slides Fracionamento celular

Prévia do material em texto

FRACIONAMENTO CELULAR
FRACIONAMENTO CELULAR
Lise celular
Aparelhos para lise celular
Fracionamento celular
1. Rompimento das células em uma solução tampão 
que preserve as estruturas intracelulares 
(HOMOGEINIZAÇÃO por choque osmótico, 
ultrasom, processo físico);
2. Separação dos componentes celulares por 
tamanho e densidade na centrifugação;
A separação de estruturas maiores como o núcleo 
ou mitocêndrias é feita em centrífugas denominadas 
de preparativas, com velocidades até 20.000 r.p.m. 
Centrifugação 
- 1924 Theodor Svedberg inventou a ultracentrífuga analítica
Prêmio Nobel em Química (1926)
Centrifugação 
- 1938 G. Beherens isolou pela primeira vez, núcleo de 
uma célula por centrifugação;
- 1954 C. de duve isolou lisossomos (primeira organela 
não identificada pela microscopia)
Centrifugação 
Centrifugação diferencial
Centrifugação 
A separação de 
estruturas pequenas 
como o ribossomo é 
feita em centrífugas 
denominadas de 
ultracentrífugas, com 
velocidades acima de 
20.000 r.p.m., 
podendo chegar a 
100.000 r.p.m. 
3.000 a 
5.000 r.p.m.
Até 
20.000 
r.p.m.
Acima de 
50.000 
r.p.m.
Ultracentrifugação
Centrifugação 
Centrifugação 
ZONAL ou por 
velocidade de 
sedimentação e 
ISOPÍCNICA ou 
sedimentação por 
equilíbrio
Tamanho é mais importante Densidade é 
mais importante
Centrifugação por gradientes
Centrifugação
Densidades de estruturas celulares em sacarose
Estrutura Densidade (g/cm3)
Golgi 1.06-1.10
Membrana Plasmática 1.16
REL 1.16
Mitocôndria 1.19
Lisossomos 1.21
Peroxissomos 1.23
Vírus de Planta 1.30-1.45
Rhino- and enterovirus 1.30-1.45
Ácidos nucleicos, ribossomos 1.60-1.75
Glicogênio 1.70
Centrifugação 
Tipos de rotores
Coeficiente de sedimentação 
(s)
Definido pela relação entre a velocidade com que 
uma partícula sedimenta em uma dada solução e a 
aceleração centrífuga aplicada. 
S = v/a = m {1-(d/d’)}/f
onde:
m = massa da partícula;
d = densidade da partícula;
d’ = densidade do solvente;
f = coeficiente de fricção (depende da forma da 
partícula e viscosidade da solução)
Isolamento de DNA extracromossomal de 
bactérias (plasmídios)
Centrifugação por densidade flutuante (buoyant density).
Centrifuga-se uma solução aquosa contendo DNA e outras moléculas
Orgânicas em uma solução de um sal com alta densidade (por ex.cloreto
de césio), até a formação de um gradiente de densidade. Para que isso
ocorra, velocidades de 200.000 a 500,000 x g são usadas
Ver link: https://pt.scribd.com/doc/102633265/Buoyant-Density-of-DNA
RNA
DNA circularDNA linear
Proteina e
Lipídeos 
=1.2g/ml 1.6 1.7 1.8 g/ml
Centrifugação
Purificação de DNA plasmidial de bactérias por centrifugação isopícnica.
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/cellfractionation.html
Cromatografia
Um dos métodos mais utilizados para separação de 
proteínas é a cromatografia;
Primeiramente desenvolvida para separação de moléculas 
pequenas como a aminoácidos e açúcares;
Amostra (soluto) interage fiscamente com duas fases-
Uma móvel (gás ou líquido) e um suporte sólido (fase 
estacionária; solvente ou Matriz). 
A fase móvel movimenta o soluto através da fase 
estacionária. A atração diferencial do soluto pelas fases 
móvel e estacionária afetará a sua mobilidade. 
• Tipos de cromatografia:
• a = Partição (papel ou de camada fina);
• b = Coluna (troca iônica, hidrofóbica, 
filtração em gel, afinidade) material da 
coluna pode ser celulose ou silica;
• c = HPLC (high performance liquid 
chromatography)
Cromatografia
Cromatografia
Aplicações:
Separação de misturas complexas de biomoléculas 
em componentes individuais para propósitos 
analíticos ou quantitativos. 
Isolamento em uma forma pura de uma 
biomolécula simples a partir de uma mistura 
complexa 
Cromatografia de papel
• Envolve a separação de um soluto entre um solvente ligado 
firmemente a uma fase estacionária polar e um segundo 
solvente (fase móvel) que se move através da fase 
estacionária
Exemplo:
• Fase estacionária = Água ligada a celulose
• Fase móvel (apolar ou menos polar) = mistura de 
solventes 
• e.g. butanol, chlorofórmio 
• Útil na separação de moléculas similares e.g. amino acids
Exemplo
Camada fina
• Envolve partição (menor contribuição) e adsorção 
na fase estacionária. 
• - fase estacionária : acídica (silica) or básica 
(alumina) 
• - soluto adsorve por ligação de hidrogênio; a força 
da ligação depende da polaridade do soluto 
• - a separação do soluto da fase estacionária requer 
um solvente mais polar do que o soluto
Cromatografia de camada fina
Cromatografia
Papel ou camada fina Coluna
Cromatografia de coluna
Cromatografia 3
Tipos de cromatografia de coluna
Tipos de coluna
Cromatografia 4
3 passos cromatográficos
consecutivos usados para
purificar uma proteína. Em A,
resultados de uma coluna de
troca iônica; B, Filtração em gel
e C, Cromatografia de afinidade.
Colunas de HPLC