Manual de Práticas Bacteriológicas

Prévia do material em texto

Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Faculdades Integradas de Patos 
Curso de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de práticas bacteriológicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Patos, 2014 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Esta apostila foi elaborada com a finalidade de auxiliar no aprendizado e fixação do conteúdo da 
disciplina de Bacteriologia Clínica. Entretanto, é de caráter introdutório, não isentando o aluno 
de estudar por livros e/ou artigos científicos. 
 
 
Breve histórico da Bacteriologia 
 
 Apesar de Robert Hooke (1665) ser reconhecido como o primeiro a visualizar micro-
organismos em um microscópio, pode-se dizer que a Bacteriologia clínica teve início em 1676 
quando Anton Van Leeuwenhoek utilizando um de seus primeiros microscópios observou a 
presença de bactérias na água, em material coletado de sua própria cavidade oral e de pessoas 
enfermas. As suas observações foram publicadas com desenhos esmerados, entre 1673 e 1723, 
no importante meio científico da época (Philosophical Transactions da Royal Society of 
London), o que levou outros cientistas a começarem a desenvolver estudos mais rigorosos 
acerca dos micro-organismos. Em 1683, este periódico publicou um desenho de Leeuwenhoek 
com a primeira representação de uma bactéria. Leeuwenhoek surpreendeu o mundo científico 
declarando que os micro-organismos que observava eram vivos por apresentarem movimento 
ativo e intenso. Quase 200 anos mais tarde, Pasteur (1822-1895) e o médico alemão Robert 
Koch (1834-1910) desenvolveram estudos que conduziram ao estabelecimento das bases da 
Microbiologia como ciência experimental estruturada e especializada. O período de 1880-1900 
representa a época áurea da bacteriologia. Em Congresso realizado em Londres (1881), Pasteur 
teve a oportunidade de tomar conhecimento da introdução por Robert Koch dos meios sólidos 
(gelatina, ágar, etc) na bacteriologia. Até o momento, Pasteur só utilizava meios líquidos, o que 
praticamente impossibilitava de realizar o isolamento bacteriano, agravado ainda pelo 
desconhecimento das técnicas de fixação e coloração também desenvolvidas por Koch. A 
contribuição dos cientistas citados e de muitos outros que igualmente merecem nosso crédito, 
pois serviram de base para o entendimento (ainda que parcial, pois há muito o que descobrir) 
do papel das bactérias no desenvolvimento de infecções humanas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Apresentação 
 
 
 O objetivo da bacteriologia clínica é determinar o agente etiológico de uma infecção e 
seu perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, através de uma avaliação diagnóstica do 
material clínico. Para isso, é necessário isolar o agente em questão, identificá-lo e avaliar sua 
importância no sítio infeccioso. O principal dilema do bacteriologista é decidir se o micro-
organismo isolado está envolvido na doença, se é um colonizante, se faz parte da 
microbiota normal ou se é um contaminante. 
 Bactérias são ubiquitárias no corpo humano. Microbiota normal pode ser definida 
como a presença de micro-organismos que não causam dano ou resposta inflamatória, 
podendo ter inclusive papel protetor contra agentes patogênicos. Pode ser dividida ainda 
em Microbiota transitória (responsável pelos casos de infecção hospitalar) e microbiota 
residente (a que nos acompanha ao longo da vida, muito embora sofra alteração em 
números devido a diversos fatores). Alguns destes micro-organismos da microbiota residente 
podem causar doença quando ocorre alguma alteração ou disfunção no tecido local ou quando 
alcançam outros sítios através de procedimentos invasivos que os carregam de um local para o 
outro. Embora a composição da microbiota seja dinâmica, alguns micro-organismos são mais 
frequentes em sítios específicos, existindo também sítios estéreis como o sangue, os olhos e o 
sistema nervoso. A microbiota normal é dinâmica e influenciada pela idade, dieta, hormônios, 
condições de saúde, sanitária e higiene pessoal. 
 No trato respiratório, as vias aéreas que normalmente abrigam micro-organismos, são as 
cavidades da orofaringe e da nasofaringe. As vias estéreis são a laringe, traqueia, brônquios, 
alvéolos e seios nasais. A variedade de bactérias encontradas na orofaringe é muito grande e 
varia de acordo com o ambiente onde a pessoa vive. Pessoas hospitalizadas ou que trabalham 
no ambiente hospitalar, por exemplo, são mais colonizadas por Gram negativos, enquanto as 
demais abrigam principalmente cocos Gram positivos. 
 No trato gastrointestinal, as bactérias são introduzidas pela alimentação. O estômago se 
mantém estéril devido ao seu pH ácido. O intestino delgado, fígado, vesícula biliar e o peritônio 
são livres de micro-organismos ou abrigam populações transitórias, que apenas passam por 
esses locais, mas não permanecem por muito tempo. O intestino grosso é colonizado por um 
grande número de micro-organismos. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 No trato urogenital, a genitália externa e a uretra anterior são colonizadas por bactérias 
da microbiota cutânea, enquanto o canal vaginal abriga bactérias importantes na defesa local, 
servindo de proteção contra agentes patogênicos. Os demais órgãos e tecidos são estéreis. 
 A pele é constantemente habitada por micro-organismos que refletem a profissão, os 
hábitos e o ambiente em que o indivíduo vive. Entre as bactérias mais frequentes encontramos 
as do gênero Staphylococcus. 
 Os agentes patogênicos podem ser: oportunistas, estritos ou facultativos. Os 
oportunistas só causam infecções em condições favoráveis, por exemplo, imunossupressão. Os 
patógenos estritos são aqueles que, quando identificados, sempre estarão associados a um 
processo infeccioso e os facultativos são aqueles que causam infecção quando conseguem se 
estabelecer em um sítio, em grandes quantidades. 
 Nesta apostila, serão abordados os aspectos práticos do diagnóstico diferencial de 
bactérias patogênicas nos diferentes materiais clínicos, de modo a orientar os alunos na 
interpretação dos resultados obtidos no laboratório de bacteriologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Materiais e técnicas básicas em bacteriologia 
 
 Incluem materiais e equipamentos necessários não só ao isolamento, cultivo e 
identificação de bactérias, mas também aqueles essenciais aos processos de esterilização, 
transferência e preservação de micro-organismos em geral. A manipulação da amostra clínica 
requer técnicas adequadas de inoculação (também chamadas de “técnicas ou manobras 
assépticas”) dos micro-organismos em meio de cultura que possibilitem a obtenção de cultura 
pura. Estas técnicas incluem: 
 
 Trabalhar em áreas submetidas previamente a limpeza e desinfecção para reduzir o 
número de potenciais micro-organismos contaminantes (1); 
 Trabalhar dentro da “zona de esterilidade” do bico de Bunsen (2), ou seja, os recipientes 
(tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura de vem ser abertos próximos 
ao bico; 
 Manipulação de amostras clínicas por trás da chama do bico de Bunsen; 
 Flambagem das alças (3) ou agulhas de platinas, níquel-cromo ou tungstênio antes e 
após cada inoculação. A flambagem deve ser realizada em todo seu comprimento, a 
partir de alguns centímetros do cabo de Koller, até ao rubro, mantendo-as em posição 
vertical à chama do Bico de Bunsen. Deixar esfriar nas proximidades da chama do bicode bunsen; 
 Flambar rapidamente alças de Drigalsky ou boca dos tubos de ensaio antes e após cada 
procedimento (4) (os quais devem estar inclinados à chama- formando 
aproximadamente um ângulo de 30°C - e nunca na posição vertical) após abri-los ou 
antes de fechá-los. A tampa dos tubos nunca deve ser colocada na bancada ou mesa de 
trabalho, devendo ser retirada e mantida segura pelo dedo mínimo durante a inoculação. 
 Antes de iniciar o trabalho, verificar se todos os materiais necessários estão na bancada, 
identificá-los adequadamente e organizá-los em posição de fácil acesso para evitar 
riscos de acidentes ou trocas; 
 Desembrulhar a pipeta esterilizada dentro da “zona de esterilidade” e mantê-la nesta 
zona durante o trabalho. Após o uso, as pipetas ou ponteiras devem ser descartadas em 
recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes (por exemplo: água e 
hipoclorito de sódio); 
 Manter os tubos e alças em suportes e estantes apropriadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Principais materiais e equipamentos utilizados no laboratório de bacteriologia: 
 
Para o cultivo de micro-organismos: 
 
- Meios de cultura 
- Vidrarias 
- Câmaras de cultivo 
- Câmaras de inoculação 
 
 
 
 
 
 Meios de cultura 
 
 Líquidos Sólidos 
 
 
 Ágar em placa Agar inclinado 
 
 
 Semi-sólidos 
 
 
 
 Ágar em coluna (meio reto) 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Vidrarias 
 
 
 
 
Tubos de ensaio (tampa de rosca) Tubos de ensaio (tampa de algodão) Béqueres 
 
 
 
 Placas de Petri Pipetas volumétricas Provetas 
 
 
 
 Bastão de vidro Erlenmeyers 
 
 
Câmaras de cultivo 
 
 A= Banho –maria B= Incubadora ou estufa bacteriológica C= Agitador rotatório 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Câmaras de inoculação 
 
 
 Câmara de fluxo laminar 
 
Para esterilização: 
 
- Autoclaves 
- Filtros esterilizantes 
- Estuda de esterilização 
 
 
 Autoclave Filtros esterilizantes Filtros esterilizantes 
 
 
 
 Estufa de esterilização 
 
Para transferência de micro-organismos: 
 
- Alças de inoculação 
- Pipetas 
- Swabs 
 
Alças de inoculação 
 
Alças de platina/Níquel-cromo/tungstênio Alças de plástico (descartáveis) Alça de Drigalsky 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Pipetas e Swabs 
 
 Pipeta volumétrica Pipeta automática Pipeta de Pasteur 
 
 Pipeta automática (multicanal) Swabs 
 
 
Para preservação de micro-organismos: 
 
- Refrigeradores 
-Freezers 
- Liofilizador 
 
 
 Liofilizador 
 
Outros materiais: 
 
Lâminas e lamínulas Algodão hidrófobo Bico de Bunsen 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
 
 Pinças e espátulas Balança de pesagem 
 
 
LEMBRETE! 
 
 O sucesso na manutenção da pureza dos micro-organismos cultivados só ocorrerá se 
técnicas assépticas forem seguidas. Isto inclui o preparo de meio de cultura estéril, a 
esterilização de todo material que entrará em contato com o meio de cultura, e a manipulação 
de culturas utilizando manobras assépticas. Na Figura abaixo, é possível observar uma 
seqüência de manobras assépticas realizadas na transferência de uma cultura microbiana 
contida em tubo de Agar inclinado para outro tubo. 
 
 
 1 2 3 
 
 4 5 
Fonte: Vermelho, A.B. et al. (2006) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Cultura in vitro: Princípios e Aplicações 
 
 A maioria das bactérias pode ser cultivada em laboratório utilizando-se meios 
nutrientes. Podemos definir meio de cultura como um conjunto de substâncias, formuladas de 
maneira adequada, capazes de promover o crescimento bacteriano, em condições de 
laboratório. Além da composição química, deverão ser considerados aspectos físicos relativos à 
temperatura, aeração e tempo, os quais interferem diretamente no crescimento bacteriano. 
 
Tipos de meio de cultura 
Os meios de cultura podem ser divididos em sete categorias gerais: 
 Meios enriquecidos 
 Meios não seletivos de enriquecimento; 
 Meios seletivos; 
 Meios diferenciais; 
 Meios indicadores ou bioquímicos; 
 Meios especializados; 
 Meios de transporte 
 
Alguns exemplos estão resumidos na tabela abaixo: 
 
Tabela: Tipos de meio de cultura 
 
Tipo Exemplos de meios Finalidade 
De enriquecimento Brain Heart Infusion 
(BHI) 
Ativação metabólica e aumento do número de bactérias na amostra 
clínica 
 
 
Enriquecidos 
Ágar sangue Isolamento de bactérias e fungos 
 
Ágar chocolate 
Isolamento de bactérias incluindo Haemophilus e Neisseria 
gonorrhoeae 
 
 
 
 
Seletivos e 
diferenciais 
Ágar MacConckey Meio seletivo para bactérias Gram negativas; diferencial para espécies 
fermentadoras de lactose 
Ágar manitol salgado Meio seletivo para estafilococos; diferencial para S. aureus 
Meio Lowenstein-
Jensen 
Meio seletivo para micobactérias 
Ágar EMB Meio seletivo para bactérias Gram negativas; diferencial para espécies 
fermentadoras de lactose 
Meios indicadores 
 
 TSI 
Indica a utilização ou degradação enzimática de carboidratos (Glicose, 
sacarose, lactose) presentes no meio pelas bactérias com formação de 
compostos que alteram o pH do meio e permitem a viragem o indicador 
de pH.. Útil como meio de triagem para identificação de Gram 
negativas. De acordo com a fermentação de carboidratos, o TSI pode 
ser: Ac/Ac; Al/Ac; Al/Al (ausência de fermentação). 
Citrato de Simmons É um meio para prova bioquímica, sintético, utilizado para 
identificação de Gram negativo baseando-se na capacidade da bactéria 
de utilizar o citrato como única fonte de carbono. 
Meios especializados Ágar Cistina Telurito Isolamento de Corynebacterium diphtheriae 
Ágar tiossulfato-
Citrato- sais biliares-sucrose (TCBS) 
Isolamento de espécies de Vibrio 
Ágar Regan Lowe Isolamento de Bordetella pertussis 
Meios de transporte Stuart Prevenir desidratação e autodestruição enzimática dos patógenos 
 
Meios de enriquecimento: São meios geralmente líquidos de composição química rica em 
nutrientes e foram desenvolvidos para permitir a ativação metabólica das bactérias contidas em 
uma amostra clínica, além de proporcionar o seu aumento em número, possibilitando seu 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
isolamento. Um meio de enriquecimento pode também possuir propriedades seletivas, 
conferidas por substâncias que inibam o desenvolvimento de espécies sem importância clínica e 
favoreçam o crescimento de patógenos. Exemplo: Caldo Brain Heart Infusion (BHI); Caldo 
tetrationato (seletivo). 
Meios enriquecidos: Podem ser sólidos (maioria) ou líquidos. Foram desenvolvidos para 
permitir o crescimento e isolamento da maioria dos organismos que não possuam exigências 
nutricionais muito complexas (fastidiosas) de crescimento. Exemplo: ágar sangue; ágar 
chocolate; Caldo tioglicolato. 
 
Meios seletivos e diferenciais: destinam-se à recuperação de baterias específicas que podem 
estar numa mistura com outros micro-organismos (p. ex., patógenos entéricos nas fezes). Para 
isto, são adicionados a estes meios substâncias com capacidade inibitória para algumas 
bactérias como corantes, antibióticos, sais biliares, entre outras. Estes meios podem tornar-se 
diferenciais pela adição de ingredientes específicos que permitam a distinção entre vários 
gêneros e espécies de bactérias em uma mistura, geralmente evidenciada pela mudança de 
coloração ou na morfologia das colônias [p.ex., adição de lactose e de um indicador de pH para 
diferenciar as bactérias que são fermentadoras de lactose (rosas) das que não o são (incolores)]. 
Exemplos de meios seletivos e diferenciais: ágar MacConckey, ágar manitol salgado, ágar 
eosina azul de metileno (EMB), Meio Lowenstein-Jensen (LJ), ágar SS, ágar HE, etc. 
 
Meios indicadores ou bioquímicos: São utilizados no estudo das propriedades bioquímicas 
das bactérias, auxiliando assim sua identificação. O tipo mais simples de meio indicador é 
aquele utilizado no estudo das reações de fermentação ou utilização de certos compostos. 
Incorporam-se ao meio básico carboidrato e uma substância indicadora. A partir da mudança de 
coloração, detecta-se a positividade da reação pela produção de compostos finais de pH 
definido. Exemplos: ágar Triple Sugar Iron (TSI) e ágar Citrato de Simmons. 
 
Meios especializados: Permitem a detecção de bactérias específicas que podem ser fastidiosas. 
Alguns meios estão descritos na tabela acima. 
 
Meios de transporte: Consistem em meio isento de nutrientes, contendo um agente redutor 
(Tioglicolato ou cisteína) e uma substância com poder de tamponamento (fosfatos). Estes 
meios geralmente mantém um pH favorável, previne a desidratação de secreções durante o 
transporte e evita a oxidação ou a auto-destruição enzimática dos patógenos presentes. 
Exemplos: Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair, entre outros. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Técnicas de semeadura 
 
O isolamento bacteriano a partir de uma cultura mista será garantido levando-se em 
consideração as seguintes observações: 
 
 Realizar o maior número de estrias possíveis; 
 Não perfurar ou rasgar o meio Agar; 
 Não voltar com a alça sobre as estrias, sobrepondo-as; 
 Iniciar a semeadura com uma pequena quantidade de material na alça de inoculação. 
 
A semeadura pode ser realizada em tubo ou em placas. Como exemplos de semeadura em 
placas podemos citar: 
 Semeio por desgaste ou por esgotamento: O princípio básico da técnica é tentar 
esgotar o material ao longo das estrias de modo a depositar células isoladas no meio sólido que 
darão origem a colônias isoladas. As colônias puras serão semeadas em meios específicos para 
posterior identificação da espécie clínica. 
 
 Semeio em grade ou em rede: assim como o semeio por desgaste, visa obter colônias 
de bactérias isoladas. 
 
Em tubos, os semeios podem ser do tipo: 
 Semeio em picada; 
 Semeio em zigue-zague; 
 Semeio em meio líquido. 
 
 
 
 
 Semeio por esgotamento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Prática: Técnicas de semeadura 
 
Roteiro: 
 
- Noções sobre utilização de materiais e equipamentos em laboratório de microbiologia 
- Técnicas de semeadura de bactérias em placas de Petri e em tubos de ensaio: semeio por 
esgotamento ou em grade 
 
 
 
 
Em rede para obtenção de UFC´s Por esgotamento Por esgotamento 
 
 Em tubos: 
 
Alça em agulha (semeio em picada e em zigue-zague) Semeio em picada 
Colorações diferenciais em bacteriologia 
 
Alça em 0 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 Coloração de Gram 
 
 A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holandês Hans 
Christian Gram. Esta coloração permite dividir as bactérias em dois grandes grupos: Gram 
negativas e Gram positivas, dependendo da estrutura e composição da parede celular e, 
conseqüentemente, da sua capacidade de reter o complexo cristal violeta-iodo quando expostas 
a solventes orgânicos como acetona ou álcool. 
 A técnica: 
 Preparar o esfregaço bacteriano transferindo uma gota de água destilada esterilizada 
para o centro de uma lâmina e em seguida, tocar a alça de platina na cultura bacteriana e 
realizar movimentos circulares no centro da lâmina de vidro; 
 Fixar o esfregaço passando rapidamente a lâmina pela chama do bico de Bunsen até 
secar; 
 Corar o esfregaço fixado com solução de cristal violeta (Coloração primária) durante 1 
minuto. Neste estágio, as células adquirem a tonalidade azul-escura ou púrpura; 
 Em seguida, cobrir o esfregaço com lugol (mordente) durante um minuto. O cristal 
violeta é fixado à célula pelo mordente que produz o complexo violeta-iodo que é fortemente 
retido pelas bactérias; 
 A etapa seguinte é a descoloração pela solução de álcool etílico a 95%. Cobrir o 
esfregaço corado com a solução por gotejamento até que não haja mais desprendimento do 
corante. A função do álcool é desidratar os carboidratos existentes na parede celular das 
bactérias Gram positivas, e desse modo, promover a retenção do corante cristal violeta. Com 
relação aos organismos Gram negativos, o álcool promove a dissolução dos lipídeos, 
aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede celular, evitando que o complexo cristal 
violeta-lugol seja retido. 
 Após a descoloração, adicionar ao esfregaço a solução de fucsina ou safranina (corante 
secundário). As bactérias Gram negativas que se deixam descorar pelo álcool, fixam a fucsina 
nesta etapa e aparecem vermelhas ao microscópio. As Gram positivas permanecem com a 
tonalidade azul escura original. 
 
 
Coloração de Gram (Vermelho et al. 2007) 
 
 
 Exceções de bactérias Gram positivas e Gram negativas: 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
Bactérias Gram-positivas: 
 
 Neste grupo, a parede celular é composta por peptidoglicano com ácidos teicóicos e 
lipoteicóicos e proteínas ligantes. O peptideoglicano também chamado de mucopeptídeo ou 
mureína é o principal componente da parede celular das Gram-positivas correspondendo de 40-
90% do seu peso seco. Os ácidos teicóicos estão ligados ao ácido murâmico do 
peptideoglicano e quando estão ligados a lipídeos (fosfolipídeos) da membrana plasmática sãochamados de ácidos lipoteicóicos. Estes podem atravessar a parede celular e ser detectado 
como antígenos na superfície da célula bacteriana. 
 Alguns Streptococcus também podem conter em sua parede polissacarídeos ligados ao 
peptidioglicano chamado carboidrato C. Com relação às proteínas, a proteína A de 
Staphylococcus aureus é uma das mais estudadas em bactérias Gram positivas. Ela interage 
com várias moléculas do hospedeiro, como por exemplo imunoglobulinas, durante a infecção, 
resultando na adesão ao tecido da célula do hospedeiro e escape do Sistema Imune. 
 Outra proteína que tem sido alvo de inúmeros estudos é a M6, encontrada na superfície 
dos estreptococos do Grupo A. Esta proteína é responsável pelas propriedades antifagocíticas 
do grupo A e por mais de 80 sorotipos. 
 
Bactérias Gram- negativas: 
 A estrutura da parede celular das Gram-negativas é mais complexa do que a das Gram-
positivas. Basicamente é constituída por uma membrana externa, o peptideoglicano, 
lipoproteínas e o espaço periplasmático ou periplasma. 
 A membrana externa (ME) possui permeabilidade seletiva e é uma bicamada lipídica 
que contém fosfolipídeos, proteínas (principalmente as OMP’s- proteínas de Membrana 
externa- que correspondem a cerca de 50% da massa da membrana externa e são essenciais 
para a manutenção e permeabilidade seletiva das membranas bacterianas), lipoproteínas e 
lipopolissacarídeos (LPS) (componente principal). É ela que separa o ambiente externo do 
espaço periplasmático. Uma de suas características é a distribuição assimétrica dos seus 
lipídeos. Seu lado externo contém exclusivamente lipopolissacarídeos, enquanto que no seu 
lado interno estão os fosfolipídeos e a porção lipídica das lipoproteínas. Os LPS, também 
conhecidos como endotoxinas, estão posicionados na membrana externa de modo que a porção 
relativamente hidrofílica fica exposta na superfície da célula bacteriana e constitui o antígeno 
O. A porção lipídica, lipídeo A, é responsável pelo efeito tóxico do LPS. A presença da ME 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
torna os patógenos Gram negativos resistentes às defesas do hospedeiro, como a lisozima. Em 
bactérias como E. coli, a ME permite sua sobrevivência no trato intestinal de animais, onde sais 
biliares e enzimas de degradação estão presentes. A ME também torna os Gram negativos 
resistentes a muitos antibióticos. A ligação do peptideoglicano à membrana externa é feita por 
lipoproteínas. 
Espaço periplasmático situa-se entre a membrana citoplasmática e a membrana externa 
e tem a consistência de um gel devido aos seus componentes. O periplasma é um sítio de 
reações químicas, transporte de soluto, regulação osmótica, secreção de proteínas e atividade 
hidrolítica. 
As figuras abaixo mostram as diferenças na composição da parede celular de bactérias 
Gram negativas e Gram positivas: 
 
 
 
 
 Gram positivas Gram negativas 
 
Coloração de Ziehl-Neelsen (a quente) e de Kinyoun (a frio) 
 
 Algumas bactérias possuem um envoltório de ácidos graxos e lipídeos complexos 
denominados ácidos micólicos que não fixam os corantes comuns. No entanto, quando essas 
células são coradas, através de processos drásticos resultantes de aquecimento, resistem a 
descoloração com solução de álcool-ácido. Desse modo são denominadas bactérias álcool-
ácido resistentes. Esta coloração diferencial é útil na identificação de espécies do gênero 
Mycobacterium, as quais apresentam uma superfície rica em ácidos micólicos, o que torna a 
membrana das micobactérias resistentes a solução álcool-ácido. Com o emprego do calor e de 
uma solução corante fenolada a 3% (fucsina de Ziehl-concentrada), o protoplasma dessas 
células é corado. Uma vez coradas, elas resistem longo tempo à ação sucessiva de um ácido 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
mineral forte e do álcool. Todas as outras bactérias não álcool-ácido resistentes, perdem a sua 
coloração pela fucsina, sendo posteriormente recoradas pelo azul de metileno a 1%. 
 
 
Vermelho et al. (2007) 
 
As micobactérias ao final da coloração apresentam-se como finos bacilos vermelhos, 
ligeiramente encurvados, que se destacam nitidamente do fundo azul da lâmina como mostra a 
figura abaixo: 
 
 
Manual de bacteriologia da tuberculose (Ministério da saúde) 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Prática de coloração de Gram 
 
 Fazer um desenho esquemático de cada uma das bactérias que foram observadas 
em aula: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 E. coli Bacillus sp Streptococcus sp. Staphylococcus sp 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
PRÁTICA: CULTURA DE OROFARINGE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sangue (Gram +) 
Coleta com Swab 
Tubo contendo solução fisiológica ou ADE 
Gram 
TUBO SECO 
ou 
Stuart 
 
Sabouraud 
(pesquisa de fungos) 
Identificação 
Antibiograma/Antifungigrama 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Protocolo: 
 
 
 Para a realização da coleta de orofaringe, o paciente deve estar em jejum e não 
ter feito assepsia bucal; 
 
 Deve-se instruir o paciente para abrir bem a boca e respirar profundamente. A 
emissão de um “ahh” pelo paciente serve para erguer a úvula e ajudar a reduzir o 
reflexo de náusea. 
 
 Em seguida, com o auxílio de um abaixador de língua, friccionar rapidamente o 
swab entre os pilares tonsilares (faringe posterior). Não tocar o swab nas paredes 
laterais da cavidade bucal, palato ou língua. A contaminação com saliva, que 
contém uma microbiota bacteriana variada, pode dificultar o isolamento do 
agente etiológico. 
 
 Procurar o material nas áreas com hiperemias próximas aos pontos de supuração 
ou remover o pus ou placa, colhendo o material a partir da base da lesão. 
 
 Após a coleta da amostra, o swab deve ser colocado imediatamente dentro de um 
tubo esterilizado contendo meio BHI ou Stuart e encaminhado imadiatamente ao 
laboratório para a realização do semeio em meios específicos. Se o objetivo for 
isolar S. pyogenes, a secreção de orofaringe deve ser coletada com auxílio de 
swab e transferido para tubo seco, devendo ser semeado imediatamente em 
ágar sangue. 
 
 Procedimento para semeio da amostra clínica: em uma placa de Petri 
contendo meio ágar sangue, fazer esfregaço na parte superior da placa com o 
swab e com auxílio da alça previamente flambada, estriar o material na 
superfície da placa e penetrar com a ponta da alça várias vezes no meio de 
cultura. 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
Identificação de Bactérias Gram positivas 
 
O Esquema a seguir mostra as provas de identificação de bactérias Gram positivas: 
 
 
 
Identificação das espécies de Staphylococcus de importância médica: 
Staphylococcus aureus 
S. saprophyticus 
S. epidermidis 
 
Catalase: é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. 
Excluindo os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas são 
catalase positivas. Esta prova é útil para diferenciar bactérias dos gêneros Staphylococcus (+) e 
Streptococcus (-) 
 
Coagulase: Tem atividade semelhante à protrombina, capaz de transformar ofibrinogênio em 
fibrina. A fibrina dificulta a fagocitose dos cocos ao mesmo tempo em que estabelece uma 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
barreira tendente a limitar o foco da infecção. Esta prova é útil para diferenciar S.aureus (+) 
dos Staphylococcus coagulase negativos (S. epidermidis e S. saprophyticus). 
 
DNase: enzima que despolimeriza o DNA do meio com formação de uma halo translúcido no 
meio de cultura. Staphylococcus aureus é DNase + e os outros estafilococos são DNase -. 
 
Ágar manitol salgado: além da coagulase e DNase, S. aureus pode ser identificado através do 
ágar manitol salgado que consiste em um meio de cultura seletivo para identificação presuntiva 
de S. aureus a partir de amostras clínicas. O meio contém manitol como única fonte de carbono 
e uma concentração de sal elevada (7,5%) que inibe o crescimento de outras bactérias. Ocorre 
degradação do manitol com formação de ácido e o vermelho de fenol (indicador de pH presente 
no meio) em pH ácido verte o meio de cultura do vermelho original para o amarelo. 
 
 
Novobiocina: a sensibilidade a novobiocina é útil para diferenciar as espécies de estafilococos 
coagulase negativas. Staphylococcus saprophyticus é resistente enquanto S. epidermidis é 
sensível. 
 
Tabela de identificação de bactérias do Gênero Staphylococcus 
 
Espécie Catalase Coagulase DNase Novobiocina Ágar manitol salgado 
S. epidermidis + - - S - 
S. aureus + + + S + 
S. saprophyticus + - - R - 
 
Identificação das espécies de Streptococcus de importância médica: 
 
As bactérias do gênero Streptococcus são mais exigentes quanto ao requerimento 
nutricional, necessitando de meios enriquecidos para o seu crescimento. O meio utilizado é o 
ágar sangue onde podemos verificar o grau de hemólise provocado pela liberação de citolisinas 
no meio pelas bactérias. Com relação ao grau de hemólise, os estreptococos podem ser 
divididos em alfa (α), beta (β) e gama (γ) hemolíticos. 
Teste da optoquina (disco de antibiótico): Útil para identificar os estreptococos alfa-
hemolíticos de importância médica como Streptococcus do grupo viridans (R) e S. pneumoniae 
(S). 
Bacitracina e Teste de CAMP: são provas úteis para diferenciar Streptococcus 
pyogenes (Bac S e CAMP -) de S. agalactiae (Bac R e CAMP +), ambos Beta-hemolíticos. A 
prova de CAMP consiste em semear uma estria horizontal de Staphylococcus aureus e 
perpendicularmente a esta estria, semeia-se a bactéria suspeita de ser S. agalactiae. A atividade 
hemolítica da β-lisina do Staphylococcus aureus sobre os eritrócitos presentes no meio ágar 
sangue é intensificado por um fator extracelular produzido por S. agalactiae, com formação de 
uma seta, como mostra a figura abaixo: 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Outra prova útil na para diferenciação de S. pyogenes e S. agalactiae é o teste de PYR 
(L-Pirrolidonil-β-naftilamida): neste teste, a enzima L-piroglutamil aminopeptidase presente 
no S. pyogenes hidroliza o substrato L-naftilamida-β-naftilamida com formação de β- 
naftilamida livre que é detectada pela adição do reagente N,N-dimetilaminocinamaldeído. Esse 
reagente de detecção conjuga-se a naftilamida, formando uma base de Shiff vermelha. A 
hidrólise do PYR é característica de amostras do gênero Enterococcus (E. faecalis e E. 
faecium) e Streptococcus pyogenes (beta-hemolítico do grupo A), porém ausente em outros 
estreptococos (Grupos B,C, D, F, G). 
Com relação aos γ-hemolíticos, temos como principais representantes Enterococcus spp 
(E. faecalis e E. faecium) e Streptococcus do grupo D. Como provas de identificação, temos o 
BHI salgado ou NaCl a 6,5% e Bile esculina. 
BHI salgado: é uma prova segura e definitiva para diferenciação dos Enterococcus (E. 
faecalis e E. faecium) daqueles identificados como não enterococos (S. bovium, S. avium, etc.). 
Apenas os Enterococcus são capazes de crescer neste meio. são capazes de crescer neste meio. 
Prova da bile esculina: os enterococos e os Streptococos do Grupo D crescem em 
presença de bile, sendo capazes de hidrolizar a esculina em glicose e esculetina (ou 
esculeteína). A esculetina em presença de íons férricos presentes no meio (citrato férrico) forma 
um complexo marrom escuro que resulta em um enegrecimento difuso do meio. Outros 
estreptococos são NaCl a 6,5% – e Bile esculina –, como mostra a tabela abaixo: 
 
Micro-organismos NaCl a 6,5% Bile esculina PYR 
Enterococcus spp + + + 
Streptococcus do 
Grupo D 
- + - 
Outros 
Streptococcus 
- - - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
Identificação de Bactérias Gram negativas 
 
Esquema para identificação de enterobactérias 
 
 
 
TSI: O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal forma que apresenta 
uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), 
peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal 
(indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. 
Este meio analisa a fermentação de glicose, lactose e sacarose com ou sem produção de H2S. 
No tubo inclinado, o pico exposto em toda superfície ao oxigênio é aeróbio, enquanto que a 
porção inferior está protegida do ar e é relativamente anaeróbia. Para os micro-rganismos que 
não fermentam carboidratos, os ácidos não são formados e a formação de aminas 
(conseqüência da degradação de aminoácidos do meio) no plano inclinado junto com os 
tampões alcalinos origina uma cor vermelha em todo o meio. Se o micro-organismo for 
fermentador de glicose, mas não de lactose e sacarose, só formará uma quantidade 
relativamente pequena de ácido a partir da concentração de glicose, que é 10 vezes menor que a 
de lactose e sacarose; entre 18 a 24h, toda a superfície inclinada reverte a um pH alcalino de 
cor vermelha e no fundo o meio fica amarelo por conta da produção de ácido (conseqüência da 
fermentação de glicose). Se o micro-organismo for fermentador de lactose (isso significa 
que ele é obrigatoriamente fermentador de glicose), tanto o pico como o fundo vão ficar 
amarelos por conta da grande produção de ácidos. 
Ainda no TSI existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradação do 
ácido fórmico em hidrogênio e anidrido carbônico, se a bactéria possuir o sistema hidrogênio 
fórmico liase - os gases são indicados ou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar 
o meio - o resultado é representado como A/A com gás. Há também a possibilidade da bactéria 
produzir H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando elétrons através da 
tiossulfato redutase, resultando em gás sufídrico e sulfito. O sulfeto de hidrogênio na presença 
de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel - dessa 
forma o resultado é dado como A/A com gás e H2S. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Desse modo, pode-se observar num único meio os processos fermentativos, respiração 
aeróbia e anaeróbia. A utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por 
respiração aeróbia, enquanto que na base os processos são realizados por fermentação 
(incluindo também putrefação, quando da utilização dos aminoácidos básicos, sulfurados, 
triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). Já a utilização 
do tiossulfato ocorre por respiração anaeróbia, gerando também gás sulfídrico. 
 
 
 
Produção de indol: o indol é um produto da degradação do aminoácido triptofano. As 
bactérias que produzem a enzima triptofanase podem clivar o triptofano e, deste modo, 
produzir indol.A prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após 
a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (solução aquosa ou 
alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da parede interna do tubo. A 
prova é positiva quando na porção superior, na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se 
um anel de cor rósea dentro de no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação 
do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. O indol reage com o 
reagente formando um composto colorido róseo. 
 Triptofano Indol + piruvato e amônia 
 
Utilização de citrato: alguns micro-organismos como a E. coli não possuem a permease do 
citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo portanto 
crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, 
intracelulares, que degradam o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido 
inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 
6,8 a 7,0 apresenta-se verde. O consumo do citrato pela enzima citratase induz a formação de 
fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação 
de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova 
negativa o meio não se altera, pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a 
inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente 
do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
 
 
Caldo Tioglicolato: É utilizado para verificar o requerimento de oxigênio. A elevada 
viscosidade do meio (0,75g/L de agar) impede a penetração rápida de oxigênio. As substâncias 
redutoras são o tioglicolato e a cisteina. O indicador de oxigênio é a rezasurina sódica. 
 
Fenilalanina: a determinação da fenilalanina desaminase é útil para diferenciação inicial das 
espécies Proteus, Morganella e Providencia de outros bacilos gram-negativos.Quando 
desaminada, a fenilalanina forma um cetoácido, o ácido fenilpirúvico. Apenas as espécies 
citadas produzem a enzima desaminase necessária para essa conversão. A prova é positiva se 
houver desenvolvimento de cor verde após adição de uma solução de cloreto férrico a 10%. 
 
Produção de sulfeto de hidrogênio: A produção de H2S pode ser detectada se as seguintes 
condições estiverem presentes: 
 Existir uma fonte de enxofre no meio (peptonas, tiossulfato de sódio) 
 Existir um indicador de H2S no meio (citrato férrico, sulfato ferroso, ferro peptonado, 
etc.) 
 O meio favoreça o crescimento da bactéria e a bactéria possua os sistemas enzimáticos 
produtores de H2S. 
Em todos os meios de detecção de H2S, o ponto final é um precipitado negro, insolúvel 
formado no meio. Os meios em que podemos visualizar a produção de H2S são: LIA ou Lisina, 
TSI, SIM, Hektoen Enteric (HE) e Salmonella-shigella (SS). 
 
Ágar lisina Ferro (LIA) ou teste da lisina: Este meio é inclinado em tubos, apresenta 
indicador de pH (púrpura de bromocresol e lisina (aminoácido). Este teste é útil para identificar 
as bactérias que são capazes de descarboxilar a lisina (através da enzima lisina descarboxilase) 
a aminas, alcalinizando o meio e vertendo-o para uma coloração púrpura. 
 
 Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade): é um meio semi-sólido onde podem ser observadas a 
motilidade da bactéria, a produção de H2S e a presença de indol. A motilidade no meio SIM 
indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova bioquímica e sim fisiológica, 
mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da 
técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade 
quando os micro-organismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. 
A prova é negativa quando os micro-organismos ficam restritos ao local da inoculação sem, 
contudo, turvar o meio. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
Prova da produção de urease: A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas 
de amônia e uma de anidrido carbônico. A prova consiste em transferir uma porção do 
crescimento bacteriano com uma alça para o meio contendo uréia, pH neutro e um indicador de 
pH, o vermelho fenol. Após o crescimento a prova é revelada positiva quando a urease atua 
degradando a uréia a amônia, alcalinizando o meio e vertendo-o a coloração rosa choque. Na 
prova negativa não há alteração da cor do meio. Os organismos do gênero Proteus e Klebsiella 
são urease positivos diferentemente da maioria das enterobactérias. 
 
 
Prova da citocromo oxidase: Todas as enterobactérias são citocromo-oxidase negativa. O 
sistema citocromo é encontrado nos organismos aeróbios e microaeróbios facultativos. O teste 
da oxidase é importante na identificação de organismos que não possuem a enzima ou são 
anaeróbios obrigatórios. Os citocromos participam da última ligação da cadeia respiratória 
transferindo elétrons (Hidrogênio) ao oxigênio com formação de H2O. No teste são usados 
reativos corantes como o dimetil ρ-fenilenodiamina que atuam como aceptores de elétrons 
substituindo a oxigênio. A ρ-fenilenodiamina é incolor no estado reduzido, mas na presença de 
citocromo oxidase, o corante se oxida formando o azul de indofenol. O teste é negativo se não 
ocorrer alteração da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rósea pálida, como mostra a 
figura abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E. coli Pseudomonas 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Resumo da técnica de semeadura em tubo nos principais meios para identificação de Gram 
negativos: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Tabela com as principais provas bioquímicas e meios utilizados 
para identificação de bactérias Gram negativas 
 
 
Micro-organismo 
 
Provas Bq 
TSI INDOL Motilidade Uréia Citrato Glicose H2S Fenilalanina 
Klebsiella Ac/Ac O+/-P – + + + – – 
E. coli Ac/Ac + +/– – – + – – 
Salmonella Al/Ac – + – + + +/– – 
Shigella Al/Ac –/+ – – – – – – 
Proteus Ac/AcV 
Al/Ac 
+/– + + V V/+ + + 
 O = K. oxitoca ; P = K. pneumoniae ; V = P. vulgaris 
 
 
Micro-organismo EMB HE MC 
 
E. coli 
(Fermentador forte 
de lactose) 
 
Colônias escuras com 
brilho verde metálico 
 
Alaranjadas a 
salmão 
 
Rosadas ou vermelhas, não 
mucóides. Podem ser rodeadas 
de um precipitado opaco de 
sais biliares 
 
Klebsiella 
(Fermentador 
fraco de lactose) 
 
Colônias grandes, 
mucóides com bordas 
claras e centro escuro 
 
 
Alaranjadas a 
salmão 
 
Grandes, rosadas a creme e 
mucóides 
 
Salmonella 
 
Colônias incolores 
(Não fermenta a lactose) 
 
Incolores ou da 
cor do meio com 
centro negro 
(produção de H2S) 
 
Incolores e/ou transparentes 
Shigella Colônias Incolores 
(Não fermenta a lactose) 
Incolores ou 
esverdeadas (da 
cor do meio) 
Incolores e/ou transparentes 
Proteus Colônias Incolores 
(Não fermenta a lactose) 
Incolores ou 
Esverdeadas (da 
cor do meio) com 
precipitadoenegrecido 
(produção de H2S) 
Incolores e/ou transparentes 
*EMB= Eosina Azul de Metileno HE= Hektoen Enteric MC= MacConkey 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Esquema de identificação de Bacilos não-fermentadores (BNF’s) 
 
 
 
 
 
 
Os BNF´s constituem um grupo de micro-organismos oportunistas cuja importância 
clínica está relacionada às condições do paciente. São causadores principalmente de infecções 
nosocomiais. Os gêneros Pseudomonas e Acinetobacter são considerados os mais importantes. 
Estes bacilos recebem a denominação de não-fermentadores, pois não utilizam carboidratos 
através de vias fermentativas. Os bacilos capazes de metabolizar os carboidratos através da via 
oxidativa são denominados oxidativos ou sacarolíticos, enquanto os que não utilizam 
carboidratos por nenhuma das vias metabólicas são referidos como bioquimicamente inertes, 
não oxidativos ou assacarolíticos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Prática 
 
Assunto: Identificação de bactérias Gram Negativas Fermentadoras (coprocultura) 
Grupo 1 
Paciente 1 (Descrição da sintomatologia) 
Paciente idoso de 65 anos, sexo feminino, apresentou um quadro febril e considerável aumento 
no número de evacuações caracterizando um quadro de diarréia. Foi colhida uma amostra de 
fezes deste paciente e realizadas coloração de Gram e coprocultura. A coloração de Gram 
revelou ao microscópio bacilos Gram negativos. O material coletado foi semeado nos meios 
EMB, HE e MC, sendo visualizadas colônias de brilho verde metálico no EMB e colônias 
alaranjadas a salmão no HE. Observe as placas semeadas e realize a identificação bioquímica. 
 
Micro-
organismo 
TSI CITRATO LISINA Fenilalanina SIM 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 
Características dos micro-organismos nos meios de cultura 
 
Micro-
organismo 
EMB HE MC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
 
Grupo 2 
Paciente 1 (Descrição da sintomatologia) 
Paciente L.B.C., 5 anos, deu entrada no pronto socorro do Hospital São Paulo apresentando 
quadro com febre de 38°C, diarréia e quadro de desidratação leve. Foi solicitada uma 
coprocultura que após 24 h de incubação tornou-se positiva, sendo observado crescimento em 
meio ágar EMB, HE e MC colônias grandes com diâmetro de 3 a 4 mm, de consistência 
mucóide que à coloração de Gram apresentavam-se como bacilos Gram Negativos. Observe as 
placas semeadas e realize a identificação bioquímica. 
 
Micro-
organismo 
TSI CITRATO LISINA Fenilalanina SIM 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 
Características dos micro-organismos nos meios de cultura 
 
Micro-
organismo 
EMB HE MC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
 
 
Grupo 3 
Paciente 1 (Descrição da sintomatologia) 
Paciente masculino de 31 anos apresentou um quadro de febre moderada, acompanhada de 
náuseas, dores abdominais, cólicas e diarréias após 12h de ter ingerido frango em refeitório. 
Foram realizadas coloração de Gram e coprocultura nas quais foram evidenciados bacilos Gram 
Negativos, oxidase negativa e lactose negativa nos meios EMB, HE e MC. Observe as placas 
semeadas e realize a identificação bioquímica. 
 
 
Micro-
organismo 
TSI CITRATO LISINA Fenilalanina SIM 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 
Características dos micro-organismos nos meios de cultura 
 
Micro-
organismo 
EMB HE MC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
Grupo 4 
Paciente 1 (Descrição da sintomatologia) 
Paciente do sexo feminino de 25 anos foi levada ao hospital por apresentar um quadro de febre 
há 4 dias, acompanhada de náuseas, fortes dores abdominais, presença de sangue e muco nas 
fezes (caracterizando uma disenteria); e prostração após 12h de ter ingerido água proveniente 
de um copo escavado há mais de 3 anos. Bactérias Gram negativas e lactose negativa foram 
visualizadas nos meios EMB, HE e MC. Observe as placas semeadas e realize a identificação 
bioquímica. 
 
Micro-
organismo 
TSI CITRATO LISINA Fenilalanina SIM 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 
 
 
Micro-
organismo 
EMB HE MC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Prática: Urocultura 
 
UROCULTURA: MÉTODO DE CULTIVO QUANTITATIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GRAM - GRAM + 
URINA
A 
ALÇA CALIBRADA 1µL 
Ágar EMB AGAR 
SANGUE 
AGAR 
BROLACIN 
(CLED) 
CRESCIMENTO 
BACTERIANO EM 
AMBAS AS PLACAS 
CRESCIMENTO 
APENAS NO 
SANGUE 
IDENTIFICAÇÃO 
BACTERIANA 
Antibiograma 
COLÔNIAS 
FERMENTADORAS DE 
LACTOSE 
(AMARELAS) 
COLÔNIAS NÃO 
FERMENTADORAS 
(AZUIS) 
CONTAGEM EM 
AMBAS AS PLACAS 
x1000 
CONTAGEM NA PLACA 
 x2 x1000 CONTAGEM NA PLACA 
 x1000 
IDENTIFICAÇÃO 
BACTERIANA 
Antibiograma
a 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 Prática: Urocultura 
 
Realize o protocolo de urocultura e em seguida observe os resultados da identificação 
bacteriana e identifique o micro-organismo estudado. 
 
 
1.2 Resultados: 
 
1.2.1 Visualização das placas: 
 
Micro-
organismo 
SANGUE EMB CLED CETRIMIDA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
. 
1.2.2 PROVAS BIOQUÍMICAS: 
 
Micro-organismo TSI CITRATO LISINA Fenilalanina SIM 
 M* I * H2S* 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M I H2S 
 M IH2S 
*M= motilidade; I=Indol; H2S= Sulfeto de Hidrogênio 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 Prática: Hemocultura 
 
 
 COLETA 
 1:10 (Sangue:meio de cultura) 
 
 
 Aerobiose Anaerobiose 
 
BHI- caldo Columbia com Polianetol Sulfonato de sódio (SPS) Caldo tioglicolato 
 
 
 
 
 Isolamento (Subcultivo) 
 
 Ágar sangue Ágar MacConkey Ágar chocolate/ 
 Thayer-Martin 
 
 
 
 Identificação (Série Bioquímica) Antibiograma 
 
 
 
 
 
 
 
Os frascos devem ser acondicionados em estufa de cultivo a 37°C por 24h. Após este 
período, subcultivos devem ser realizados em meios específicos caso sejam visualizadas 
turvação e hemólise. O período máximo de incubação são 7 dias. Se as culturas permanecerem 
sem crescimento, o resultado do teste é negativo. Lembrando que frascos apresentando 
turvação, mas sem crescimento bacteriano, é sugestivo de presença de fungos. Neste caso, 
subcultivos devem ser realizados em Agar Sabouraud adicionado de cloranfenicol. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Protocolo para cultura de LCR 
 
 
 COLETA (Punção lombar) 
 
 
 
 
CENTRIFUGAÇÃO 
 
 (Pesquisa de BAAR ou Bacilo de Koch) 
 
 
 
GRAM ou Ziehl-Neelsen 
 
 
 
 
 
 
 
Ágar sangue Ágar MacConckey Ágar Chocolate/ 
 Thayer-Martin 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antibiograma 
 Identificação 
 (Série Bioquímica) 
Para micro-organismos como Neisseria 
meningitidis e Haemophilus spp, deve-
se fazer o método da vela para 
otimizar seu crescimento em cultura. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Prática: Coprocultura 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Enriquecimento 
 Caldo Tetrationato 
Isolamento 
EMB SS HE 
Identificação 
Série Bioquímica 
(TSI, Citrato, SIM, Uréia, Fenilalanina, etc.) 
Sorologia 
- Salmonella 
- Shigella 
- E. coli 
Antibiograma 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Antibiograma 
 
Antibiogramas são testes com o objetivo de verificar a sensibilidade de determinado 
micro-organismo a vários antibióticos mediante comparação utilizando um padrão ou tabela 
pré-estabelecidos. Uma das funções mais importantes dos laboratórios de análises clínicas e 
laboratórios hospitalares é a de detectar por intermédio desses testes qual a 
sensibilidade/resistência do micro-organismo que está causando infecção diante de vários 
antibióticos, de modo a escolher o antimicrobiano mais adequado. Basicamente existem dois 
métodos para determinar a sensibilidade de uma bactéria aos agentes antimicrobianos: método 
da diluição em tubo/placa e método da difusão em disco. 
 
Método da diluição em tubo ou em Placa de Microtitulação 
 
 São usadas várias concentrações do antimicrobiano (geralmente 10) com o objetivo de 
determinar a mínima concentração do antibiótico (µg/mL) que é capaz de inibir o crescimento 
da bactéria in vitro. Esta concentração é denominada Concentração Inibitória Mínima (CIM). 
Para tratamento, geralmente se usa como margem de segurança uma concentração 10 vezes 
acima do valor da CIM, visto que outros fatores como ligação do antibiótico à proteínas séricas 
ou a presença de inibidores tissulares podem reduzir a ação do antibiótico. 
Além da CIM, podemos determinar também a mínima concentração do antibiótico que é 
capaz de eliminar completamente a população bacteriana, denominada Concentração Mínima 
Bactericida (CMB). A CMB é mais usada para pacientes imunocomprometidos ou em 
pacientes acometidos por endocardites. 
 
Método de difusão em disco pela técnica de Kirby; Bauer (1966) 
 
 O método de Kirby-Bauer é um método qualitativo, amplamente utilizado como 
método-padrão para a realização dos antibiogramas. Este método utiliza concentrações 
preestabelecidas dos antimicrobianos e tem como finalidade medir a eficácia de uma variedade 
de antibióticos sobre uma espécie de micro-organismo, fornecendo orientação para prescrição, 
na prática médica, da maioria dos antibióticos usados na terapia das infecções bacterianas. 
No teste de Kirby-Bauer, uma série de antibióticos impregnados em pequenos discos 
circulares de papel é colocada sobre uma placa contendo meio de cultura crescido com a 
bactéria inoculada de forma homogênea. As placas são incubadas em temperatura e tempo 
temperatura e tempo adequados para permitir o crescimento da bactéria e também para que os 
antibióticos possam difundir-se no interior do ágar. 
A figura abaixo mostra os materiais necessários para a realização do antibiograma pela 
técnica de Kirby-Bauer: 
 
 Materiais para a realização do antibiograma: 
 (A) Placa de Petri com meio ágar Mueller-Hinton; 
 (B) suspensão da bactéria; (C) swab estéril 
 (D) pinça estéril para colocação dos discos impregnados com antibióticos 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Antibiograma: Prática 
 
 
Procedimento: 
1. Padronização do inóculo bacteriano: A partir da placa original da cultura bacteriana do 
micro-organismo a ser testado são transferidas 3 a 5 colônias para o ágar Mueller-Hinton. Em 
seguida, incuba-se durante 2 a 4 horas. A densidade do inóculo deve ser ajustada para a escala 
de turbidez 0,5 de McFarland, equivalente a 10
8
 bactérias por mL de meio. 
2. Semeio: Realizado através de “swab” estéril embebido no inóculo bacteriano e semeado em 
toda a área da superfície do meio ágar Mueller-Hinton (semeio em tapete). Deixar secar por 2 
minutos. 
3) Com auxílio de uma pinça esterilizada colocar sob a superfície do meio inoculado os discos 
de antibióticos em pontos eqüidistantes fazendo leve pressão sobre eles. 
4) Incubar a temperatura ideal (geralmente 37°C) para o crescimento daquela população 
bacteriana por 18-24h. 
5) Leitura: Observar halo deinibição em torno do disco de antimicrobiano. O diâmetro deste 
halo é medido em mm (halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo fabricante ou 
CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Para cada agente antimicrobiano, o diâmetro do 
halo poderá ser interpretado como sensível (S), resistente (R) ou intermediário (I). 
 
 Visualização da placa do teste de antibiograma. O diâmetro dos halos de inibição 
são medidos com auxílio de uma régua e o resultado em mm é comparado com os 
valores fornecidos pelo fabricante. 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Tabela 1. Limites para interpretação do antibiograma com antibacterianos de uso 
corrente na terapêutica clínica. 
 
Micro-
organismo 
Antimicrobianos Resistente 
(mm) 
Intermediário 
(mm) 
Sensível 
(mm) 
Enterococcus sp Eritromicina 
Vancomicina 
Estreptomicina 
≤ 13 14-22 ≥23 
≤ 14 15-16 ≥17 
≤ 14 14-16 ≥17 
S. saprophyticus Oxacilina 
Amicacina 
Penicilina G 
≤ 17 - ≥18 
≤ 17 - ≥18 
≤ 28 - ≥29 
S. agalactiae Gentamicina 
Tetraciclina 
Vancomicina 
≤ 12 13-14 ≥15 
≤ 14 15-18 ≥19 
≤ 14 15-16 ≥17 
E. coli Cloranfenicol 
Cefepime 
Ácido nalidíxico 
≤ 12 13-17 ≥18 
≤ 14 15-17 ≥18 
≤ 13 14-18 ≥19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Características dos meios de cultura utilizados em bacteriologia 
clínica 
 
 
AGAR MANITOL 
 
É um meio seletivo para o isolamento e identificação presuntiva de estafilococos 
patogênicos. Sua elevada concentração de NaCl (7,5%) suprime o crescimento de outras 
bactérias, deixando crescer apenas o gênero Staphylococcus. A degradação do manitol com 
formação de ácido está correlacionada com a patogenicidade do gênero em questão e serve 
como indicador presuntivo da presença de Staphylococcus aureus. O vermelho de fenol 
funciona como indicador de pH. Uma viragem do vermelho original do meio para amarelo 
indica degradação do manitol com formação de ácido. 
 
AGAR BILE ESCULINA 
 
É um meio utilizado para verificar a hidrólise da esculina e tolerância à bile, que são 
consideradas característica constantes dos grupo sorológico D (Enterococcus). Os 
Enterococcus podem multiplicar-se livremente nesse meio, por não serem inibidos pelos sais 
biliares. Deste modo produzem a hidrólise do glicosídeo esculina, convertendo-o em glicose e 
esculetina. A esculetina reage com íons férricos existentes no meio, produzindo um complexo 
de coloração escura, que evidência a positividade da prova. 
 
AGAR EMB 
 
É um meio seletivo e diferencial utilizado no isolamento de enterobactérias e bacilos 
coliformes a partir de fezes, água e outros materiais. Os fermentadores de lactose, sobretudo a 
E. coli, produzem colônias de coloração escura, podendo apresentar um brilho verde metálico 
característico. Os produtores mais fracos de ácido (Klebsiella) desenvolvem colônias 
geralmente acinzentadas a creme com centro escuro, enquanto que os não fermentadores 
(Salmonella e Shigella) formam colônias transparentes. Os corantes eosina e azul de metileno 
inibem o crescimento de gram-positivos, e se combinam formando um complexo que tem 
coloração escura e precipita em pH ácido. Deste modo, esses corantes agem como indicadores e 
inibidores. 
 
AGAR MACCONKEY 
 
É um meio diferencial e seletivo para enterobactérias e outros bacilos gram-negativos 
entéricos. Os típicos fermentadores de lactose formam colônias róseas-avermelhadas. Os 
fermentadores fracos de lactose podem formar colônias ligeiramente rosadas e amostras lactose 
negativas são incolores ou transparentes. Os sais biliares e o cristal-violeta inibem o 
crescimento de bactérias Gram-positivas. A lactose é o único carboidrato presente no meio. O 
vermelho neutro funciona como indicador, produzindo uma viragem em pH abaixo de 6,8. 
Deste modo, as colônias têm diversas tonalidades de vermelho, de acordo com a quantidade de 
ácido produzida. 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
AGAR SANGUE 
 
É um meio altamente nutritivo, utilizado para o crescimento da maioria das bactérias 
causadoras de infecção. No entanto, é particularmente útil no isolamento e identificação de 
patógenos exigentes e para determinação da atividade hemolítica de algumas bactérias. A base 
nutritiva oferece ótimas condições de crescimento aos micro-organismos presentes. O pH do 
meio (6,8) é especialmente favorável para a conservação dos eritrócitos e para a formação de 
halos claros de hemólise. A verificação da capacidade hemolítica é particularmente importante 
na escolha dos testes complementares e diferenciais do gênero Streptococcus. 
 
OBS:  - hemólise = hemólise parcial (forma-se ao redor da colônia um halo esverdeado- 
formação de biliverdina resultante da degradação da hemoglobina) 
  - hemólise = hemólise total (forma-se ao redor da colônia um halo claro/ transparente) 
  - hemólise = ausência de hemólise 
 
MEIO CLED (BROLACIN) 
 
É um meio não seletivo e diferencial, idealizado para utilização em uroculturas. Permite 
a diferenciação de colônias lactose negativas (colônias azuis) e colônias lactose positivas 
(colônias amarelas). Os componentes principais do meio são: lactose (fonte de carbono), L-
cistina (fonte de íons), azul de bromotimol (indicador de pH). Sendo o meio deficiente em 
eletrólitos, inibe o crescimento em forma de “véu de noiva” característico de Proteus, 
produzindo colônias isoladas. 
 
COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA 
 
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB): 
 
PEPTONA DE CASEÍNA 10,0g 
LACTOSE 5,0g 
SACAROSE 5,0g 
FOSFATO DIPOTÁSSICO 2,0g 
EOSINA Y 0,4g 
AZUL DE METILENO 0,065g 
AGAR 13,5g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH: 7,2 
 
AGAR BROLACIN (CLED): 
 
PETONA 4,0g 
EXTRATO DE CARNE 3,0g 
TRIPTONA 4,0g 
LACTOSE 10,0g 
L-CISTINA 0,128g 
AZUL DE BROMOTIMOL 0,02g 
AGAR 15,0g 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
ÁGUA DESTILADA 1000ml 
 
pH:7,3 
 
 
AGAR MUELLER HINTON: 
 
INFUSÃO DE CARNE 300,0g 
CASÉINA HIDROLISADA 17,5g 
AMIDO 1,5g 
AGAR 17,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH: 7,4 
 
AGAR SANGUE 
 
INFUSÃO DE CARNE 300,0g 
CASÉINA HIDROLISADA 17,5g 
AMIDO 1,5g 
AGAR 17,0g 
ÁGUA DESTILADA 
SANGUE CARNEIRO DESFIBRINADO 
E ESTÉRIL 
1000 ml 
5% 
 
 
AGAR MANITOL SALGADO: 
 
PEPTONA ESPECIAL 10,0g 
EXTRATO DE CARNE 1,0g 
CLORETO DE SÓDIO 75,0g 
D-MANITOL 10,0g 
VERMELHO DE FENOL 0,025g 
AGAR 12,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH: 7,4 
 
AGAR BILE ESCULINA: 
 
EXTRATO DE CARNE 3,0g 
PEPTONA DE CARNE 5,0g 
BILE BOVINA 40,0g 
ESCULINA 1,0g 
CITRATO FÉRRICO 0,5g 
AGAR 15,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH:6,6 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
AGAR DNAse: 
 
TRIPTOSE 20,0g 
CLORETO DE SÓDIO 5,0g 
ÁCIDO DESOXIRIBONUCLEICO 2,0g 
AGAR 15,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH:7,3 
 
AGAR TRIPLE SUGAR IRON (TSI): 
 
EXTRATO DE CARNE 3,0g 
EXTRATO DE LEVEDURA 3,0g 
PEPTONA DE CARNE 3,0g 
PEPTONA DE CASEÍNA 15,0g 
SACAROSE 10,0g 
LACTOSE 10,0g 
GLICOSE 1,0g 
SULFATO FERROSO 0,2g 
TIOSULFATO DE SÓDIO 0,3g 
CLORETO DE SÓDIO 5,0g 
VERMELHO DE FENOL 0,024g 
AGAR 12,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH:7,1 
 
AGAR CITRATO DE SIMMONS: 
 
FOSFATO DIHIDROGENADO DE 
AMÔNIA 
1,0g 
FOSFATO DIPOTÁSSICO 1,0g 
CLORETO DE SÓDIO 5,0g 
CITRATO DE SÓDIO 2,0g 
SULFATO DE MAGNÉSIO 0,2g 
AZUL DE BROMOTIMOL 0,08g 
AGAR 15,0g 
ÁGUA DESTILADA 100ml 
 
AGAR LISINA FERRO(LIA): 
 
PEPTONA DE CARNE 5,0g 
EXTRATO DE LEVEDURA 3,0g 
GLICOSE 1,0g 
L-LISINA MONOCLORIDRATO 10,0g 
TIOSULFATO DE SÓDIO 0,04g 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
CITRATO FÉRRICO AMONIACAL 0,5g 
PURPURA DE BROMOCRESOL 0,02g 
AGAR 12,5g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH: 6,7 
 
MEIO SIM 
 
DIGESTÃO PÉPTICA DE TECIDO 
ANIIMAL 
30,0g 
EXTRATO DE CARNE BOVINA 3,0g 
FERRO PEPTONIZADO 0,2g 
TIOSULFATO DE SÓDIO 0,025g 
CITRATO FÉRRICO AMONIACAL 0,5g 
AGAR 3,0g 
ÁGUA DESTILADA 1000 ml 
 
pH 7.3 ± 0.2 
 
AGAR FENILALANINA 
 
EXTRATO DE LEVEDURA 3,0g 
CLORETO DE SÓDIO 5,0g 
D-FENILALANINA 2,0g 
FOSFATO DISSÓDICO 1,0g 
AGAR 15,0g 
ÁGUA DESTILADA 
pH: 7,3 
1000 ml 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Mini-atlas de bacteriologia clínica 
 
Identificação de bactérias Gram positivas: 
 
 
 Ágar bile esculina 
Ágar manitol salgado e Vogel-Johnson (VJ): ambos apresentam 
manitol e são úteis na identificação de S. aureus. A diferença é que no 
VJ é adicionado o telurito de potássio e as colônias bacterianas 
apresentam precipitado enegrecido. 
 
 
 Ágar DNase: Identificação presuntiva de S. aureus Prova da catalase 
 
 
Bile esculina +: enegrecimento do meio S. aureus no ágar Vogel-Johnson (VJ) e no ágar manitol salgado: No 
primeiro, as colônias de S. aureus apresentam precipitado enegrecido e o 
meio verte para amarelo e no segundo, as colônias são amareladas e o 
meio verte para o amarelo também devido à produção de ácidos. 
 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 Ágar DNase : A= DNase + com formação de halo transparente Colônias de S. aureus no meio CLED: 
próximo à colônia (S. aureus). Formação de um halo opaco é DNase – meio verte para o amarelo devido a produção de 
(S. epidermidis/S. saprophyticus) ácidos. 
 
Prova de CAMP: Formação de seta (identificação presuntiva Teste de coagulase positivo (A) e negativo (B) 
de Streptococcus agalactiae) 
 
Orofaringe: 
 
 
 
Colônias com α-hemólise: Colônias grandes amareladas β-hemolíticas no ágar sangue: Ausência de crescimento no EMB: 
Grupo Viridans S. aureus Bactérias Gram + 
 
 
Resistência a optoquina (ausência de halo 
 ao redor do disco): Grupo viridans Bacitracina sensível (A): Streptococcus pyogenes 
 Bacitracina resistente (B): S. do Grupo G. 
 
 
Identificação de bactérias Gram negativas: 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
 
Da esquerda para direita: Meio HE, SS e EMB Meio CLED Meios não semeados: Caldo tetrationato;TSI; 
 Citrato; meio SIM; Caldo tioglicolato; uréia 
 
 
 
 Caldo tioglicolato Meio SIM: Motilidade + , produção de H2S + Lisina ou LIA: roxo (+) 
 
 
Teste do indol: anel vermelho (+) Citrato: + (azul); – (verde) Produção de urease 
 
 
Fenilalanina: identificação dos gêneros Caldo tetrationato, uréia -, citrato + TSI Al/Al, citrato +, uréia – 
Proteus, Morganella e Providência e TSI Al/Al: Pseudomonas spp. Acinetobacter spp 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
TSI Ac/Al com produção de H2S; Citrato +; TSI Ac/Ac sem produção de H2S; Motilidade -; Indol -; 
Motilidade + com produção de H2S; urease +; caldo tioglicolato turvo (anaeróbio facultativo); urease + 
Fenilalanina +: Proteus spp Citrato +: Klebsiella spp 
 
 
TSI Ac/Al com produção de H2S ; Motilidade + com produção TSI Ac/Al sem produção de H2S; citrato -; urease - 
de H2S; Fenilalanina -; urease -; citrato +: Salmonella spp. Caldo tioglicolato turvo (anaeróbio facultativo), caldo 
tetrationato e motilidade -: Shigella spp. 
 
 
TSI Ac/Ac com produção de gás; citrato -; motilidade +, indol + E. coli no meio EMB 1: colônias secas com 
Urease -; caldo tioglicolato turvo (anaeróbio facultativo); caldo brilho verde metálico 
tetrationato: E. coli 
 
 
Características fisiológicas de Enterobactérias no agar SIM: Motilidade +; Motilidade – , indol 
+; Produção de H2S e Motilidade + 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
 
E. coli no EMB 2: Colônias com centro escuro E. coli no meio HE: colônias de alaranjadas a salmão. 
e brilho verde metálico Colônias de Klebsiella spp apresentam as mesmas 
características da E. coli neste meio com exceção de 
serem maiores e mucóides. 
 
 E. coli no meio SS: colônias pequenas variando Klebsiella spp no meio EMB: colônias grandes 
 de rosa a vermelho. mucóides com bordas claras e centro escuro. 
 
 
 
 E. coli no ágar CLED com indicador de Andrade 
 
 
Proteus spp no ágar sangue: Proteus no ágar CLED: crescimento inibido Salmonella spp no meio HE: colônias 
observação do “véu de noiva” esverdeadas com precipitado enegrecido 
 (produção de H2S) 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira KocerginskyProteus spp nos meios EMB, HE e SS: colônias incolores (não fermentador de lactose); colônias 
esverdeadas com centro escuro e colônias incolores com centro escuro (se produzirem H2S), respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
Shigella spp no meio EMB: colônias Shigella spp no meio HE: colônias Shigella spp no meio SS: colônias 
 Incolores esverdeadas sem produção de H2S incolores sem produção de H2S 
 
 
 Gram negativo não-fermentador: 
 
 
Colônias esverdeadas no cetrimida e azuladas no meio Colônias de Pseudomonas com brilho metálico no meio TSI 
CLED 
 
 
 
 
 
 
Aprendemos quando compartilhamos experiências (John Dewey) 
 
 
 
Profa. Patricia de Oliveira Kocerginsky 
Referências bibliográficas 
 
 
 Barth, A.L., Freitas, A.L.P., Martins, A.F., Perez, V.P. Bacteriologia Clínica: manual de 
aulas práticas. Editora Universitária Metodista IPA, 2010. 
 Clinical laboratory standards institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility 
test for bacteria that grow aerobically. Approved standard M02–A10. CLSI, Wayne, Pa, 2009. 
 Filho, L.S. Manual de Bacteriologia Clínica. Editora Universitária UFPB, 4ª Ed. 2006, 
320 p. 
 Koneman E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas colorido. Guanabara 
Koogan, 6ª ed. 2008. 
 Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Pfaller, M.A. Microbiologia médica. Elsevier, 2010. 
 Oplustil, C.P., Zoccoli, C.M., Tobouti, N.R., Sinto, S.I. Procedimentos básicos em 
Microbiologia clínica. Editora Sarvier, 3 edª, 2010. 
 Silva, C.H.P. Bacteriologia: um texto ilustrado. Editora Eventos, 1999, 531 p. 
 Vermelho, A.B., Bastos, M.C.F., Sá, M.H.B. Bacteriologia geral. Guanabara Koogan, 
2007. 
 Vermelho, A.B., Pereira, A.F., Coelho, R.R.R., Souto-Padron, T. Práticas de 
microbiologia. Guanabara Koogan, 2006.