Escherichia coli enteropatogênica

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1. INTRODUÇÃO: 
 
1.1. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC): 
 
Escherichia coli são bactérias Gram negativas, anaeróbicas facultativas, que 
fazem parte da flora intestinal normal humana, e são importantes na manutenção da 
fisiologia intestinal. Essas bactérias foram consideradas inofensivas durante muitos 
anos. Contudo, cepas de E. coli causadoras de diarréia, tanto em humanos e 
animais domésticos como boi (Fischer et al., 1994), ovelha (Cid et al., 2001), coelho 
(Robins-Browne et al., 1994), cachorro (Turk et al., 1998) e porcos (Zhu et al., 1994), 
foram descritas entre as décadas de 40 e 50 (Nataro e Kaper, 1998). 
Inicialmente, todas as cepas de E. coli que induzem diarréia foram nomeadas 
como E. coli enteropatogênicas (EPEC). Estudos posteriores permitiram que as E. 
coli enteropatogênicas fossem classificadas em diferentes grupos de acordo com 
seus mecanismos de infecção e fatores de virulência produzidos (Kaper, 1994). Os 
fatores de virulência são proteínas de adesão, de invasão, e proteínas tóxicas que 
caracterizam diversas manifestações clínicas, que vão desde diarréias coleriformes 
e colites agudas até disenteria e morte (Nataro e Kaper, 1998; Chen e Frankel, 
2004). 
Existem hoje seis principais classes de E. coli patogênicas: as 
enteropatogênicas (EPEC), as enterohemorrágicas (EHEC), as enterotoxigênicas, 
(ETEC), as enteroagregativas (EAEC), as enteroinvasivas (EIEC) e as que aderem 
difusamente (DAEC) (Tabela 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2 
 
TABELA 1: Comparação entre E. coli enteropatogênicas 
E. coli Mecanismos de infecção Fatores de Virulência 
EPEC Lesão de Adesão e 
desvanecimento do enterócito 
(A/E) Attaching/ Effacing. 
BfpA (EAF+), EspB, 
EspD, EspA, intimina e 
Tir, dentre outros. 
EHEC Lesão de Adesão e 
desvanecimento do enterócito 
(A/E) Attaching/ Effacing. Além 
de hemorragia e edema da 
lâmina própria causada pela 
liberação de citotoxina. 
Toxina shiga símile/ 
Verocitotoxina (Stx). 
ETEC Colonização da superfície da 
mucosa intestinal e liberação de 
enterotoxinas. 
Toxina Termo estavél 
(ST), Toxina Termo 
lábel (LT). 
EAEC Aderência inicial na mucosa 
intestinal, produção de muco e 
de citotoxina. 
 Enterotoxina estável 
enteroagregativa 
(EAST1) 
EIEC Invasão epitelial, rompimento do 
vacúolo endocítico, 
multiplicação intracelular, 
movimento direcional pelo 
citoplasma, invasão de células 
epiteliais adjacentes. 
Plasmídio que codifica 
genes de invasão. 
DAEC Aderência difusa na membrana 
epitelial, elongação das 
microvilosidades, sem alteração 
no citoplasma. 
Hemolisina α, Fator 1 
de citotoxicidade 
necrosante (CNF1). 
 Adaptada de Nataro e Kaper,1998. 
 
 
 
 
 3 
 
O termo “EPEC” deve ser empregado para espécies de Escherichia coli 
diarreicogênicas que não produzem nenhuma enterotoxina, mas que causam a 
lesão histopatológica característica determinada pela ligação íntima e 
desvanecimento das microvilosidades dos enterócitos (Attaching and Effacing - A/E) 
(Nataro e Kaper, 1998) lesão essa que leva a uma pronunciada disfunção na 
absorção intestinal. 
 As EPEC foram responsáveis por surtos de diarréia aguda infantil nas décadas 
de 40 e 50 nos países desenvolvidos. Hoje, são a principal causa de diarréia 
bacteriana infantil, nos países em desenvolvimento ou em áreas de saneamento 
precário, perdendo apenas para o rotavírus em número de pacientes internados 
(WHO, 2000). Estudos no Brasil, México, África do Sul e Bangladesh mostraram que 
30-40% dos casos de diarréia bacteriana infantil são devido à infecção por EPEC, 
sendo a doença responsável por altas taxas de mortalidade. Cerca de 1.000.000 de 
crianças-caso/ano (Baldwin, 1998) no mundo e 200.000 somente no Brasil (Gomes 
et al., 1991). 
Os principais sintomas da doença causada por EPEC são diarréia aquosa, em 
vários graus de intensidade, e desidratação. O quadro clínico pode se agravar 
rapidamente pela dificuldade na eliminação da bactéria podendo implicar em 
infecção do trato urinário e meningite (Chen e Frankel, 2004). Outro fator que pode 
contribuir para o agravamento da doença é a falta de um método diagnóstico 
diferencial rápido, o que dificulta a detecção, e conseqüentemente, o tratamento 
precoce (Vallance e Finlay, 2000). 
 A diarréia causada por EPEC acomete, freqüentemente, neonatos nas áreas 
endêmicas, devido à falta de uma resposta imune adquirida. Os principais fatores de 
risco são a ausência do aleitamento ao seio materno, o baixo peso ao nascer, 
desnutrição nos primeiros meses de vida, e a residência em áreas de saneamento 
precário. Este último sugere que a água utilizada para preparação dos alimentos 
seja a principal fonte de contaminação (Fernandes e Medina-Acosta, 2002; 
Fernandes e Medina-Acosta, 2004). 
Nos países em desenvolvimento a profilaxia para bactéria enteropatogênicas é 
dependente de programas de tratamento de água e esgoto, uma vez que a 
transmissão é oro-fecal. E os métodos, em geral, utilizados para detecção dessas 
 4 
bactérias, têm duração de aproximadamente 48h, tempo suficiente para o 
estabelecimento do processo típico de adesão e destruição das microvilosidades do 
epitélio intestinal. Esse processo leva a diarréia e a quadros de forte desidratação, 
podendo levar uma criança à morte (Flores, 2001). 
Há, então, grande necessidade da produção de imunoprofiláticos e métodos 
diagnósticos rápidos contra as bactérias enteropatogênicas, tanto para população 
infantil dos países em desenvolvimento, quanto para migrantes ou turistas vindos de 
países industrializados. Os últimos são alvo fácil para infecção com enterobactérias 
patogênicas, uma vez que têm baixo nível de imunidade adquirida, devido à baixa 
incidência da doença em seus países de origem. 
 
1.2. Mecanismo de infecção e Fatores de virulência 
 
 Alguns trabalhos propõem que a patogênese de EPEC ocorre em quatro 
fases distintas (Knutton et al., 1998; Donnenberg e Kaper, 1992), contudo esse 
modelo é artificial e controverso. No primeiro estágio, em condições propícias, EPEC 
expressa em sua superfície as adesinas BfpA (Subunidade A dos pili formadores de 
feixe de EPEC), a adesina intimina e filamentos curtos de EspA (Proteína A 
secretada de EPEC). No segundo estágio, as células bacterianas se aderem ao 
epitélio intestinal através dos filamentos de BfpA e EspA, e o sistema de secreção 
do tipo III transloca Tir (receptor translocado de intimina) e outras proteínas efetoras 
para o citoplasma das células hospedeiras. As proteínas efetoras ativam vias de 
sinalização que levam a alteração do citoesqueleto e perda das microvilosidades 
locais. No terceiro estágio, os filamentos de EspA são perdidos da superfície 
bacteriana, a intimina se liga ao Tir resultando na ligação íntima, com acúmulo de 
actina na interface com a bactéria. Na última fase, ocorre a formação do pedestal 
típico da lesão de adesão e desvanecimento (A/E) causada pela grande quantidade 
de elementos do citoesqueleto no local da adesão por EPEC. Ao final, esse 
processo leva a perda eletrolítica e eventual morte celular (Clarke et al., 2003) 
(Figura 1). 
 
 
 
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FIGURA 1: Modelo de 4 estágios da patogênese de EPEC. Adaptada de 
(Clarke et al., 2003). 
 
Feixe de BfpA Intimina Filamento de EspA 
 
EspB e EspD Actina Tir 
 
EspF 
 
 
 
 
 
 
EPEC
EPEC
EPEC
EPEC
A B C D
EPEC
EPEC
EPEC
EPEC
A B C DMicrovilos 
Enterócitos 
1º 2º 3º 4º 
 6 
 
1.2.1. Adesão inicial 
O processo de adesão inicial da bactéria à célula hospedeira é mediado pelo 
feixe de pili, formado pela proteína BfpA como demonstrado em experimentos de 
infecção in vitro por Hicks et al. (1998) e Cleary et al. (2004). Os genes responsáveis 
pela biogênese dos pili de proteína A encontram-se em um megaplasmídio 
denominado Fator de Aderência de EPEC (EAF) (Nataro e Kaper, 1998). O feixe de 
pili é utilizado pela bactéria na formação de micro-colônias, fenótipo de adesão típico 
de EPEC denominada Aderência localizada (LA”Localized Adherence”) (Figura 2) 
(Nataro e Kaper, 1998; Rodrigues et al., 2004). Algumas cepas de EPEC, 
denominadas atípicas, perdem esse plasmídio, aderem-se difusamente ao epitélio 
intestinal e exibem menor virulência e patogenicidade, sendo este fenótipo de 
adesão atípico de EPEC denominada aderência difusa (Figura 3) (Nataro e Kaper 
1998). 
 
 
FIGURA 2: Aderência localizada de EPEC. 
Fenótipo típico de EPEC em cultura de células epiteliais (Reproduzido com 
permissão do Dr. Brett Finlay, University of British Columbia, Canadá, e do Dr. 
Michael Donnenberg, Universidade de Maryland, EUA). 
 
 
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FIGURA 3: Aderência Difusa de EPEC 
Fenótipo atípico de EPEC em cultura de células epiteliais (Reproduzido com 
permissão do Dr. Brett Finlay, University of British Columbia, Canadá, e do Dr. 
Michael Donnenberg, Universidade de Maryland, EUA). 
 
1.2.2. Ilha de patogenicidade: Lócus de Desvanecimento do Enterócito (LEE) 
 
A capacidade da EPEC de causar a lesão A/E é dependente da ativação de 
genes que codificam a síntese dos fatores de virulência de EPEC. Estes estão 
localizados no lócus cromossômico LEE (Locus of Enterocyte Effacement) chamado 
de Ilha de patogenicidade (PAI - pathogenicity island). Possui 34 Kpb e está dividido 
em cinco operons policistrônicos denominados, em ordem, LEE 1, LEE 2, LEE 3, 
LEE 5 e LEE 4 (Cleary et al., 2004). 
Os genes que codificam um sistema de secreção do tipo III estão no LEE 1, 2, 
3; eae, que codifica a adesina intimina, e tir, que codifica o receptor translocado de 
intimina, estão no LEE 5; espA, espB e espD, que codificam proteínas secretadas 
através do sistema de secreção do tipo III,estão no LEE 4; e o gene que codifica o 
regulador ler, que ativa transcrição do LEE 1, 2, 3, 4 e 5, está no LEE 1 (Elliot et al., 
1998). 
A região LEE está presente em EPEC e EHEC com alto grau de homologia, 
mas não está presente em cepas de E. coli da flora normal, E. coli K-12, ou ETEC. 
Seqüências homólogas ao LEE também são encontradas em outras bactérias 
enteropatogênicas que causam o fenótipo A/E (Adesão e desvanecimento), 
incluindo, REDEC-1 (EPEC de coelho), Hafnia. alvei diarreicogênica e Citrobacter 
rodentium (Elliot et al., 1998, Künhe et al., 2004). 
 8 
Mutações em algum dos fatores bacterianos codificados por LEE previnem a 
formação da lesão A/E em culturas de células epiteliais, tais como mutantes para 
eae, tir ou espA (Cleary et al., 2004). Atualmente, essas mutações tem sido alvo 
para o desenvolvimento de vacinas para EPEC, como aqueles mutantes para o 
regulador Ler (Zhu et al., 2005) e para eae (Stakenborg et al., 2006). Estes já foram 
utilizados como vacinas em coelhos, e mostraram ser imunogênicos e protetores em 
testes de desafio com dose letal de EPEC selvagem. 
 
1.2.3. Sistema de secreção do tipo III (TTSS) 
 
O sistema de secreção do tipo III (TTSS) está associado com a virulência de 
muitas bactérias Gram negativas que infectam humanos, animais, insetos e plantas. 
Sua organização e composição são bastante conservadas (Hueck, 1998), como, por 
exemplo, entre a Shigella (Sansonetti et al., 1986), Salmonella (Galan, 1996) e 
Yersinia (Rosqvist et al., 1990). Consiste em um corpo basal formado por um 
complexo multiprotéico que atravessa ambas membranas bacterianas, e uma 
estrutura tipo agulha, projetada para o exterior, que permite a liberação direta de 
proteínas efetoras no interior das células hospedeiras (Hueck 1998; Hartland et al., 
2000). Essa organela pode ser visualizada por microscopia eletrônica e é chamada 
de complexo agulha ou corpo basal (Sekiya et al., 2001, Ogino et al., 2006). As 
principais proteínas formadoras do corpo basal do TTSS em EPEC e EHEC são 
EscC, EscV e EscF. As EscC e EscV compõem as estruturas de anéis nas 
membranas bacteriana externa e interna, respectivamente (Gauthier et al., 2003) e a 
EscF, permanece ancorada na membrana bacteriana através dos anéis interno e 
externo (Figura 4) (Sekiya et al.,2001; Ogino et al., 2006). 
 O TTSS de EPEC e EHEC é o único que possui a extensão de um filamento 
para formar o ‘complexo agulha’ (Knutton et al., 1998). A proteína translocada EspA 
é a única constituinte desse filamento condutor que liga diretamente a bactéria à 
célula hospedeira (Knutton et al., 1998; Hartland et al., 2000; Daniell et al., 2003); 
Ogino et al., 2006). Cepas mutantes para EscF não são capazes de expressar EspA 
e formar a agulha do TTSS, enquanto que mutantes para EspA não são capazes de 
expressar EscF e formar o corpo basal do TTSS, mostrando assim que essas 
proteínas podem afetar a forma e a estabilidade do complexo (Sekiya et al.,2001). 
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Os filamentos de EspA são essenciais para translocar para a célula hospedeira as 
proteínas EspD (Proteína D Secretada de EPEC), e EspB (Proteína B Secretada de 
EPEC), que participam na formação de poros na membrana do enterócito (Knutton 
et al., 1998; Hartland et al., 2000; Vallance e Finlay, 2000). Os poros servem de 
passagem das proteínas efetoras para a célula hospedeira, como o receptor 
translocado de intimina, Tir, envolvido na ligação íntima e transdução de sinal, à 
proteína associada a mitocôndra, Map, que interfere no potencial de membrana da 
mitocôndria; a proteína F secretada de EPEC, EspF, requerida para ruptura das 
junções célula-célula e na morte celular programada; a proteína G secretada de 
EPEC, EspG, envolvida na desestabilização dos microtúbulos; e proteína H 
secretada de EPEC, EspH envolvida na modulação dos filamentos de actina para a 
formação do pedestal (Garmendia et al., 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10 
Membrana da célula hospedeira
ME
MI
EspA
Filamento de 
EspA
AE
AI
EscF
Tir, EspB, EspD
EscN
PP
EspB, EspD
Membrana da célula hospedeira
ME
MI
EspA
Filamento de 
EspA
AE
AI
EscF
Tir, EspB, EspD
EscN
PP
Membrana da célula hospedeira
ME
MI
EspA
Filamento de 
EspA
AE
AI
EscF
Tir, EspB, EspD
EscN
PP
EspB, EspD
 
FIGURA 4: Modelo Esquemático do sistema de secreção do tipo III de EPEC 
Primeiro os anéis interno e externo são formados, e em seguida EscF é polimerizada 
através dos anéis. EspA é secretada e ligada no topo do complexo agulha de onde 
inicia sua polimerização e formação da agulha desse complexo (filamento). Através 
dessa estrutura em forma de tubo as proteínas EspB, EspD e Tir são translocadas 
para a célula hospedeira, onde EspB e EspD formam poros para que Tir e outras 
proteínas efetoras cheguem ao citoplasma. ME: Membrana Externa, MI: Membrana 
Interna, PP: Periplasma, AE: Anel Externo da porção ancorada do sistema de 
secreção do tipo III de EPEC, AI: Anel Interno da porção ancorada do sistema de 
secreção do tipo III de EPEC. Adaptada de Sekiya et al. (2001). 
 
1.2.4. Aderência íntima 
 
Dentre as proteínas efetoras que a bactéria transloca através do TTSS para o 
citoplasma do enterócito, está a proteína Tir de 90 kDa. Esta insere-se na membrana 
servindo de receptor para a proteína intimina de 94 kDa, que está presente na 
membrana externabacteriana. A ligação Tir-intimina estabelece uma adesão íntima 
entre a bactéria e o enterócito, com conseqüente perda localizada das 
microvilosidade das células do epitélio intestinal. Com a translocação de proteínas 
efetoras para a célula hospedeira e a adesão íntima entre a bactéria e o enterócito, a 
bactéria torna-se capaz de modular algumas vias de sinalização na célula 
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hospedeira (Kenny et al., 1997). Dessa forma, EPEC pode iniciar a formação do 
pedestal e mediar seu efeito patogênico na célula hospedeira enquanto permanece 
na superfície extracelular. 
 
1.2.5. Transdução de sinal 
 
Ao se fixar na membrana da célula hospedeira a proteína Tir é fosforilada, 
ativando a via de sinalização da fosfolipase C (PLC), o que leva a formação de 
fosfatidil inositol (IP), aumento no fluxo de cálcio intracelular e ativação de proteína 
quinase C (PKC). Como conseqüência à sinalização intracelular, ocorre 
reorganização do citoesqueleto e formação de um pedestal na interface com a 
bactéria, caracterizando a típica lesão A/E (Moon et al., 1983; Dytoc et al., 1994; 
DeVinney et al., 1999; Campellone e Leong, 2003) (Figura 5). 
A lesão A/E causada pela infecção por EPEC provoca danos celulares que 
levam a diarréia. Estes são caracterizados pela perda da absortividade através das 
microvilosidades, pela redução das junções do tipo oclusão entre as células, pelo 
aumento da permeabilidade paracelular, com conseqüente perda de importantes 
eletrólitos como Cl- e HCO3-, e pelo processo inflamatório mediado pela infiltração 
de neutrófilos (Vallance e Finlay, 2000) (Figura 5). 
 
Dano 
tecidual
Recrutamento 
de Neutrófilos
Alteração de 
Cl- e HCO3-
Secreção iônica
Diarréia
Diminuição
Integridade
das junções
Tight
Perda da superfície 
de absorção
Diminuição
Da 
Resistência
H2O H2OCl
- Cl- EPEC
Dano 
tecidual
Recrutamento 
de Neutrófilos
Alteração de 
Cl- e HCO3-
Secreção iônica
Diarréia
Diminuição
Integridade
das junções
Tight
Perda da superfície 
de absorção
Diminuição
Da 
Resistência
H2O H2OCl
- Cl- EPEC
 
 
FIGURA 5: Esquema dos danos celulares que levam à diarréia na infecção por 
EPEC. Adaptado de Vallance e Finlay, 2000. 
 12 
1.3. A Proteína EspA 
 
Como mencionado anteriormente, os genes que codificam as proteínas 
secretadas encontram-se no lócus cromossômico LEE, que também inclui todos os 
outros componentes formadores do TTSS, além das proteínas efetoras. Dentre as 
proteínas secretadas codificadas por LEE está EspA, uma proteína de 
aproximadamente 25 kDa, que é a formadora da agulha do TTSS (Chen e Frankel, 
2004). 
Daniell e colaboradores (2003) mostraram, em experimentos de microscopia 
eletrônica dos filamentos de EspA, que a forma com que esses filamentos se 
organizam é muito semelhante ao arranjo da flagelina na formação do flagelo. 
Porém, eles diferem na região central, sugerindo que o filamento de EspA forme um 
canal central por onde as proteínas da bactéria são liberadas no citoplasma do 
enterócito. 
 A formação dos filamentos de EspA ocorre por adição de muitas subunidades 
de EspA no topo de crescimento do filamento, e as proteínas efetoras são 
translocadas através de um canal central do filamento de EspA como confirmado no 
trabalho de Crepin e colaboradores 2005. Além disso, mostraram que o aumento da 
concentração intracelular das subunidades de EspA resulta em filamentos mais 
longos, sugerindo que a quantidade de EspA produzida pela bactéria constitui um 
fator limitante para definir o comprimento do filamento. 
A secreção de muitas proteínas do TTSS é regulada pela presença de 
chaperoninas citoplasmáticas. Creasey e colaboradores (2003) identificaram uma 
interação entre EspA e EspB com uma proteína citoplasmática que, além de impedir 
a formação de agregados de EspA intracelulares, mostrou regular a expressão, o 
nível de transcrição e a secreção da EspA, sendo chamada de chaperoninas CesAB. 
 Em termos funcionais o TTSS é chamado de injectiossomo, uma organela 
especializada na translocação, para o interior do enterócito, de proteínas efetoras 
que são necessárias para que ocorra a adesão íntima, subversão, transdução de 
sinal e formação da lesão A/E (Kenny et al., 1997; Knutton et al., 1998) (Figura 6). 
 
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Membrana da célula do 
hospedeiro
Membrana bacteriana 
externa
Membrana bacteriana
interna 
Espaço Periplasmático
Membrana da célula do 
hospedeiro
Membrana bacteriana 
externa
Membrana bacteriana
interna 
Espaço Periplasmático
 
 
 
FIGURA 6: Esquema representando o aparato do sistema de secreção do tipo III de 
EPEC/EHEC. Estão representadas as proteínas que formam o sistema de secreção 
do tipo III e as proteínas que são translocadas. Em destaque a proteína EspA, a 
principal proteína que compõe o sistema de secreção do tipo III, formadora do 
filamento translocador que liga a bactéria à célula hospedeira. Adaptada de 
(Garmendia et al., 2005). 
 
Além de mediar a translocação de proteínas efetoras, os filamentos de EspA 
podem funcionar como adesinas, como demonstrado em estudos in vitro com 
células epiteliais, em que EPEC deficiente para os genes que codificam BfpA e 
intimina foram capazes de estabelecer adesão inicial através dos filamentos de 
EspA, porém, não tão eficientemente quanto a cepa selvagem. Os filamentos de 
EspA funcionaram como um tipo de adesina estabelecendo uma ligação transiente 
entre a bactéria e a célula hospedeira (Hartland et al., 2000; Cleary et al., 2004). 
Além disso, Moreira e colaboradores (2006) mostraram, em substratos abióticos, 
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que EspA e BfpA de EPEC estão envolvidas na formação de biofilme, o que pode 
justificar a alta resistência dessa bactéria a antibióticos. 
A grande importância e contribuição dos filamentos de EspA para a lesão A/E 
foram comprovados em estudos in vitro com cultura de CaCo-2 (modelo de células 
epiteliais) e cepa de EPEC deficiente para o gene espA, em que essa cepa foi 
incapaz de induzir a típica lesão A/E (Cleary et al., 2004). Resultados semelhantes 
foram obtidos por Abe e colaboradores em 1998, utilizando cepas de REPEC (EPEC 
de coelho) deficiente para espA na infecção experimental de coelhos. 
No entanto, utilizando microscopia de fluorescência e anticorpos policlonais 
anti-EspA marcados com diferentes fluorocromos, Knutton e colaboradores (1998) 
observaram que a expressão dos filamentos de EspA in vitro é transiente, 
demonstrando que, após o início da formação da lesão A/E, os filamentos de EspA 
vão diminuindo, gradualmente, até não serem mais detectados na lesão A/E 
madura. (Figura 7). Esses dados sugerem uma aplicação profilática importante para 
anticorpos anti –EspA. Embora, estes não previnam a formação dos filamentos de 
EspA, como descrito anteriormente (La Ragione et al., 2005), podem, de alguma 
forma, impedir a formação da lesão A/E, seja por inibição da função de 
‘ancoramento’ dos filamentos de EspA com a membrana da célula hospedeira, 
através da prevenção da interação de EspA com outras proteínas efetoras, ou por 
estabilizar os filamentos, prevenindo seu desarranjo, que é o pré-requisito para que 
ocorra a adesão íntima. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 15 
 
 
FIGURA 7: Foto micrografia de fluorescência. Anticorpos marcados em vermelho 
reconhecem actina, nas células epiteliais, e anticorpos marcados em verde 
reconhecem EspA, em EPEC, mostrando que a presença dos filamentos de EspA é 
transiente, barra = 5µm (Knutton et al., 1998). 
 
 
Os filamentos de EspA também são essenciais para desencadear a hemólise 
de células vermelhasdo sangue em experimentos in vitro, uma vez que EPEC 
mutantes para EspA não foram capazes de induzir a lise, assim como mutantes para 
EspD. Entretanto, mutantes para EspB ainda induziram fraca hemólise. Esse é um 
modelo de estudo simples que sugere a necessidade dos filamentos de EspA para 
desencadear a lesão A/E (Shaw et al., 2001), e mostra que, a formação dos 
filamentos de EspA é dependente de EspD, como confirmado por Crepin et al. 
(2005a). 
 Trabalhos de caracterização de EspA em diferentes sorotipos de EPEC 
mostraram a importância dessa proteína na patogênese de EPEC e o seu possível 
uso em diagnóstico e profilaxia, devido a alta similaridade entre as seqüências de 
aminoácidos das diferentes cepas de EPEC, e entre EPEC e EHEC (Neves et al., 
1998 e 2003). Análises comparativas (Tabela 2) das seqüências de aminoácidos da 
proteína EspA de EPEC de coelho (REPEC sorotipo O103:H2) com a de outras 
bactérias enteropatogênicas revelam alta similaridade da seqüência de aminoácidos 
entre diferentes cepas de E. coli eteropatogênicas e diferentes sorotipos de variados 
hospedeiros específicos. 
 
 16 
TABELA 2: Porcentagem de similaridade entre a seqüência de aminoácidos da 
proteína EspA de REPEC (0103:H2) com as diferentes E.coli enteropatogênicas 
 
E.coli Sorotipo Hospedeiro Similaridade 
Protéica % 
Nº de acesso 
REPEC “0103:H2” Coelho Af200363 
STEC “026:H” Bovino 100 AJ277443 
EPEC “0111:H2” Ovelha 99 AJ225018 
EPEC “0128:H2” Ovelha 99 AJ225021 
EPEC -- Cachorro 98 U65681 
EPEC -- Suíno 98 AF064683 
EHEC “0103:H2” Bovino 94 AJ303141 
EPEC “0127:H6 Humano 91 Z54352 
EHEC “0127:H7” Humano 91 AF022236 
EPEC “055:H7” Ovelha 90 AJ225220 
EPEC “055:H6” Ovelha 90 AJ225019 
BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, NIH, Bethesda, MD). 
(Análise feita para este trabalho). 
 
Estudos recentes mostraram que a proteína EspA de EPEC e EHEC de 
diferentes cepas possui a extremidade N e C terminal com alta similaridade, 
formando a região central do filamento, e uma região entre as extremidades que é 
hipervariável, exposta e imunodominante. Além disso, esse estudo mostrou que 
pequenos peptídeos, inseridos na região hipervariável, são apresentados na 
superfície do filamento de EspA e são acessíveis para anticorpos. Essa observação 
pode ter um considerável impacto para o futuro uso do filamento de EspA como 
‘peptide display’ (Crepin et al., 2005b). 
O polimorfismo encontrado na região central da EspA indica que há interações 
entre os filamentos de EspA e o sistema imune do hospedeiro, o que faz da EspA 
um possível alvo para o desenvolvimento de vacina (Crepin et al., 2005b). O estudo 
de La Ragione e colaboradores (2005) reforça essa idéia, uma vez que anticorpos 
policlonais anti-EspA demonstraram reconhecer todos fragmentos de EspA com 
exceção dos fragmentos correspondentes aos aminoácidos 129-171 e 150-192, 
 17 
onde o último compõe a região conservada do filamento, ou seja, a região não 
exposta. 
A proteína EspA demonstrou estimular a produção de IgG e IgA humanos, uma 
vez que anticorpos anti-EspA são detectados em soros de pacientes acometidos por 
EPEC (Martinez et al., 1999), e em colostros de mães que residem em regiões 
endêmicas para EPEC (Loureiro et al., 1998). Sendo assim, a detecção de 
anticorpos anti- EspA em pacientes abre a possibilidade de diagnóstico específico e 
profilaxia de pessoas acometidas por E. coli enteropatogênicas. Em nosso grupo de 
pesquisa, trabalhos buscando a caracterização e diagnóstico para EPEC já foram 
realizados, tanto utilizando BfpA recombinante com soro de pacientes e colostro das 
mães (Fernandes et al., 2002 a e b) quanto BfpA e EspB recombinante com 
coproanticorpos (Fernandes et al., 2003), em testes de Western blot. 
 
1.4. Resposta imune, vacinas e imunobiológicos contra E. coli 
enteropatogênicas 
 
 Para avaliar a resposta imune contra REPEC Ramirez e colaboradores (2005) 
infectaram coelhos com REPEC selvagem e com mutantes para intimina e EspA. 
Em geral, observaram um aumento da migração de leucócitos polimorfonuleares e a 
expressão de citocinas proinflamatórias como IL-6, IL-8, TNF-α sendo secretadas 
por linfócitos da Placa de Peyer e baço. Essas características indicam que a 
colonização por REPEC dirige a resposta imunológica para Th1. Durante a infecção 
com REPEC mutante para EspA, houve um aumento dos níveis de expressão das 
citocinas IL-8 e TNF-α, e fraco aumento de IL-10. 
Diversos trabalhos visam determinar a presença e a especificidade de 
anticorpos protetores contra proteínas essenciais para o estabelecimento da 
infecção por E. coli enteropatogênicas. A resposta imune contra EPEC e EHEC é 
detectada no leite de lactantes com a presença de altos níveis de anticorpos IgA 
contra as proteínas EspA, EspB, intimina (Loureiro et al., 1998; Noguera-Obenza et 
al., 2003) e BfpA (Loureiro et al., 1998; Fernandes et al., 2002b). Também foram 
detectados, no soro de crianças, altos níveis de anticorpos IgG anti-EspA, EspB, 
intimina (Martinez et al., 1999), BfpA (Fernandes et al., 2002a) e Tir (Li et al., 2000). 
Anticorpos anti-BfpA e anti-EspB também foram encontrados em fezes de crianças 
 18 
alimentadas naturalmente e artificialmente (Fernandes et al., 2003). Carbonare e 
colaboradores (2003) também analisaram anticorpos do soro e saliva de crianças 
residentes em área endêmica para EPEC e encontraram anticorpos reativos para as 
adesinas (BfpA e intimina) e para as proteínas secretadas de EPEC (EspA e EspB). 
Comprovada a imunogenicidade de diversas proteínas de EPEC e EHEC, o 
seu uso para produção de imunobiológicos tornou-se alvo de estudos para muitos 
pesquisadores. Em busca de um método diagnóstico rápido para E. coli 
enteropatogênicas, anticorpos anti-EspB foram produzidos e usados em testes de 
aglutinação reversa passiva em látex. Estes anticorpos foram capazes de detectar 
fatores de virulência tanto EPEC quanto EHEC (Lu et al., 2002). Com o mesmo 
objetivo, anticorpos policlonais e monoclonais recombinantes anti-EspA e intimina 
foram capazes de reconhecer essas proteínas de EHEC, em testes de Western blot 
( Kühne et al., 2004). Recentemente, La Ragione e colaboradores (2005), por meio 
de experimentos de fluorescência, demonstraram que anticorpos policlonais e 
monoclonais anti-EspA e intimina inibem a reorganização do citoesqueleto de 
células epiteliais HEp-2 induzida pela infecção por EHEC, e que anticorpos anti-
EspA da cepa EHEC O157:H7 interferem na reorganização de actina de 13 dos 21 
sorotipos de EPEC testados, mostrando que houve proteção cruzada. 
O uso de anticorpos IgY, produzidos na gema do ovo de galinhas 
hiperimunizadas, anti-intimina, Tir, EspA, EspB e EspD foi proposto por Girard e 
colaboradores (2006) como uma alternativa promissora na prevenção da lesão A/E 
causada por EPEC. Nesse estudo, IgY anti-EspA inibiu a aderência de EPEC 
humana em cultura de órgãos in vitro (IVOC). 
Uma outra abordagem que vem sedo explorada por alguns pesquisadores é o 
uso de proteínas recombinantes, ou mesmo E. coli enteropatogênicas mutantes, 
como vacinas. Potter e colaboradores (2004) utilizaram proteínas secretadas (Esps 
e Tir) para imunizarem bovinos. A resposta imune induzida foi suficiente para manter 
baixos níveis de bactérias nas fezes após o desafio com EHEC. A vacinação de 
coelhos com REPEC mutantes para o regulador (ler) do lócus LEE conferiu proteção 
aos coelhos após desafio com cepa selvagem de REPEC (Zhu et al., 2005). 
Resultados semelhantes foram descritos com EPEC mutante para EspB e Tir 
(Boullier et al., 2003). 
 19 
Recentemente, a proteção de coelhos contra REPEC 8+/0103 foi realizada 
com vacinação oral com EPEC mutante para intimina, porém, não foi eficiente para 
proteger totalmente os coelhos desafiados com REPEC de outros bio-sorogrupos 
(Stakenborg et al., 2006).2. Justificativa 
 
A proteína EspA, secretada por E. coli enteropatogênicas via sistema de 
secreção do tipo III, é a subunidade formadora do filamento que liga a bactéria à 
célula hospedeira. Ela permite a translocação de proteínas efetoras para o interior 
da célula hospedeira, desencadeando a adesão íntima, subversão, transdução de 
sinal e formação da lesão patognomônica de adesão e desvanecimento. Desta 
forma, a proteína EspA é de grande importância no estabelecimento da infecção. 
A EspA é considerada uma proteína imunogênica alvo de estudos de 
profilaxia experimental, podendo ser utilizada na produção de uma vacina protetora 
contra EPEC e EHEC de vários sorotipos, pois, a exposição natural a EPEC resulta 
em produção de IgG e IgA específicas prevalente em indivíduos nas áreas 
endêmicas. 
A produção de proteína EspA de EPEC, de forma recombinante, e de 
anticorpos anti-EspA oferecem algumas vantagens, pois a similaridade estrutural da 
EspA das diferentes E. coli enteropatogênicas e as altas freqüências de anticorpos 
anti–EspA, sugerem que uma proteção cruzada seria possível contra múltiplos 
sorotipos de maneira eficaz no bloqueio da formação da lesão A/E. Portanto, a 
produção de EspA de forma recombinante e de anticorpos anti-EspA recombinante 
abrem a possibilidade para o desenvolvimento de métodos diagnóstico mais rápidos, 
baratos e eficientes, além de sua aplicação em profilaxia e terapia. 
 
 
 
 
 
 
 20 
3. OBJETIVOS 
 
Clonar e expressar o gene espA de EPEC em sistema de expressão bacteriano 
pQE-30. 
 
Produzir e purificar proteína EspA recombinante. 
 
Produzir anticorpos policlonais anti- EspA recombinante em coelhos hiperimunes. 
 
Avaliar a antigenicidade da proteína EspA recombinante com IgG policlonais anti-
EspA produzidos em coelhos, e com IgG e IgA séricas de crianças assintomáticos 
de 0 a 2 anos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 21 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4.1. Estratégia metodológica 
 
A seqüência codificadora espA foi amplificada por meio da técnica de PCR 
utilizando iniciadores específicos desenhados para conter sítios das enzimas Bam HI 
e Hind III. A seqüência amplificada foi clonada no vetor de clonagem comercial 
pGEM-T-Easy®. A construção recombinante obtida, pGEM/espA, foi digerida com as 
enzimas de restrição Bam HI e Hind III, para obtenção do inserto relativo à 
seqüência espA com as extremidades compatíveis, para ligação com o vetor de 
expressão bacteriano pQE-30, também digerido com Bam HI e Hind III. Tanto o 
vetor como a seqüência espA foram purificados e ligados em condições e 
concentrações apropriadas. As construções recombinantes pQE-30/espA foram 
utilizadas para transformar E. coli M15 (pREP4). Após a seleção de clones contendo 
pQE-30/espA e pREP4, foi feita a indução da expressão da proteína EspA com 
IPTG. A proteína EspA foi purificada por coluna de afinidade Ni-NTA-Sepharose, 
utilizada na imunização de coelhos, e testada quanto sua antigenicidade. Anticorpos 
policlonais de coelhos imunizados foram analisados in vitro por ELISA e Western 
blot. A proteína EspA recombinante também foi utilizada em testes de captura 
(ELISA e Western blot) para IgG e IgA anti-EspA de crianças assintomáticas 
menores de 2 anos. Anticorpos anti-EspA foram utilizados em ensaios de inibição da 
hemólise por EPEC e REPEC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 8: Esquema representativo da Estratégia metodológica 
 
 
 
 
PCR 
espA 
+ 
VVeettoorr 
ppGGEEMM--TT 
eeaassyy 
 
pGEM/espA 
 
Bam HI Hind III 
pGEM/espA VVeettoorr ppGGEEMM--TT eeaassyy 
+ 
espA 
Hind III 
 
Bam HI 
Vetor pQE-30 VVeettoorr ppQQEE--3300 
ddiiggeerriiddoo 
+ 
Transformação 
pQE-30/espA 
 
E.coli M15 
Expressão 
Purificação 
NNii--NNTTAA--SSeepphhaarroossee HHiissEEssppAA 
IImmuunniizzaaççããoo ddee 
ccooeellhhooss 
AAnnttiiccoorrppooss 
-- EElliissaa 
-- BBlloott 
-- IInniibbiiççããoo 
ddaa hheemmóólliissee 
 23 
4.2. Material Biológico 
 
4.2.1. Células 
 
TABELA 3: Células utilizadas 
Célula Cepa Fonte 
Escherichia coli DH5-α Invintrogen 
Escherichia coli M15 Qiagen 
Escherichia coli Enteropatogênica 
humana (hEPEC) 
B171 Cedida por Wilmar Dias da 
Silva – LBR/UENF 
Escherichia coli Enteropatogênica 
de coelho (rEPEC) 
REPEC-1 Cedida por João Ramos 
Costa Barros - UERJ 
 
4.2.2 Coelhos 
 
Para o experimento de imunização com EspA recombinante foram utilizados 
dois coelhos albinos pesando 2Kg, obtidos de criador local. Todo o procedimento 
experimental foi realizado dentro dos padrões éticos e de acordo com as leis de 
proteção de animais de laboratório. 
 
4.2.3 Soro e anticorpos 
 
Amostras de sangue foram coletadas de 100 crianças, assintomáticas para 
diarréia, de 0 a 2 anos de idade, atendidas pela Drª Regina Célia de Souza Campos 
Fernandes no Centro da Criança e do Adolescente da cidade de Campos dos 
Goytacazes. O sangue foi coagulado a temperatura ambiente e separado por 
centrifugação a 12.000x g e o soro mantido a -20 ºC até o uso. Todo o procedimento 
foi realizado dentro dos padrões éticos e com o consentimento dos pais. 
Para obtenção do sangue dos coelhos foi feita a sangria total por um médico 
veterinário, o sangue foi coagulado a temperatura ambiente e separado por 
centrifugação a 12.000x g e o soro mantido a -20 ºC até o uso. 
Os anticorpos anti-His, anti-IgG e anti-IgA peroxidase foram adquiridos da 
Sigma-Aldrich, EUA e mantidos a -20 ºC até o uso. 
 24 
4.3. Amplificação da região codificadora espA 
 
O DNA de EPEC EAF + cepa B171 sorotipo O111:NM (Riley et al., 1990), 
extraído pelo método TENS (Solução Tris, EDTA, NaOH, SDS) (Sambrook, 1989) foi 
usado para amplificação da região codificadora da EspA. Foram utilizados 
iniciadores específicos desenhados de acordo com pesquisa de seqüências 
disponíveis no banco de seqüências do Genebank (número de acesso: AF200363) 
Forward 5 ’CGC CGC GGA TCC GCG ATG GAT ACA TCA ACT GCA ACA - 3’ e 
Reverse 5’ CGC CCC AAG CTT GGG TTA TTT ACC AAG GGA TAT TGC – 3’. As 
regiões sublinhadas correspondem aos sítios alvos para as enzimas de restrição 
Bam HI e Hind III, engenheiradas para facilitar a clonagem direcionada. O produto 
da amplificação esperado seria de 579 pb de acordo com pesquisa no banco de 
dados (nº acesso: AF200363). Para 50 µL da reação de PCR foram utilizados de 10-
20 ng de DNA molde, 25 pmol de cada iniciador, mistura de deoxinucleotídeos na 
concentração final de 0,2 mM (Biotools), e 1U da polimerase (Biotools) diluídos em 
tampão da própria enzima 1X concentrado (Biotools com 2mM MgCl2), outras 
concentrações de iniciadores, dNTPs e MgCl2 foram testadas até se chegar a 
25pmoles, 25mM, 2,5mM respectivamente que foram as concentrações ótimas. As 
condições de amplificação foram 95 ºC, 5 min (1 ciclo); 94 ºC, 1 min, 49 ºC, 2.5 min, 
72 ºC, 2.5 min (30 ciclos); 72 ºC, 15 min (1 ciclo). Ao final da PCR as amostras foram 
analisadas em gel de agarose contendo 0.8% de brometo de etídio. 
 
4.4. Purificação de fragmentos de DNA a partir de géis de agarose 
 
A região amplificada (espA) foi retirada do gel de Agarose 0,8%, tratado com 
brometo de etídio, com a utilização do Kit de extração de DNA Concert Rapid Gel 
Extraction System, (GIBCO BRL, Life Technologies). 
 
4.5. Preparação de células DH5-α e M15 (PREP4) competentes 
 
 
 
 
 
As células foram cultivadas em Erlenmeyer contendo 50 mL de meio LB (Luria 
Broth) até DO600nm= 0,5 - 0,7 e centrifugadas a 4 ºC a 2.060x g durante 5 min; o 
sobrenadante foi descartado e o pellet dissolvido em 25 mL de 50 mM CaCl2 gelado, 
 25 
misturado gentilmente, e colocado em gelo durante 20 min. Essa mistura foi 
centrifugada a 4 ºC a 2.060xg durante 5 min, o pellet dissolvido em 3,5 mL de 50 
mM/ 15% glicerol/ CaCl2. Foram feitas alíquotas de 100 µL, congeladas em 
nitrogênio líquido e estocados a -70 ºC. 
 
4.6. Clonagem da região codificadora espA e transformação de E.coli DH5-α 
 
O DNA referente ao amplicon purificado foi diretamente ligado, utilizando 0,1U 
T4 ligase® (Promega), ao vetor de clonagem pGEM-T Easy® (Promega). O produto 
da ligação foi utilizado para a transformação de E. coli da cepa DH5-α® (Invitrogen) 
pelo método de choque térmico (3 minutos 42 ºC, 15 minutos 0 ºC). Os 
transformantes foram selecionados em meio LB sólido contendo ampicilina (100 
µg/mL), 0,5 mM IPTG e X- Gal (80 µg/mL). Neste sistema as colônias transformadas 
com as construções positivas crescem com coloração branca, enquanto as 
negativas crescem com coloração azul. A coloração branca se dá quando o gene 
para a β-galactosidase é interrompido pelo inserto que possui o gene de interesse. A 
β-galactosidase expressa pela colônia cliva o substrato cromogênico X-Gal presente 
no meio de cultura. As colônias brancas foram selecionadas e crescidas em meio LB 
líquido por 16h contendo ampicilina (100 µg / mL). O DNA das bactérias foi extraído 
pelo método TENS e digerido com 0,1U da enzima Bam HI e Hind III® (Promega). O 
fragmento restrito de 579 pb liberado do vetor de 3015pb foi purificado a partir do gel 
utilizando Kit de extração de DNA (GIBCO BRL®). 
 
4.7. Análise dos clones por PCR 
 
A validação dos possíveis clones (pGEM-Teasy/espA) foi feita pela reação da 
PCR , nas condições descritas no item 4.5, utilizando o DNA extraídos das colônias 
brancas. As amostras positivas foram selecionadas e utilizadas para obtenção do 
fragmento para clonagem no vetor de expressão. Os clones positivos foram 
chamados de pLUA-04(1, 2, 4, 8 e 10). 
 
 
 
 26 
4.8. Subclonagem da região codificadora espA no vetor de expressão pQE-
30 
 
O amplicon espA purificado, de 579 pb, foi ligado ao vetor de expressão pQE-
30 ® (Qiagen) linearizado com Bam HI ® (Promega) e Hind III® (Promega).A 
quantificação desses DNA foi feita em visualização eletroforética comparativa com 
marcador de DNA ג hind. O vetor pQE-30 possui o gene bla que confere resistência 
ao β-lactâmico ampicilina. A ligação foi feita nas proporções 1:1 e 1:3 vetor: inserto, 
utilizando 0,1U de enzima ligase (®Promega, EUA) em tampão próprio da ligase, 1X 
concentrado, contendo ATP. O volume da reação foi de 20 µL e a incubação a 16 ºC 
por 16h. As E. coli competentes, cepa M15 (pREP4), foram transformadas, por 
choque térmico, com a construção originada da ligação da região codificante 
amplificada com o vetor de expressão (Sambrook, 1989). O plasmídio pREP4 
contém o gene nptll que confere resistência ao antibiótico canamicina, e contém o 
gene lac Iq, que codifica um repressor da expressão do operador lac, presente no 
vetor de expressão pQE-30® (Qiagen). Bactérias co-tranformadas com o vetor de 
expressão recombinante e pREP4 foram selecionadas em meio LB contendo 
ampicilina (100 µg/mL) e canamicina (25 µg/mL). O DNA plasmidial das colônias 
obtidas na transformação foi extraído pelo método TENS (Sambrook, 1989) e para a 
confirmação da clonagem foi feito digestão com as enzimas Bam HI® (Promega) e 
Hind III® (Promega), seguida de reação da PCR nas condições descritas no item 4.5. 
Os clones positivos foram chamados de pLUA-052.6, 8.3, 8.5, 10.3 e 10.6. 
4.9. Validação da clonagem por seqüenciamento 
 A validação do processo de clonagem foi realizada por seqüenciamento total 
em ambas as direções do inserto com DNA do clone pLUA-0510.3. O 
seqüenciamento foi feito por encomenda (Genemed Synthesis, Califórnia, EUA). 
4.10. Teste da expressão da proteína His 6EspA 
Os clones pQE-30/espA em M15 (pREP4), confirmados PCR e 
sequenciamento foram testados para expressão da proteína recombinante. Colônias 
isoladas foram utilizadas como pré-inóculo, cultivadas em tubo Falcon de 30 mL 
contendo 5 mL de meio LB líquido com ampicilina (100 µg/mL) e canamicina (25 
 27 
µg/mL), a 37 ºC durante 16 h, sob agitação constante, em 250 rpm. Novos inóculos 
foram feitos a partir desta cultura na diluição 1:20 em erlenmeyer de 4 mL contendo 
2 L de meio LB e foram crescidos até DO600nm = 0,6. Alíquotas foram retiradas a 
cada hora para análise. A expressão do transgene foi induzida, durante 3h, com a 
adição de 1,0 mM de IPTG, o indutor sintético que reprime lac Iq. Assim, a expressão 
de Iac foi liberada permitindo a transcrição do transgene inserido no pQE-30. A 
indução também foi testada utilizando 0,7 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,1 mM e 0, 05 mM 
de IPTG. 
A figura 9 mostra um esquema representativo do vetor de expressão pQE-30® 
(Qiagen), mostrando o sítio múltiplo de clonagem com os respectivos sítios das 
enzimas de restrição, onde foi inserido o gene que codifica para EspA, e uma 
seqüência que codifica para um hexâmero de histidina. Os sítios das enzimas de 
restrição Bam HI e Hind III, inseridos na seqüência gênica espA, flanqueiam o sítio 
múltiplo de clonagem no vetor pQE-30. Amostra de material induzido e não induzido 
foram analisadas,quanto a indução, em SDS-PAGE segundo Laemmli (1972). 
A proteína EspA recombinante foi expressa como uma proteína de fusão a um 
hexâmero de histidina e foi denominada His6-EspA. A proteína de fusão tem 206 
aminoácidos, sendo que 193 são correspondentes a seqüência para EspA e 13 
aminoácidos extras para facilitar a purificação em coluna de afinidade, como 
ilustrado na figura 10 abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 28 
 espA 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 9: Esquema representativo do vetor de expressão pQE-30 (Qiagen) 
 
 
NH2 ATg AgA ggA TCg 6XHis ggA TCC NNN 579 pb(EspA) 
FIGURA 10: Esquema representativo da sequência da proteína His6EspA 
 
4.11. Purificação de His6EspA expressa em células M15 por cromatocrafia de 
afinidade em Ni-NTA-Agarose 
Após o período de indução, a cultura foi centrifugada a 2800x g por 30 min a 
4º C. O meio foi descartado, o pellet ressuspendido em 20-40 mL de tampão de lise 
desnaturante (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaH2PO4, 7 M Uréia, 2 M Tiouréia) e 
levado para ultrasom (10 Watts (RMS)). O lisado foi centrifugado a 11.600x g 
durante 5 min e o sobrenadante transferido para outro tubo. Amostras de 5 mL de 
Ni-Sepharose (50% resina e 50% de etanol a 30%) foram adicionados em coluna 
Bam HI 
13 aminoácidos de fusão 
* 
* 
 29 
de 15 mL. Esta foi lavada três vezes com 1 mL de tampão de equilíbrio (10 mM Tris 
pH 8,0, 100 mM NaH2PO4, 7 M Uréia, 2 M Tiouréia) deixando o lisado em contato 
com a resina durante 40 min, sob agitação leve, a temperatura ambiente. A 
quantidade de His6EspA induzida foi determinada previamente em SDS-PAGE 
(Laemmli, 1970), e 1 mL do lisado foi passado na coluna por vez, uma vez que a 
capacidade da coluna é de 5-10 mg de proteína por mL de resina. Após a coleta do 
material não retido a coluna foi lavado com intuito de eliminar as proteínas 
contaminantes. A lavagem foi feita 10 vezes com 5 mL de tampão de lavagem (10 
mM Tris pH 8,0, 100 mM NaH2PO4, 7 M Uréia, 2 M Tiouréia) e 5 vezes com tampão 
de lavage (10 mM Tris pH 8,5, 100 mM NaH2PO4, 7 M Uréia, 2 M Tiouréia) . Após as 
lavagens o material ligado à coluna foi eluído com tampão de eluição (10 mM Tris 
pH 4,5, 100 mM NaH2PO4, 7 M Uréia, 2 M Tiouréia). Todos os lavados e eluídos 
foram coletados de 5 em 5 mL. Imediatamente à eluição, a resina foi lavada três 
vezes com 5 mL da solução de lavagem após uso em condições desnaturantes e 
guardada em etanol 30% a4ºC. A proteína purificada passou pelo processo de 
diálise para dessalinização (4 vezes em 4L de solução de diálise) e por 
concentração pelo processo de sublimação (liofilização). Todas as amostras 
coletadas foram aplicadas em gel desnaturante de acrilamida (SDS-PAGE) a 15% 
para visualização da proteína His6EspA. A proteína purificada foi quantificada por 
ácido biscínconínico (Redinbaugh e Turley, 1986) e por densitometria ( Bozzo e 
Retamal , 1991). 
4.12. Produção de anticorpos policlonais anti-His6EspA em coelho 
A imunização de dois coelhos albinos, pesando cerca de 2 Kg cada, para a 
produção de anticorpos policlonais contra a proteína His6EspA seguiu o esquema de 
imunização descrito por Harlon e Lane (1998). A primeira imunização foi realizada 
com 150 µg de proteína, emulsificada com 500 µL de adjuvante completo de 
Freünd® (Sigma-Aldrich, EUA). As aplicações foram subcutâneas na região cervical 
do animal. Após 15 e 30 dias foram feitos reforços aplicando a quantidade de 100 µg 
antígeno emulsificado com 500 µL de adjuvante incompleto de Freünd® (Sigma-
Aldrich, EUA) . Após 15 dias do último reforço foi feita a sangria total dos animais via 
punção cardíaca, por um Veterinário. O sangue foi coagulado, centrifugado, e o soro 
 30 
coletado foi aliquotado e estocado a -20º C para uso posterior em testes de 
interação antígeno-anticorpo. 
4.13. Purificação de IgG anti-His 6EspA de coelho 
A IgG do soro de coelho pré-imunizado e imunizado foi purificada em coluna 
de afinidade de proteína A (segundo as especificações do fabricante -® Sigma-
Aldrich, EUA) utilizando o Kit Protein A Antibody Purification KitR . A IgG total 
purificada foi quantificada por ácido biscinconínico (Redinbaugh e Turley, 1986). 
 
4.14. Testes de antigenicidade da His6EspA 
 
A antigenicidade da His6EspA foi avaliada por Western blot/imunoblot 
segundo metodologia descrita (Towbin et al., 1979). A proteína EspA (4 µg) 
recombinante purificada por afinidade foi fracionada por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) 
e eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose de 0,22 µm (Bio-Rad 
Laboratories, Richmond, EUA). As membranas foram bloqueadas com 1% de leite 
desnatado em tampão TST-20 (Tris, Sal (NaCl), Tween-20)(ANEXO) por 16 h a 4 ºC. 
Os anticorpos utilizados para detectar His6EspA foram: monoclonal anti-His, 
anticorpos policlonais anti-EspA produzidos em coelho (nesse trabalho) e soros (n= 
100) de pacientes pediátricos assintomáticos diluídos em TST-20 com 0,3% de leite 
desnatado, a 1:6.000, 1:10.000, 1:500, respectivamente. As membranas foram 
incubadas com os anticorpos diluídos durante 4 h. Os reagentes para detecção dos 
anticorpos imobilizados foram proteína A conjugada a peroxidase (Amersham 
Pharmacia Biotech, EUA), na diluição 1:6.000, anticorpo monoclonal de coelho anti-
IgG humana conjugada a peroxidase (® Sigma-Aldrich, EUA ) e anticorpo 
monoclonal de coelho anti-IgA humana conjugada a peroxidase (® Sigma-Aldrich, 
EUA), na diluição de 1:40.000, em TST-20 com 0,3% de leite desnatado. O tempo 
de incubação foi de 2 h. Entre cada etapa as membranas foram lavadas 3 vezes 
com TST-20. As membranas foram reveladas pela adição de uma solução do 
cromógeno diaminobenzidina (DAB) (® Sigma-Aldrich, EUA). A reação foi bloqueada 
com água destilada. 
 A antigenicidade da His-EspA foi avaliada por testes de ELISA segundo 
metodologia descrita (Coligan, 1991). No ensaio de ELISA, utilizando placa de 96 
 31 
poços, foram incubados 50 µL/poço de uma solução de 2 µg/mL da proteína 
His6EspA recombinante em tampão carbonato/bicarbonato (ANEXO), durante 16 h a 
4º C. Após a sensibilização, a placa foi bloqueada com 1% de leite em pó desnatado 
(diluído em PBS 1X, Tween-20 0,05%) por uma hora a 37º C. Logo após foram 
adicionados os soros (anti- HisEspA recombinante) dos diferentes coelhos diluídos 
em log 2 a partir de 1:100 até 1:3,276,800 e de pacientes de 0 a 2 anos de idade 
diluídos a 1:500, ambos em 0,2% de leite/Tween-20 0,05% em PBS e incubados por 
duas horas. Foi utilizada proteína A conjugada a peroxidase, na diluição de 
1:30.000, ou IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada a peroxidase, na diluição 
1:40.000. Para os soros humanos foram utilizadas IgG de coelho anti-IgG e IgA 
humana conjugada a peroxidase. A revelação ocorreu após 25 min, na presença de 
2 mM de orto-fenil-diamina (® Sigma-Aldrich, EUA) e 0,006% de peróxido de 
hidrogênio. A reação foi parada com a adição de 20 µL de 0,1 N de ácido sulfúrico. A 
leitura das reações colorimétricas foi realizada em leitor de placas Multiskan, 
Labsystems Uniscience, a 492 nm. Para esse ensaio consideramos o End Point 
sendo diluição que apresenta uma D.O. duas vezes maior a do controle negativo. 
 
4.15. Ensaio de hemólise e inibição de hemólise 
 
A atividade hemolítica foi determinada como descrito em (Shaw et al., 2001; 
Ribeiro e Medina-Acosta, 2003) com adaptações. O sangue de um indivíduo 
saudável foi coletado em vacuum tube contendo heparina como anticoagulante. As 
hemácias foram sedimentadas por centrifugação por 10 min 2.000 x g 20 ºC e 
lavadas três vezes em PBS (Tampão fosfato salino) (ANEXO) de alta força iônica ou 
IGP (Tampão Isotônico Glicose Fosfato) (ANEXO) de baixa força iônica. As células 
foram reconstituídas em PBS ou em IGP para 20% (v/v) volume de célula 
empacotada. Essa suspensão foi diluída 1:20 em PBS ou em IGP, e desta 
suspensão 100 µL/ poço a uma placa contendo 96 poços . 
As EPEC (EAF+) B171 (O111:NM) (cepa patogênica para humano), REPEC-1 
(cepa patogênica para coelho) e DH5-α (Invitrogem) (cepa não patogênica) foram 
crescidas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado, a 37 ºC durante 
16 h sob agitação de 170 rpm. Um mililitro de cada cultura foi transferido para tubo 
de microcentrífuga e foram sedimentadas por centrifugação por 10 min a 2.000 x g a 
 32 
20ºC. As células foram lavadas com PBS ou IGP e recontituídas em 500 µL de PBS 
ou IGP. Dessa solução 100µL/poço foram adicionados em placa de 96 poços 
juntamente com as hemácias para indução de hemólise. A cepa de E. coli DH5-α, foi 
utilizada como um dos controles negativo. Um segundo controle negativo foi feito 
com hemácia e PBS ou hemácia e IGP. O controle de hemólise total foi feito 
incubando hemácias com 1% de Tween-20 em água destilada. 
Para os testes de inibição da hemólise 50 µg ou 100 µg de IgG de coelho 
imunizados com EspA, purificada utilizando o Kit Protein A Antibody Purification KitR 
(Sigma Co., St. Louis, EUA), foram incubadas com as bactérias durante 25 min 
antes de acrescentar as hemácias diluídas em PBS ou IGP. 
Todas as amostras foram incubadas durante 1 h a 37 ºC e centrifugadas 
durante 5 min por 1.500 x g a 20 ºC. O sobrenadante foi transferido para outros 
poços e a absorbância medida a 405nm. Todas as amostras foram feitas em 
duplicatas. 
A atividade hemolítica foi calculada como porcentagem, usando a fórmula: 
 
% de hemólise=[ valor da média D.O. 405nm da amostra teste] - [valor da média D.O. 
405nm com tampão] / [valor da média D.O. 405nm amostra tratada com Tween-20] - 
[valor da média D.O. 405nm com tampão] X 100%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33 
 5. RESULTADOS 
5.1. Amplificação da região codificadora para EspA 
 
Utilizamos DNA extraído de EPEC (EAF+) B171 (O111:NM) para amplificação 
da região codificante da EspA. Foram utilizados iniciadores específicos, dNTPs e 
MgCl2 em diferentes concentrações até se encontrar a melhor, que foi 25pmoles, 
25mM, 2,5mM respectivamente. Foi usado o pQE-30 como controle negativo e o 
megaplasmídio, que contém a região codificadora bfpA, como controle positivo. 
Para visualizar o resultado os 25 µL da reação da PCR foram aplicados em gel 
de agarose 0,8% com brometo de etídio (Figura 11 A). Após estabelecimento das 
condições ótimas, a PCR foi repetida parater o fragmento em grande quantidade 
para a clonagem (Figura 11 B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11: Visualização eletroforética da amplificação da espA 
Gel de agarose 0,8% contendo 0,03% de brometo de etídio. A: Amplificação da 
espA com iniciadores específicos. M: marcador λ Hind de 564 pb a 23.000 pb; 1: 
espA amplificada; 2: controle negativo pQE-30; 3: controle positivo com pLUA-013 4: 
controle positivo com DNA de EPEC. B: 1-8 amostras da amplificação da espA em 
grande quantidade para a ligação ao pGEM- Teasy. M: marcador 1kb. As setas 
indicam a posição relativa do amplicom de 579pb. 
579pb 579pb 
 1 2 3 4 5 6 7 8 M A B 
 M 1 2 3 4 
 34 
 
5.2. Ligação do Amplicon no vetor de clonagem 
 
Foi realizada a ligação do amplicom ao vetor pGEM-Teasy, (®Kit Promega). 
Células DH5-α competentes foram transformadas com o produto da ligação e 
plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina 100 µg/mL, IPTG 80µg/Ml e X-
Gal 16 mM para selecionar as colônias brancas. As colônias selecionadas foram 
crescidas em 5mL de meio LB líquido contendo ampicilina 100 µg/mL por 16 h. O 
DNA de 10 colônias brancas foi extraído pelo método de TENS. 
 
5.3. Validação dos possíveis clones (pGEM-Teasy/espA) 
 Foi feita uma PCR para validação dos possíveis clones (pGEM-Teasy/espA) e 
seis dos dez possíveis clones (1, 2, 3, 4, 8 e 10) foram positivos para espA (Figura 
12). 
 Foi realizada uma digestão com as enzimas Bam HI ®(Promega) e Hind 
III®(Promega) dos DNA das colônias (1, 2, 3, 4, 8 e 10) positivas por PCR para 
linealizar o vetor de clonagem e deixar o inserto espA com extremidades coesivas, 
prontas para serem ligadas no vetor de expressão pQE-30. Um gel de agarose 0.8% 
foi feito e nele aplicado toda a amostra das digestões. Foi possível visualizar a 
liberação do fragmento correspondente a espA somente na digestão dos DNA das 
colônias 1, 2, 4, 8, e 10, de onde a banda correspondente ao inserto espA foi 
extraída do gel utilizando o Kit da Gibco (Figura 13). As colônias positivas receberam 
o nome de pLUA-041, 2, 4, 8 ou 10. 
 
 
 
 
 
 
 35 
 
 
 
Figura 12: Visualização eletroforética do produto da PCR para validar clones 
pGEM/espA 
 
Gel de agarose 0,8% contendo 0,03% de brometo de etídio. M: marcador λ Hind de 
564 pb a 23.000 pb; 1-10: DNA de colônias 1-10 de pGEM/espA; C+: controle 
positivo com DNA de EPEC; C- : controle negativo com pQE-30. 
 
 
 
 
 
Figura 13: Visualização eletroforética da digestão para confirmação de clones 
pGEM/espA e purificação de espA. 
 
Gel de agarose 0,8% contendo 0,03% de brometo de etídio. M: marcador λ Hind de 
564 pb a 23.000 pb; 1-7: DNA de clones pGEM/espA positivos por PCR e digeridos 
com Bam HI e Hind III . 
579pb 
500pb 
 M 1 2 3 4 5 6 7 
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ C- 
579pb 
 
 36 
5.4. Preparação do vetor de expressão pQE-30 
 
 Células DH5- α competentes foram transformadas com pQE-30, plaqueadas 
em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL). Algumas colônias foram selecionadas 
e crescidas em 5mL de meio LB com ampicilina (100 µg/mL) por 16 h. 
 Os DNAs dessas colônias foram extraídos pelo método de TENS. Foi feita a 
digestão do pQE-30 extraído, com as enzimas Bam HI ®(Promega) e Hind 
III®(Promega). Depois da digestão foi feita uma precipitação utilizando 0.3M de NaCl 
e 2,5 V de etanol e um gel de agarose 0.8% foi feito para visualização do vetor 
extraído, digerido e precipitado (Figura 14). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14: Visualização eletroforética da digestão e precipitação do vetor de 
expressão pQE-30. 
Gel de agarose 0,8% contendo 0,03% de brometo de etídio. M: marcador de 100pb 
a 1517pb. 1 e 2 vetor pQE-30 linearizado pelas enzimas Bam HI e Hind III, e 
precipitado. 
 
 
 
 
 
 
Vetor pQE-30 linear 
 M 1 2 
3500pb 
500pb 
 37 
 O inserto espA obtido da digestão de clones positivos pGEM/espA foi 
purificado do gel pelo Kit da Qiagen. Após a purificação, um gel de agarose 
0.8% foi feito para quantificação do vetor e inserto purificado (Figura 15). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15: Visualização eletroforética do vetor de expressão pQE-30 e o inserto 
espA com extremidades Bam HI e Hind III purificados. 
Gel de agarose 0,8% contendo 0,03% de brometo de etídio. 1: pQE-30 linearizado; 
2-6: espA purificada de 5 diferentes clones pLUA-04(1, 2, 4, 8 e 10); M: marcador de 
100pb a 1517pb. 
 
5.5. Ligação do inserto espA no vetor de expressão 
 
 Uma vez digeridos com as enzimas Bam HI e Hind III, o inserto extraído do 
gel via Kit, e o vetor pQE-30 precipitado foram quantificados em torno de 5 ng/µL e 
40 ng/µL, respectivamente. Diferentes reações de ligação vetor – inserto foram 
feitas: 1:1 e 1:3 com o fragmento espA purificado dos clones pLUA-04(1, 2, 4, 8 e 10), 
sendo a concentração do vetor foi sempre de 50ng/µL. A reação de autoligação 
(sem inserto) também foi realizada como controle. 
As E. coli da cepa M15 foram transformadas por choque térmico, com o 
produto de cada ligação, plaqueadas em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL) e 
canamicina (25 µg /mL) e crescidas por 16 h a 37 ºC. 
 
 
 
3400pb 
 1 2 3 4 5 6 
579pb 
 1 2 3 4 5 6 M 
 38 
5.6. Validação dos clones por PCR 
 
Uma PCR foi também realizada com o DNA dos clones pLUA-052.6, 8.3, 8.5, 10.3 e 
10.6. O DNA de EPEC foi utilizado como controle positivo e pQE-30 foi usado como 
controle negativo (Figura 16). 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 16: Visualização eletroforética da reação da PCR para validação da 
clonagem de espA no vetor pQE-30. 
Gel de Agarose 0.8% contendo 0,03% de brometo de etídio. M: marcador λ Hind de 
564 pb a 23.000 pb. Nos poços 1-5 DNA de cinco clones; C-: controle negativo com 
pQE-30; C+: controle positivo com DNA de EPEC. 
 
5.7. Teste da expressão da proteína His6espA 
 
Trinta colônias foram selecionas, crescidas em meio LB contendo ampicilina 
(100 µg/mL) e canamicina (25 µg/mL) e incubadas por 16 h a 37 ºC. 
 Como as células M15 contém o plasmídio pREP4 (que contem um gene para 
resistência a canamicina), juntamente com pQE-30/espA (que contem gene para 
resistência a ampicilina), colônias que crescerem em meio contendo os dois 
antibióticos possuem ambos os plasmídios. Cultivos positivos para ambos os 
plasmídios, foram incubadas com 1 mM de IPTG para a expressão da proteína 
recombinante EspA. Cinco cultivos expressaram EspA recombinante e foram 
M 1 2 3 4 5 C- C+ 
579pb 
 39 
chamados de pLUA-052.6, 8.3, 8.5, 10.3 e 10.6 (Figura 17). Esse mesmo procedimento de 
indução da expressão foi repetido, porém utilizando diferentes concentrações do 
indutor IPTG, a fim de encontrar a sua concentração mínima ainda capaz de induzir, 
e dessa forma evitar desperdício (Figura 18). O DNA desses cultivos foi extraído 
pelo método TENS e armazenados para fim de manutenção. Foi realizado um 
ensaio de Western blot com o lisado total das colônias positivas, utilizando anticorpo 
monoclonal anti-hexâmero de histidina como anticorpo primário(Figura 19). 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 17: Visualização eletroforética da expressão da proteína EspA 
recombinante 
SDS-PAGE com gel de acrilamida/bisacrilamida a 15% corado com azul de 
Comassie R-250. Nas raias 1, 3, 5, 7 e 9 são amostras de lisado de cultura não 
induzida; nas raias 2, 4, 6, 8 e 10 são amostras de lisado de cultura induzida durante 
3h com IPTG. A seta representa a banda de proteína EspA super expressa. 
 
 
 
 
25 kDa 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
 40 
 
 
 
NI 1 2 3 4 5 6 
Induzidos
25 kDa
NI 1 2 3 4 5 6 
Induzidos
25 kDa
 
FIGURA 18: Visualização eletroforética da indução da expressão da proteína 
EspA recombinante com diferentes concentrações de IPTG 
SDS-PAGE com gel de acrilamida/bisacrilamida a 15% corado com azul de 
Comassie R-250. NI: referente ao lisado não induzido, 1-6: referente aos lisados 
induzidos, respectivamente, com 1 mM, 0,7 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,1 mM e 0,05 
mM de IPTG. 
 
 
 
 
 
 41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 19: Detecção de EspA recombinante por Western blotting 
Lisado total de proteína EspA recombinante foi aplicada num gel de acrilamida 15% 
e transferido para membrana de nitrocelulose onde IgG anti-His reconheceu o 
hexâmero de histidina fusionado à proteína EspA. M: marcador low range (BioRad); 
1, 3, 5, 7 e 9: são amostras de lisado de cultura induzidas durante 3 h com IPTG; 2, 
4, 6 e 8: são amostras de lisado de cultura não induzida. A seta indica a proteína 
EspA super expressa. 
 
 
 
 
 
20,7 
 M 
(kDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
 107 
81 
48,7 
33,8 
27 
20,7 
 42 
5.8. Validação do clone pLUA-0510.3 por sequenciamento 
A partir do resultado da PCR foram feitas extrações de DNA para se obter 
quantidades suficientes, e de boa qualidade, a serem precipitados e enviados para 
sequenciamento. O sequenciamento foi feito por encomenda (Genemed Synthesis, 
Califórnia, EUA). O clone pLUA-0510.3 foi seqüenciado totalmente, em ambas as 
direções do inserto (Figura 20). 
 
CCCTTCCGGCGGAACATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGATGATGATGAGAGGATCGCCCC
ATCACCATCACCATCACATCACCATCACCATCACATCACCATCACCATCACATCACCATCACCATCACGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCGCGGCGGCGGCGATGGATACATCAACTGCAACATCAGTTGCTAGTGCGAAC
GCGAGTACTTCGACATCGACAGTCTATGACTTAGGCAGTATGTCGAAAGACGAAGTAGTTCAGCT
ATTTAATAAAGTCGGTGTTTTTCAGGCTGCGCTTCTCATGTTTGCCTATATGTATCAGGCACAAAG
CGATCTGTCGATTGCAAAGTTTGCTGATATGAATGAGGCATCTAAGGAGTCAACCACAGCCCAAA
AAATGGCTAATCTTGTGGATGCTAAAATTGCTGATGTTCAGAGTAGTTCTGACAAGAATAAGAAAG
CCAAACTTCCTCAAGAAGTGATTGACTATATAAATGATCCTCGCAATGACATTACAGTAAGTGGTA
TTAGCGATCTAAATGCTGAATTAGGCGCTGGTGATTTGCAAACGGTGAAGGCCGCTATTTCGGCC
AAATCGAATAACTTGACCACGGTAGTGAATAATAGCCAGCTTGAAATACAGCAAATGTCAAATACG
TTAAACCTATTAACGAGTGCACGTTCTGATATTCAGTCACTGCAATACAGAACTATTTCAGCAATAT
CCCTTGGTAAATAACCCAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGAC
CTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGA
ATCCAAGCTAGCTGGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTG
GATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGC
TCATGTACCTATACCAGACCGTTCAGCTGGATATACGCTTTTTAAGACCGTAAAGAAAAATAGCAC
AGTTTATCGGCTTTATCACATCTGCCCGCTGATGATGCTCATCGATTTCGTATGGCATGAGGACG
GTGAGCTGTGTAATTGGATAGTGTTCACCTTGTTCACCGTTTCATGGAGCACTGGAACGTTTCATC
GCCTTGATGTAATCCCACGACGATTCGGCGCGAACTTATGTC 
FIGURA 20: Seqüência total do clone pLUA-05 10.3 
A região em vermelho esta indicando a seqüência parcial do vetor pQE-30; em preto 
o códon inicial; em lilás o hexâmero de histidina; em verde o sítio para restrição Bam 
Hl; em alaranjado o sítio para restrição Hind III; em roxo um aminoácido adicional 
marcador de identificação; e em azul a seqüência referente a EspA. 
 
 43 
 
 Ao desenhar os iniciadores, tomamos como referência a seqüência de espA 
da REPEC sorotipo “O103:H2”, porém, a reação da PCR foi realizada utilizando o 
DNA da EPEC humana (B171) sorotipo “O111:NM”. Comparando o resultado desse 
sequenciamento com a seqüência de espA da REPEC (“O103:H2”) vimos que 
possui 100% de homologia com a espA de EPEC humana (“O111:NM”). 
 
5.9. Purificação da EspA recombinante em coluna de Ni- Sepharose 
 
Foi montada uma coluna com 5 mL de resina Ni-Sepharose que foi 
equilibrada com 10 mL de tampão de lise pH = 8,0. Foi aplicado 1 mL do lisado total 
acrescido de 1mL do tampão de lise pH 8,0 e incubado durante 40 min. Uma única 
porção de material não retido foi coletada. A primeira lavagem foi feita com 50 mL 
(10x de 5 mL) de tampão de lise pH 8,0. A segunda lavagem foi feita com 25 mL (5x 
de 5 mL) de tampão pH 8,5, e a eluição foi feita com 50 mL de tampão pH 4,5 (10x 
de 5 mL) (Figuras 21 e 22). 
 
 
 
 
FIGURA 21: Visualização da purificação da proteína EspA recombinante em 
coluna de afinidade Ni- Sephaose. 
SDS-PAGE com gel de acrilamida/bisacrilamida a 15% corado com azul de 
Comassie R-250. Raia 1: lisado total; 2: não retido; 3: lavado em pH 8,0; 4: lavado 
em pH 8,5; 5-10: Eluído 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em pH 4,5. 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
25 kDa 
 44 
 
 
 
 
 20 59 52 59 90 99.9 99.9 52 40 % 
 
 
FIGURA 22: Análise das frações de purificação da proteína EspA recombinante 
SDS - PAGE 15% com amostras da proteína EspA recombinante purificada em 
coluna de afinidade Ni- agarose, dialisada e liofilizada. Raia 1: lisado total, 2-9: 
purificações de EspA, em diferentes dias. O percentual de pureza da proteína EspA 
de diferentes purificações, é mostrado na parte inferior do gel. Os percentuais foram 
obtidos usando programa e a metodologia de densitometria usadas por (Bozzo e 
Retamal, 1991). 
 
5.10. Quantificação de His 6EspA utilizando densitometria 
 
A partir do gel de SDS PAGE 15%, da figura 22, foi realizado estudo de 
densitometria, usando o programa computacional desenvolvido por Bozzo e Retamal 
(1991). 
Os dados de densitometria somados aos dados de dosagem de proteínas 
pelo método de Bradford (1976) (das purificações 5, 6 e 7, da figura 22, podem ser 
resumidos na tabela 3. 
 
 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
25 kDa 
 45 
 
TABELA 4: Demonstrativo da purificação da proteína EspA recombinante 
 
5 6 7 Lisado 
Proteína solúvel a 2,65 mg 2,35 mg 2,25 mg 3,72 mg 
Produção 71,2% 63,2% 60,5% ---- 
Rendimento b 17,7 mg/g 
peso úmido 
15,7 mg/g 
peso úmido 
15 mg/g 
peso úmido 
25 mg/g 
 peso úmido 
Eficiência 70,8% 62,8% 60% ---- 
Homogeneidade 99,9% 99,9% 90% ---- 
 
a Proteína total por mL. b A partir de 4 L de cultura foi obtido 2,4 g de peso úmido de 
células que foi diluído em 16 mL de tampão de lise. A quantidade relativa de proteína 
total solúvel presente em 1 mL é 18,6 mg. Os cálculos foram realizados considerando 
um nível de expressão de 20% que representa 3,72 mg do lisado total. 
 
5.11. Imunização de coelhos com proteína EspA recombinante 
 
 A proteína EspA recombinante, 99,9% homogênea, foi utilizada para o 
processo de imunização. 
 
5.12. Avaliação da especificidade do anticorpo policlonal de coelho contra 
EspA recombinante 
 
Para avaliar a especificidade do anticorpo policlonal anti-EspAproduzido em 
coelhos foi sensibilizada uma placa de ELISA, com 2 µg/mL de EspA recombinante e 
incubada com o anticorpo policlonal anti-EspA de coelho nas diluições em log 2 a 
partir de 1:100 até 1:3,276,800. Consideramos o anticorpo ainda reativo (End Point) 
numa diluição com Densidade Óptica (D.O.) duas vezes a do controle negativo (soro 
pré-imune), e o título foi de 1:400,000. 
 Com o objetivo de visualizar a reatividade do anticorpo de coelho contra 
EspA, 4 µg de EspA recombinante foi aplicada por poço de um gel SDS – PAGE 
15% e transferida para uma membrana de nitrocelulose. Essa membrana foi cortada 
em tiras, uma foi incubada com IgG de coelho anti-His, (controle positivo), e a outra 
 46 
foi incubada com IgG de coelho anti-EspA, ambas durante 3 h. Por último, a 
membrana foi incubada com proteína A peroxidase por mais 2 h e a reação foi 
revelada. Anticorpo anti-EspA produzido em coelho mostrou ser reativo para EspA 
recombinante, e na mesma intensidade do controle positivo (Figura 23). 
 
 
1 2 3 4 5 6
25 kDa
1 2 3 4 5 6
25 kDa
 
 
 
FIGURA 23: Avaliação da reatividade do anticorpo anti-EspA produzido em 
coelho. 
Uma montagem para comparação onde 1 e 2 são SDS-PAGE 15% corado com 
Comassie blue. 1: lisado bacteriano, 2: Proteína EspA recombinante pura, 3, 4, 5: 
proteína EspA pura transferida para membrana de nitrocelulose, 6: lisado bacteriano 
transferido para membrana de nitorcelulose. 3: proteína EspA recombinante pura, 
anticorpo monoclonal anti-Hexâmero de Histidina na diluição 1:6.000, 4: proteína 
EspA recombinante pura, anticorpo anti-EspA produzido em coelho na diluição 
1:10000, 5: Proteína EspA recombinante pura, soro de paciente pediátrico na 
diluição de 1:500, 6: lisado bacteriano, anticorpo anti-EspA produzido em coelho na 
diluição 1:10.000. 
 
 
 
 47 
 
5.13. Estudo da soro prevalência de IgG e IgA séricas anti-EspA de crianças 
de 0 a 2 anos. 
 
Para avaliar a soro prevalência de IgG e IgA séricas, placas de ELISA foram 
sensibilizadas com 2 µg/mL de EspA recombinante, e incubada com soro de 100 
crianças de 0 a 2 anos numa diluição de 1:500. Consideramos soro positivo para 
EspA o soro que na diluição 1:500 teve D.O. duas vezes a do controle negativo (sem 
anticorpo primário). Dos 100 soro analisados 75 foram positivos para IgG e 23 para 
IgA (Figura 24). 
 
0 20 40 60 80 100
0-6 meses
6-12 meses
12-18 meses
18-24 meses
0-24 meses
Fa
ix
a 
Et
ár
ia
 
(m
es
es
)
Porcentagem (%)
IgA
IgG
 
 
FIGURA 24: Soro prevalência de IgG e IgA séricas anti-EspA recombinante em 
lactentes. 
O gráfico mostra a porcentagem de crianças soro positivas para IgG e IgA anti-EspA 
em diferentes faixas etárias. 
 
 
23/100 
75/100 
40/49 
10/49 
5/12 
7/12 
27/36 
8/36 
1/3 
0/3 
 48 
Depois de realizada a seleção dos soros positivos para EspA recombinante, 
foi avaliada a especificidade desses soros para EspA através da sua titulação. Mais 
placas de ELISA foram sensibilizadas com 2 µg/mL de EspA recombinante e 75 
soros positivos para IgG e 23 soros positivos para IgA foram diluídos 1:100 a 
1:3.200. Foi considerado ainda positivo o soro diluído que apresentou uma D.O duas 
vezes maior a do controle negativo chamado de “End Point”. A reatividade dos soros 
nas outras diluições foram consideradas End Point de 1 a 6 de acordo com o grau 
da reatividade com EspA recombinante (Figuras 25 e 26). 
 
 
 
 
ELISA
Soroprevalência IgG anti-EspA 
0
1
2
3
4
5
6
7
0 6 12 18 24 30
Faixa Etária (meses)
En
d 
Po
in
ts
 
 
 
FIGURA 25: Especificidade da IgG anti-EspA 
O gráfico mostra a relação da especificidade da IgG anti-EspA com a faixa etária dos 
pacientes soro positivos. 
 
 
 49 
 
 
 
 
ELISA 
Soroprevalência de IgA anti-EspA
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25 30
Faixa Etária (meses)
En
d 
Po
in
ts
 
 
FIGURA 26: Especificidade da IgA anti-EspA 
O gráfico mostra a relação da especificidade da IgG anti-EspA com a faixa etária dos 
pacientes soro positivos. 
 
Para podermos visualizar a especificidade de soros de crianças de 0 a 2 anos anti-
EspA recombinante foram feitos dois géis preparativos de acrilamida contendo 
aproximadamente 4 µg de EspA recombinante e transferidos para membranas de 
nitrocelulose. Depois de bloqueadas com 1% de leite bovino, foram secas e cortadas 
em tiras. Os soros que no ELISA foram mais positivos para IgG ou IgA foram 
incubados com diferentes tiras. A IgG anti-Human foi utilizado como anticorpo 
secundário (Figuras 27 e 28). 
 
 
 
 
 50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 27: Imunodetecção de IgG anti-EspA de crianças assintomáticas. 
SDS – PAGE 15% preparativo, contendo HisEspA purificada, foi transferida a uma 
membrana de nitrocelulose, depois cortada em tiras. 1-12: soros das crianças (1, 2, 
9, 13, 17, 41, 73, 74, 81, 85, 89, 99) de até 2 anos de idade (1:500) e revelado com 
IgG de cabra anti-IgG humano conjugada a peroxidase (1:40.000). 
 
 
 
 
 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
 
 + + + + + + + + + + + + 
25 kDa 
 51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 28: Imunodetecção de IgA anti-EspA de crianças assintomáticas. 
 SDS – PAGE 15% preparativo contendo HisEspA purificada foi transferida para 
membrana de nitrocelulose, depois cortada em tiras. 1-12: soros das crianças (4, 5, 
6, 9, 15, 17, 41, 45, 51, 54, 74, 81) de até 2 anos de idade (1:500) e revelado com 
IgG de cabra anti-IgA humano conjugada a peroxidase (1:40.000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
 
 + - + + + + + + + + + - 
25 kDa 
 52 
5.14. Ensaio de hemólise e inibição da hemólise 
TABELA 5: Porcentagem de hemólise de hemácias com diferentes tratamentos 
 
 EPEC REPEC DH5-α (c-) 
Hemácia+IGP 47% 43,2% 2,5% 
Hemácia+PBS 0,85% 1,2% 4,7% 
Hemácia+IGP+50µg IgG 
anti-EspA 
38,1% 38,5% ---- 
Hemácia+IGP+100µg 
IgG anti-EspA 
4,6% 5,5% ---- 
Hemácia+PBS+50µg IgG 
anti-EspA 
1% 0,3% ---- 
Hemácia+PBS+100µg 
IgG anti-EspA 
0,06% 0,26% ---- 
Hemácia+IGP+100 µg 
IgG pré-imune 
---- -0,09 ---- 
Hemácia+PBS+100 µg 
IgG pré-imune 
---- 0,9% ---- 
 
As cepas de EPEC e REPEC utilizadas nesses ensaios mostraram induzir a 
lise de hemácias quando em solução com IGP (baixa força iônica), e lise 
extremamente baixa quando em solução com PBS, pois, em baixa força iônica a 
aproximação da bactéria (dos filamentos de EspA) com as hemácias fica facilitada, 
sendo o ensaio mais sensível. A cepa de E. coli DH5-α foi utilizada como controle 
negativo por não ser patogênica, portando, não possui filamentos de EspA, que é o 
que medeia a lise (Shaw et al., 2001). 
 O teste de inibição da hemólise se baseia em inibir o contato dos filamentos 
de EspA utilizando anticorpos anti-EspA produzidos em coelho. Ao utilizarmos 50 µg 
de IgG anti-EspA, a inibição da hemólise foi apenas de 8,9% em comparação ao 
ensaio somente com EPEC, e de 4,7% em comparação ao ensaio somente com 
REPEC. Com utilização de 100 µg de IgG anti-EspA, houve inibição de 42,4% em 
comparação ao ensaio somente com EPEC, e de 37,7% em comparação ao ensaio 
somente com REPEC. 
 Contudo, ao utilizarmos IgG pré-imune como controle negativo da inibição, a 
hemólise não foi observada. 
 53 
6. Discussão 
 
 
Dada a alta morbidade e mortalidade causada por EPEC, principalmente em 
crianças de até 2 anos de idade, existe interesse