· chapa de aquecimento para banho de areia
· estufa
· tubos de ensaio e suporte
· 1 bastão de vidro
· bico de gás
· 1 pipeta graduada de 2 ml ao centésimo
· 1 pipeta graduada de 10 ml ao décimo
C - REAGENTES
· 1 ovo (por bancada)
· álccool a 95%
· Eter destilado
· Sulfato de sódio
· Sulfato de sódio anidro
· Clorofórmio
· Solução saturada (22%) de triclorato de antimôniol em clorofórmio
· Acetato de sódio a 0,1 N
· Ácido acético a 0,1 N
· Ácido nítrico concentrado
· Cloreto de mercúrio a 1%
· Solução saturada (13%) de ácido pícrico
D - INTERPRETAÇÃO
A gema do ovo contém como constituintes principais proteínas e lípides que podem ser isolados. Nas pesquisas I e II as proteínas são precipitadas e extraídas pela adição de álcool, ao passo que os lípides serão solubilizados e extraídos pelo éter. Após a filtração de mistura, o precipitado representará a fração protéica da gema e o filtrado representará a fração lipídica. O sulfato de sódio
anidro é adicionado ao filtrado com o objetivo de se remover a água do solvente. Tendo-se o peso da gema, o cálculo de porcentagem de proteínas e de lípides na gema do ovo será feito por simples regra de três.
A clara do ovo também é constituida de proteínas e lípides. Entretanto aqui a fração mais importante é a protéica, formada principalmente de albumina. Na pesquisa III as proteínas são precipitadas por adição de álcool. Conhecendo-se o volume total de clara do ovo, pode-se facilmente calcular o teor de proteínas na clara de ovo. A fração lipídica e carboidratados são tão pequenos que podem ser desprezados para cálculo do valor calorífico do ovo.
As substâncias orgânicas quando oxidadas no organismo libertam uma certa quantidade de calor que irá variar segundo o tipo de substância. Assim, as proteínas liberam uma média de 4 Kcal por grama de substância; os lípides liberam 9 Kcal por grama e os carboidratos 4 Kcal por grama. Portanto, na pesquisa VI conhecendo-se os valores percentuais de proteínas e lípidos na gema e na clara do ovo pode-se calcular o valor calórico total de um ovo.
Uma das técnicas de isolamento de proteínas é a sua precipitação no ponto isoelétrico, onde as mesmas são menos solúveis mas sem perder a atividade. O objetivo da pesquisa V é determinar o ponto isoelétrico de albumina do ovo. Para isto preparou-se soluções da albumina em diferentes pHs e observou-se aquela em que ocorreu a precipitação da proteína. Entretanto certas proteínas, entre elas a albumina, apresentam grande solubilidade em água e por isso torna-se difícil observar a sua precipitação no ponto isoelétrico. Adiciona-se então à solução um agente que compete com a proteína pelo solvente, num processo semelhante ao "salting out". No presente caso empregou-se o álcool. Entretanto é bom levar em consideração que o álcool quando permanece muito tempo em contato com a proteína introduz modificações intramoleculares na mesma, acarretando uma desnaturação.
A pesquisa VI permite observar a ação do calor e de alguns agentes precipitantes sobre a albumina do ovo e para extensão, sobre as proteínas. São os processos conhecidos por coagulação a desnaturação.
a) O calor promove a coagulação da albumina num processo de desnaturação irreversível.
b) A adição de ácidos fortes a uma solução de proteína promove a sua desnaturação com a consequente precipitação. O presente teste (Reação de Heller) é comumente empregado nos laboratórios clínicos quando se deseja verificar a presença de albumina do soro na urina em casos de suspeita de albumina (doença renal).
c) A adição de solução de sais de metais pesados a uma solução da proteína promove a formação de proteinatos insolúveis. Em casos de envenenamentos por sais de chumbo e mercúrio costuma-se administrar clara de ovo aos pacientes, pois a reação é imediata e sua eliminação é facilitada.
d) Os reagentes de alcalóides (ácido pícrico, fosfotungstico, tânico, metafosfórico, etc) precipitam os alcalóides de suas soluções por formarem com os mesmos sais insolúveis. Estes reagentes agem da mesma forma quando adicionados a uma solução de proteína formando igualmente sais insolúveis.
E - PROCEDIMENTO
01. Pesar 2 bequeres de 100 ml.
02. Separar bem a gema da clara e colocar cada uma das partes nos respectivos bequeres.
03. Pesar os bequeres e anotar o peso da gema e da clara.
04. Transferir a clara para o cilindro graduado de 100 ml e anotar o seu volume.
I - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA GEMA
Nota: Durante todas estas operações não deve haver nenhum bico de gás ligado no laboratório.
01. Adicionar à gema isolada 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos.
02. Adicionar 30 ml de éter. Agitar por 5 minutos.
03. Filtrar através de algodão para um erlenmeyer de 125 ml.
04. Lavar o precipitado no funil com 3 porções de 10 ml de éter. Adicionar somente uma porção de éter depois da precedente ter sido completamente drenada no erlenmeyer que está recebendo o filtrado. Guardar o filtrado.
05. Pesar um papel de filtro grande.
06. Transferir o precipitado extraído para o papel de filtro, desprezando o pedaço de algodão.
07. Secar o papel com o precipitado usando lâmpada infra-vermelho como fonte de calor. Não usar estufa.
08. Pesar o papel de filtro mais o precipitado seco.
09. Calcular a porcentagem de proteína na gema.
10. Ler a interpretação correspondente.
II - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LÍPIDES NA GEMA
01. Pesar um bequer seco de 100 ml.
02. Adicionar 3 g de sulfato de sódio anidro ao filtrado obtido em I, item 4. Agitar por 5 minutos.
03. Filtrar em papel de filtro recolhendo o filtrado no béquer pesado.
04. Evaporar o solvente em manta aquecedora.
05. Pesar o béquer com o resíduo. Conservar o resíduo.
06. Calcular a percentagem de lípides na gema.
07. Ler a interpretação correspondente.
III - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA CLARA
01. Transferir 10 ml da clara do ovo (medir com pipeta) para um béquer de 50 ml.
02. Adicionar 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos.
03. Pesar um papel de filtro.
04. Filtrar pelo papel anteriormente pesado. Desprezar o filtrado.
05. Abrir o papel de filtro e levá-lo à estufa para secar completamente.
06. Pesar o papel com o precipitado.
07. Calcular a porcentagem de proteínas na clara.
08. Ler a interpretação correspondente.
IV - DETERMINAÇÃO DO VALOR CALÓRICO DO OVO
De posse dos dados obtidos nas pesquisas anteriores, calcular o valor calórico do ovo analisado. Ler a interpretação correspondente.
V - DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA ALBUMINA DO OVO
Nota: Preparar para esta pesquisa e as subsequentes uma solução de albumina de ovo a 1%, diluindo 1 ml da clara com 100 ml de água.
01. Tomar 5 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 5.
02. Adicionar aos mesmos as soluções abaixo relacionadas, segundo o esquema:
	Tubo
	Acet. Sódio 0,1
N (ml)
	Ác. Acético 0,1
N (ml)
	Ác. Acético 1,0
N (ml)
	H2O dest. (ml)
	Albumina	1%
(ml)
	1
	2,00
	0,25
	-
	3,75
	2,00
	2
	2,00
	0,50
	-
	3,50
	2,00
	3
	2,00
	2,00
	-
	2,00
	2,00
	4
	2,00
	-
	0,80
	3,20
	2,00
	5
	2,00
	-
	3,20
	0,80
	2,00
03. Agitar bem os 5 tubos.
04. Adicionar ao tubo 3, cuidadosamente, e com agitação, empregando a pipeta graduada de 10 ml, álcool a 95% até se produzir pequena turvação. Anotar a quantidade gasta.
05. Adicionar a mesma quantidade de álcool a cada um dos outros tubos.
06. Deixar em repouso por 10 minutos e anotar depois em qual dos tubos ocorreu maior formação de precipitado.
07. Ler a interpretação correspondente.
VI - PRECIPITAÇÃO