Aula 1 CTH

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Na medula ossea há um nicho que mantém a celula tronco ligada dentro dela.
Leucemia- células troco doente, clones neoplásicos sem a capacidade de parar de proliferar. Ocupam a medula óssea e prejudicam a formação das células sanguíneas (falta de hemácias- anemia, falta de plaquetas- sangramento, falta de células de defesa- infecção).
Tratamento
- quimioterapia. Não consegue matar todas as células defeituosas. Células residuais permanecem no interior dos nichos 
-condicionamento- quimioterapia forte ou associada a radioterapia (estimulo agressivo rompe o nicho e solta célula tronco defeituosa, perda da produção de sangue)
-Transplante de medula óssea- Aplicação no doador de GCSF (fator estimulante de crescimento de granulócitos), que solta as células tronco do nicho. Então elas vão para o sangue periférico. 
-As células tronco expressam uma molécula chamada Cd34. O sangue é coletado do doador e Cd34 é dosada até que seja atingido o volume adequado ao sangue do paciente que vai receber as células sanguíneas. O sangue com Cd34 é dosado no sangue periférico do paciente.
-No paciente, o nicho vazio (devido ao estímulo agressivo) está ávido por células tronco. Aumento de stf1, esfingolípides. 
Stf1 atrai cd34. 
Holming- propriedade da célula tronco de voltar pro nicho
-Então a célula tronco volta a produzir o sangue normalmente. Volta a produzir linfócitos. Linfócitos T atacam tudo o que encontram de estranho. Casso tenha sobrado uma célula defeituosa (leucêmica), ela vai ser atacada pelos linfócitos T (efeito enxerto contra o hospeddeiro). Ainda assim, há risco de rejeição devido a outras estruturas.
-Transplante autólogo- A quimioterapia convencional nem sempre é o suficiente para destruir todas as células cancerígenas. Em algumas casos é necessária a quimioterapia pesada, que pode ocasionar a morte das células tronco da medula óssea. Então, é necessário o transplante de medula óssea para recuperar essas células. Nesse caso o doador é o próprio paciente, antes dele ser submetido à quimioterapia (de acordo com os mesmos princípios abordados acima)
-Celula tronco hematológica- multipotente- capaz de originas todas as células do sangue
Produção do Sangue
-local varia ao logo da vida
Vida intra ulterina
-hematopoiese primitiva- saco vitelíinico. Células do mesoderma começam a migrar em direeção ao saco vitelínico e a formar as ilhotas de sangue, onde há os hemangioblastos, capazes de originar eritrócitos, e vasos. Formação de hemoglobina nas células centrais e achatamento das células laterais- formação dos vasos. Quinta semana, células eritroides e macrófago. Temporária- não seria capaz de regenerar todo o sistema sanguíneo. A influencia do endoderma ligado ao gene ihh(indian hedgehog) faz com que o mesoderma se diferencie na célula tronco hemetologica inicial. 
-hematopoiese definitiva- Aorto mesonefro- dia 27, embrião dobrando, as células do mesoderma migram para a região do aorto mesonefro e formam a aorta. Na porção dorsal da aorta ventral começa a haver uma multiplicação de células, das que migraram do mesoderma, formam um aglomerado de células endoteliais, o endotélio hemogênico. Hematopoiese definitiva- essa célula tronco hematopoiética, se transfundida em uma animal letalmente irradiado, ela consegue formar todas as células do tecido sanguíneo e sustentar a hematopoiese.
Em seguida, as células saem dessa região, colonizam fígado, baço, timo e, por ultimo, medula óssea.
Recentemente foram identificadas algumas células tronco em placenta, mas não se sabe ao certo a origem.
Na infância a medula óssea vermelha está presente em todos os ossos do corpo. Com o crescimento (a partir dos 5-7 anos a medula óssea vermelha passa a ser substituída por medula óssea amarela e a medula óssea vermelha permanece em alguns locais específicos OSSOS DA COLUNA, OSSOS CHATOS DA BACIA, ESTERNO E EPÍFISE DOS OSSOS LONGOS)	
Plaquetas baixas- verificar megacariócitos
-baixas produção- megacariócito baixo
-alto gasto na periferia- megacariocito alto, estressado
Talassemia- doença hereditária, mal formação de hemoglobina- medula óssea aumenta a profução de células, cresce muito e gera deformidades ósseas. Forma reacional
Neofibrose- fibrose na medula óssea. Órgãos que produziam sangue no período fetal podem voltar a produzir (grandes esflenomegalias)- hematopoiese extra-medular. Circulação de células imaturas.
Biopsia- melhor observação da celularidade/ quantidade de células ou células raras. Crista ilíaca posterior- linfoma. Retira um pedaço do osso
Mielograma/aspirado- vê melhor a morfologia- esterno/ crista ilíaca/ (crianças- região anterior da tíbia). Leucemia, mieloma múltiplo doenças com diagnósticos mais evidentes. Só aspira. 
40 anos – 60% celularidade e 40% de gordura
Leucemia aguda- hipercelular- crescimento desordenado
Grumo na lamina- não é leucemia- pode ser plasia
LLA- leucemia linfoblástica aguda
- Hematopoiese- processo de formação das células sanguíneas
>eritropoiese- cels vermellhas
>trombocitopoiese- plaquetas
>Granulócitopoiese- granulócitos
>monocitopoiese- monócitos
Células tronco hematopoiéticas- ## de longos períodos, auto-renovação(diminui depois de um tempo), diferenciação.
Célula tronco mais primitiva tem cd34 na superfície, marcador para identificar a célula. A medida que a célula tronco se diferencia, ela perde o cd34 e ganha cd38. No rato é ao contrario.
Tipos de cels tronco
-long turn- longa renovação ( importante que haja em maior quantidade em uma coleta em caso de transplante para sustentar a hematopoiese)- capaz de repovoar a medula óssea. (possui elevado nível de cd34+)
-short turn- curta renovação- não sustenta a hematopoiese, se multiplica pouco e morre. 
-multipotente- 
Elas se diferenciam no progenitor linfoide comum e progenitor mieloide comum, que dão a série lifoide retino linfócito B, na série mieloide divide, um braço origina a megacariocitica eritroide e o outro vai originar a granulomonocítica. (coisas a serem vistas melhor ao longo do semestre)
Imunofenotipagem com ciclometria de fluxo- anticorpo monoclonal anti- cd34- quantifica a cd34 no sangue por ml, dps se multiplica pelo volume total da bolsa . Anticorpo provoca luminosidade, o que identifica a cd34. Processo muito utilizado para identificar enzimas e diagnosticar doenças
Fontes de células tronco
-sangue perifeirico- maior quantidade (maquina de aferes seleciona as células de interesse, puxa por uma via, separa por densidade, devolve as que não são de interesse)- sangue coletado com mais linfócito- No caso de doença maligna, é mais interessante, pois a quantidade de linfócitos ajuda a combater a doença no hospedeiro. 
-Medula óssea- No caso de uma doença congênita(benigna), é mais viável (menor quantidade de linfócitos.
Necessitam de elevada compatibilidade (9/10 ou 10/10)
-cordão umbilical- pouca quantidade de células, pode ser usado para crianças. Pode ter mais incompatibilidades (##) (3/10 ou 4/10)
Condicionamento- Regimes que soltam a célula tronco do nicho (quimio/ radio)
Mobilização- movimento da célula troncoo para a periferia
Holming- capacidade da medula óssea de voltar para a medula ossea ao ser injetada no sangue periférico
Enchertia (pega)- Quando a medula transfundida começa a produzir células sanguineas em quantidades necessarias 
Holming fisiológico- célula tronco sai do aorto-mesonefro e busca locais para povoar
Experimental- 
Transplante de medula óssea- 
Steady stage egress- saída e entrada de células tronco para compensar certas situações no organismo- reparação de tecidos, etc(falta ou excesso de determinadas células) . exemplo: soltar celulas tronco para formar neutrófilos. (função normal) 
Recrutamento induzido por stress- processo de trafego bidirecional de células tronco em resposta ao stress. steed stage movido por infecção. Ansiedade, sangramento, inflamação, lesão dano tecidual etc –resposta ao stress (infecção). Situação de stress: Fatores de crescimento (granuloquines) são produzidos no organismo ou administrados medicamentosamenteem resposta ao aumento de determinadas células sanguíneas. Ex: se a concentração de grânulos aumenta, os fatores de crescimento vão mobilizar as células tronco para produzir mais neutrófilos. 
Nicho (holming)-
A célula tronco tem cxcr4 em sua superfície- 
No nicho- aumento de sdf1
- a célula tronco tende a ir em direção ao gradiente maior de sdf1 ( estroma da medula óssea, regiões formadas por endotélio, osteoblasto, células reticulares, célula nest positiva
Endósteo- nicho da célula tronco
Barreira hemato-medular- 
célula tronco atravessa a barreira hemato-medular em direção ao nicho. Na célula epitelial da barreira há o receptor de cxcr4 e cxcr7 (presentes na membrana da célula tronco), que consegue devolver sdf1 do sangue periférico à medula óssea. A barreira hemato-medular faz gradiente de sdf1 dentro da medula óssea, que atrai célula que expressa cxcr4 para o interior do nicho. A passagem se faz por meio de moléculas de adesão, que se ligam à barreira endotelial e passa em direção ao gradiente. 
Ao fazer esse caminho para se fixar cxcr4 se liga ao stf1 que está no estroma, nas células endoteliais, nos osteoblastos, nas células reticulares. O cd44 se liga ao acido hialuronico e na osteostatina e caminham para chegar ao nicho. O cd49 não foi identificado no receptor, mas ajuda no processo.
Sdf1 expressa mais cd9 que também ajuda nessa caminho em direção ao endósteo. Se o sdf1 for diminuído dentro do endósteo (ocorre, por exemplo, dps do condicionamento) a célula tronco passa a secretar metaloproteinases, proteínas que degradam as amarras (matriz celular quee prende a célula tronco no interior do nicho) que a prendem no endóstio e a célula passa a ter uma tendência a se soltar. Se há um aumento de sdf1 na célula ocorro o oposto, a célula entra em quiescencia e fica presa no interior da medula óssea. Alem disso há um sensor de cálcio na célula tronco que atrai ela para onde tem mais cálcio (endóstio), sensor de oxigênio que atrai a célula tronco para onde tem menos oxigenio, e esfingolipides (s1p, até mais atrator que o sdf1, ou c1p), aparecem em situações de stress/ degradação. 
Condicionamento- quimio/radio > solta as células do nicho> aumenta os nichos disponíveis> aumenta a produção do sdf1, que acaba sendo jogado para fora (ativação de metaloproteinases pelo estado de stress quebra o sdf1 dentro do endosteo) e com o passar do tempo ocorre a degradação, tudo isso favorece que a célula tronco saia da medula óssea e vá para o sangue periférico.
Seletinas e integrinas ajudam na adesão/migração
 Nicho da célula tronco- endosteo, que possui osteoblstos e osteoclastos, terminações nervosas, tecido de gordura, célula mesenqquimal, célula reticular, vasos e a célula tronco presa. Objetivo: proteger a célula tronco para que ela se multiplique e prolifere quando requisitada. Baixo oxigenio (proteger a célula tronco da atuação de radiais livres). 
Nesting+ _ célula mesenquimal tem a capacidade de se diferenciar em apitocito, condródito e osteoblasto. Recebe inervação do sistema nervosos simpático, via receptores beta2 (importância para o stress) e beta3 (resposta em um ritmo circadiano). Estão próximas às células tronco. Tem moléculas de adesão como os osteoblastos, usa amarras para manter a células tronco presas nessa região. Existem macrófagos que sustentam células nesting e osteoblastos. A célula tronco é solta de acordo com o ritmo circadiano, via receptor beta3 e no momento de stress, via receptor beta2. Quando há granuloquine(fator de crescimento), que causa regressão dos macrófagos que sustentavam o nicho ou age no sitema nervoso estimulando beta2, redução das amarras. Células nesting suprimem os genes, a célula tronco se solta para o sangue periférico. 
 Sistema nervoso simpático- (ritmo circadiano)- escuro, o sistema nervoso simpático, por meio do receptor beta3, reduz sdf1 na medula óssea, mobiliza células tronco. Transplante ée mais bem sucedido à noite (melhor coleta de células tronco). Maior células tronco no sangue periférico- Mecanismos de reparo, compensação de infecção . Em resposta ao stress (adrenalina) receptor beta2, aumento rápido do sdf1 na medula e direciona para fora da medula ossea, o que inverte o fluxo. Sdf1 para fora da medula óssea- inibe osteoblasto, células reticulares, células mesenquimais (todas que estavam na medula); estimula células mieloides e a célula tronco a secretar metaloproteinases, o que faz com que a célula tronco se solte do nicho. Em situações de stress as células tronco se soltam do nicho para reagir contra infecção, sangramento etc. 
Cxcl12= sdf1
O osso Também deve soltar a célula tronco- osteoblastos possuem amarras para manter célula tronco: 
 
Osteoblasto
- manter a célula tronco na medula óssea quiescente (principalmente ao ligar as duas vias Ang e ppo)
-autorrenovação dentro da medula óssea
Se o pth é capaz de aumentar os osteoblastos é possível aumentar o numero de células tronco na medula óssea (mais células capazes de se ligar com as células tronco que se vai injetar)
-osteoblastos são capazes de aumentar fatores de crescimento- aumenta células tronco e aumenta o nicho. Ao mesmo tempo o pth faz com que o osteeoblasto espresse rang l e rang csf (fator estimulador de macrófago), fazendo com que a célula tronco hematopoiética sse diferencie em osteoclasto. Equilíbrio entre o osteoblasto (retém célula tronco), que produz o osso, e o osteoclasto que destrói e, ao destruir, inibe as conexinas, conexões da medula óssea degradando sdf1 e estimulando a saída da célula tronco. Proliferação de osteoblasto é transitória. 
-célula mesenquimal se diferencia em osteoblasto
-célula tronco da medula óssea se diferencia em osteoclasto 
Osteoblasto- mais locais para a célula tronco se ligar, Tb produz GCSF e outros fatores de crescimento. 
Outro mecanismo de formar osteoclasto- célula tronco se diferencia por causa do ## expresso pelo pth.
Macrófagos – pode ser liberado pelas células normais em resposta ao stress, ao ´perder os macrófagos perde-se os sinais que sustentam osteoblasto e nesting (amarras q prendem as células tronco) sem as amarras a 
Lipoatrofia- medulas com mais lipoatrofia estavam associadas a melhor recuperação medular. Quanto mais gordura, pior a célula tronco (idoso). “bolinhas nos grumos”
Célula reticular (célula K)- rica em cxcl12 (sdf1), atrai e amarra a célula tronco. A destruição dessa célula prejudica a retensão
Hipoxia- célula tronco tem sensores de oxigênio que a fazem tender a ficar o mais loge possível do oxigênio para evitar o contato com radicais livres que podem destruir o material genético. Rede de hipoxia> aumento da hif1 alfa, que aumenta o sdf1 e aumenta o homing da célula tronco. Também contribui para o aumento do igf e angiogenese para ajudar na formação do osso e do aporte vascular. 
Gradientes químicos- sdf1, cálcio, esfingolipides (S1p e c1p)- funcionam MT parecido com o cxcl12, resposta de stress inverte a migração de c1p para a periferia e faz com que a célula tronco se mobilize para a periferia.
Cd26 degrada o sdf1, inibição do cd26, aumento de sdf1, melhora no homing de células tronco para a medula óssea. 
Radioterapia consegue romper a barreira do endotélio e facilitar q a célula tronco atravesse, torna o nicho mais receptivo (destruição da medula óssea). 
Celula sem cxcr4 – célula não consegue entrar na medula óssea. 
QUimio/radio- induz varia células a liberar metaloproteinases (enzimas). Isso destrói a barreita hematomedular e o sdf1 que estava lá dentro, com isso a célula tronco tende a sair da medula óssea. A própria célula tronco também pode secretar metaloproteinase, rompendo as amarras e destruindo a matriz óssea. CD26 tende a degradar sdf1. Todo esse ambente rompe as amarras, rompe a matriz e a célula sai de dentro da medula óssea. Isso tudo acontece com resposta a stress, quimio e radioterapia.
-Fatores de stress ou fatores farmacológicos vão afetar a regulação intrínseca e extrínseca do nicho. 
-Célula parada no nicho- quiescência
-Celula solta em pequenas quantidadespara se multiplicar (osteoblasto) – se autorrenova, 
-estimulo a diferenciação- mobilizar célula tronco para atuar em caso, por exemplo de infecção
Mecanismos intrínsecos (exemplificados nos slides)
Mecanismos genéticos influenciam se ela vai para a auto-regulaçao ou para a diferenciação. 
Se um gene deleta as células de supressão do ciclo celular, há um aumento das céelulas de long turn. Varias leucemias ou linfomas tem defeito na p53, células perdem o poder de parar de se multiplicar (formam clones e se multiplicam sem parar)
*(importante): ligação do gene GATA faz com que a célula se diferencie para formar o progenitor eritroide megacariocítico. Ligação do gene PU 1 promove a diferenciação para o progenitor granulo monocitico. Se não é ligada nenhuma dessas duas coisas, a célula tronco fica quiescente no nicho. Existem também mecanismos epigenéticos: metilação e desmetilação do DNA, que também podem influenciar o inicio ou não da auto-renovação.
Agentes desmetilantes : azacetabina, decetabina
-Aplicável farmacologicamente (ligar e desligar genes por mecanismos de metilação)
Micro RNAs (estabilizam a ponta do DNA)- desviar para auto-renovação ou para a diferenciação.
Vias extrínsecas: 
Bcr2- gene antiapoptótico, quando multado a célula não consegue morrer (presente em vários tumores/ linfomas)
Em alguns casos a quimioterapia é muito toxica e não consegue desligar a célula tronco da medula óssea. É utilizado prelipsarcor, antagonista da ligação cxcr4 com sdf1, com o granuloquine (mobilização mais rápida) 
- aumeentar o pull de celulas ósseas receptor de pth que estimula essas ligações, Tb secreta 
fator de crescimento.