Fundamentos do diagnostico de doenças transmissíveis

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Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Fundamentos do
Diagnóstico Laboratorial
de
Doenças Transmissíveis
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
EPIDEMIOLOGIA
Diagnóstico
Laboratorial
Epid. Analítica
Epid. Descritiva
Georeferenciamento
Sensoriamento 
Remoto
Modelagem 
Matemática
Vacinologia
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
CONTROLE OU ERRADICAÇÃO DE DOENÇAS
Objetividade
Diagnóstico
Laboratorial
Medidas de DSA
•Sacrifício
•Interdição
•Restrições Importação / Exportação
•Indenizações
•etc
$ $
Sensível
Específico
Subjetividade
Diagnóstico Clínico
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
•Rede de Laboratórios de Diagnóstico de Referência
•Recomenda Técnicas
•Estabelece “Padrões Ouro”
World Organization
for Animal Health
Comércio Internacional
de Animais e Produtos de Origem
Animal
Leonardo J. Richtzenhain
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Ectoparasitas
Endoparasitas
Fungos
Protozoários
Bactérias
Rickettsias
Vírus
Prions
Diversidade de Agentes
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Prejuízos
Barreiras
Sanitárias
Leonardo J. Richtzenhain
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Complexidade
de 
Diagnóstico
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Abrangência
de 
diagnóstico
dos 
Laboratórios
D. Parasitárias
D. Fúngicas
D. Protozoários
D. Bacterianas
D. Virais
D. Priônicas
Leonardo J. Richtzenhain
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INFECÇÃO DOENÇA
?
(Infectividade) (Patogenicidade)
D. Grave
D. Branda
(Virulência)
Leonardo J. Richtzenhain
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INFECÇÃO
EXUBERÂNCIA CLÍNICA
QUEDA PRODUÇÃO
QUEDA PRODUÇÃO
DOENÇA
SUB-CLÍNICA
Leonardo J. Richtzenhain
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O BINÔMIO 
INFECÇÃO X DOENÇA
Leonardo J. Richtzenhain
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Robert KochLouis Pasteur
•Carbunculo hemático
•Tuberculose
•Cólera 
•Cólera Aviária
•Carbúnculo hemático
Final
Século
XIX
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
X
Binômio Infecção x Doença
TuberculoseRobert Koch
M. bovis
Postulados de Koch, 1877
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
POSTULADOS DE KOCH, 1877
1. A presença do agente deve ser sempre comprovada em todos os indivíduos que 
sofram da doença em questão e, a partir daí, isolada em cultura pura.
2. O agente não poderá ser encontrado em casos de outras doenças.
3. Uma vez isolado, o agente deve ser capaz de reproduzir a doença em questão, 
após a sua inoculação em animais experimentais.
4. O mesmo agente deve poder ser recuperado desses animais experimentalmente 
infectados e de novo isolado em cultura pura.
Agente X Doença Y 
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Sífilis Lepra
Isolamento “Cultura pura”
?
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
POSTULADOS DE 
EVANS
1976
ALFRED S. EVANS M.D., M.P.H.
YALE UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
1- a prevalência da doença deve ser significativamente mais alta entre os expostos à causa suspeita do que 
entre os controles não expostos.
2- a exposição à causa suspeita deve ser mais frequente entre os atingidos pela doença do que
o grupo de controle que não a apresenta, mantendo constante os demais fatores de risco.
3- a incidência da doença deve ser significantemente mais elevada entre os expostos à causa suspeita do que 
entre aqueles não expostos.
4- a exposição ao agente causal suspeito deve ser seguida de doença, enquanto que a distribuição do período de 
incubação deve apresentar uma curva normal.
5- um espectro da resposta do hospedeiro deve seguir a exposição ao provável agente, num gradiente biológico 
que vai do benigno ao grave.
6- uma resposta mensurável do hospedeiro, até então inexistente, tem alta probabilidade de aparecer após a exposição 
ao provável agente, ou aumentar em magnitude se presente anteriormente.
7- a reprodução experimental da doença deve ocorrer mais frequentemente em animais ou humanos adequadamente
expostos à provável causa do que naqueles não expostos.
8- a eliminação ou modificação da causa provável deve diminuir a incidência da doença.
9- a prevenção ou modificação da resposta do hospedeiro face a exposição à causa provável deve diminuir a incidência 
ou eliminar a doença.
10- todas as associações ou achados devem apresentar consistência com os conhecimentos no campo da biologia
e da epidemiologia.
POSTULADOS DE EVANS, 1976
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Doenças Multifatoriais
Doenças Associadas ao Manejo
Doenças Geneticamente Transmitidas 
Compreensão Atual da
Maior Complexidade do Binômio 
Infecção x Doença
Leonardo J. Richtzenhain
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Métodos 
de 
Diagnóstico Laboratorial
Leonardo J. Richtzenhain
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Fenotípicas
•Morfologia
•Efeito biológico
•Atividade enzimática
•Estrutura antigênica
Genotípicas
•Estrutura Ácido Nucléico
S. Imune
Imunodiagnóstico
Sorodiagnóstico
R. Humoral
R. Celular
Alergodiagnóstico
Padrão
Padrão
+
+
MÉTODOS DIRETOS
MÉTODOS INDIRETOS
+
Padrão
Ident. Sorológica
Ident. Genotípica
Padrão
Fenotípicas
•Estrutura antigênica 
do Agente
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Professor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)
•Morfologia 
•Atividade biológica
•Atividade enzimática
•Estrutura antigênica (Identific. Sorológica)
Genotípicas (ácido nucléico)
•PCR
•PCR+RFLP
•Seqüenciamento
MÉTODOS DIRETOS
E
E
Regiões 
Codificadoras
ou não
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)
Estrutura antigênica 
•Identificação Sorológica 
Genotípicas (ácido nucléico)
Estrutura Ácido Nucléico
•PCR
•PCR+RFLP
•Seqüenciamento
BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA E GENOTÍPICA
DOS MÉTODOS DIRETOS
Proteína x Proteína
DNA x Proteína
Complementariedade
Complementariedade
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
•Concentração
•Distribuição
Tempo da infecção
Amostra do agente
Grau de imunidade do Hospedeiro
Tropismo
População
VARIÁVEL
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)
Estrutura antigênica
SI
Y
Linf. T
Proteína x Proteína
Complementariedade
Proteína x Proteína
BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA
DOS MÉTODOS INDIRETOS
Sorodiagnóstico
Imunodiagnóstico
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
•Concentração
•Distribuição
Tempo da infecção
Amostra do agente
Grau de imunidade do Hospedeiro
Tropismo
População
VARIÁVEL
SI
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FILOGENIA 
E
REATIVIDADE CRUZADA
Fenotípica e Genotípica
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Charles Darwin
•Conservação de Estruturas Fenotípicas (Antigênicas)
•Conservação de Estrutura Genotípica
Agentes
Próximos
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EHV-1
EHV-4
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Cinomose
Sarampo
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Peste Suína Clássica
Diarréia Viral Bovina
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Panleucopenia Felina
Parvovirose Canina
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Recursos para aumentar
da Especificidade da
Identificação Genotípica
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A B
RFLP genômico
PCRPCR + RFLP
Sequenciamento
Regiões
•Codificadoras
•Não Codificadoras
Escolha
de Regiões
Alvo
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Recursos para aumentar
da Especificidade da
Resposta Imune Humoral
•Identificação Sorológica (produção de soros padrão)
Diagnóstico Direto
•Sorodiagnóstico (pesquisa de anticorpos no soro de animais)
Diagnóstico Indireto
SI
+
Anticorpo 
Monoclonal
Resposta 
Policlonal
Aumento da Especificidade de soros para Identificação Sorológica de Agentes
?
Antígeno usado na imunização
A B
A e B
A e B
A e B
B
SI
Purificação
Ag Recombinante ?
Anticorpo obtido
Cromatografia
Afinidade
+
Anticorpo 
Monoclonal
Resposta 
Policlonal
?
Antígeno usado no Teste
A B
A e B
A e B
A e B
B
Purificação
Ag Recombinante
?
Anticorpos produzidos na infecção natural
SI
Infecção Natural
SI
Competição com Anticorpos Monoclonais
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Aumento da Especificidade no Sorodiagnóstico de Agentes
X
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OS CONTEXTOS
ANALÍTICO
E 
DIAGNÓSTICO 
DE 
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS
Leonardo J. Richtzenhain
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Teste 
CONTEXTO
ANALÍTICO
Teste 
CONTEXTO
DIAGNÓSTICO
Geração
Do
Analito
Detecção
Quantificação
do
Analito Conservaçãodo Analito
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O CONTEXTO
ANALÍTICO
DE
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS 
TRANSMISSÍVEIS
Detecção do Analito
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Procedimento realizado para a
detecção e / ou quantificação
de um
Analito
Conceito de Teste no contexto analítico:
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Natureza bilógica do Analito:
•Substâncias 
ex: colesterol , glicose, anticorpos etc.
•Microorganismos
ex: prions, vírus, bactérias, fungos etc
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Exemplos de ANALITOS
No Diagnóstico de Doenças Transmissíveis
•Vírus 
•Rickettsias
•Bactérias
•Protozoários
•Fungos
•Parasitas
•Resposta Celular
•Anticorpos 
Diag. Direto
Diag. Indireto
Fenotípicas
•Morfologia
•Efeito biológico
•Atividade enzimática
•Estrutura antigênica
Genotípicas
•Estrutura Ácido Nucléico
Fenotípicas
•Estrutura antigênica
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TESTE
Analítico
Geração de 
SINAL
NATUREZA VARIÁVEL E
MENSURÁVEL
SINAL
CLÍNICO
ISOLAMENTO 
VIRAL
QUALITATIVO QUANTITATIVO
+ ou -
CONTÍNUOS DESCONTÍNUOS
•Absorb. ELISA
•Radiação RIA
•Títulos de anticorpos
•2 , 4, 8, 16 etc
Prenhêz
Leonardo J. Richtzenhain
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Sensibilidade Analítica = Quanto do Analito? 
Especificidade Analítica = Quais Analitos?
Características Analíticas
do Teste
Leonardo J. Richtzenhain
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Avaliação da Sensibilidade Analítica de Testes 
[Analito]
+ + + + + + --SINAL
Mensuração Objetiva
Unidades:
•UFC/mL
•DICT50%
•µg Ag/mL
•µg Ac/mL
•µg DNA/mL
Leonardo J. Richtzenhain
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+ + --SINAL
Mensuração 
Subjetiva
A B C D
Arbitrariedade da escolha agentes
com estrutura antigênica ou genotípica
presumivelmente semelhantes
Avaliação da Especificidade Analítica de Testes 
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SENSIBILIDADE ANALÍTICA
•Menor quantidade de elemento em análise que o teste é
capaz de detectar (capaz de gerar um sinal). 
Exemplo: ELISA 0,005 µg/ µL de anticorpos.
IDGA = 30 µg/ µL de anticorpos
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
•Capacidade do teste tem de detectar só o elemento de análise
e não detectar elementos de análise semelhantes. 
Difícil mensuração. 
Exemplo:
RFC diferencia tipos A O e C VFA (+ esp. analítica)
IDGA c/ VIA não diferencia A O e C (- esp. analítica)
Definições
Leonardo J. Richtzenhain
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O CONTEXTO
DIAGNÓSTICO
DE
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS 
TRANSMISSÍVEIS
Geração do Analito
Resultado 
do 
Teste
Qualitativo + ou -
•Presença ou não do Analito
Quantitativo 
•[Analito]
Diagnostica condição
do Hospedeiro
•Infectado x Não infectado
•Doente x Sadio
Geração 
do Analito
Conservação 
do Analito
Detecção 
do Analito
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SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
•Capacidade do teste fornecer um resultado + quando o
indivíduo realmente tem o parâmetro em diagnóstico (%).
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
•Capacidade do teste fornecer um resultado - quando o
indivíduo realmente não tem o parâmetro em diagnóstico (%).
Definições
+ -
Condição do Hospedeiro
Resultado
do
Teste
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
SENS.
diagn.= VP+FN
VP x 100 VN+FP
VN x 100ESPEC.
diagn.=
+ -+ +
- + - -
Infectado/Doente Não Infect./ Sadio
Avaliação da Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Leonardo J. Richtzenhain
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Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Infecção Experimental Referência 
(Gold Standard )
Infectado Controle
Teste
Teste Referência
x 
Teste Avaliado
População
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Infecção Experimental 
Infectado Controle
Teste
Críticas:
•Qual amostra do agente?
•Qual a dose?
•Qual a via?
•Quanto tempo para testar?
•Como estabelecer o controle?
Leonardo J. Richtzenhain
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Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica
Referência 
(Gold Standard )
Teste Referência
x 
Teste Avaliado
Crítica:
•O teste em avaliação pode ter
maiores Sensibilidade e Especificidade
Diagnósticas que o de Referência
Ex: IBR em sêmen
Isolamento x PCR
Leonardo J. Richtzenhain
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CONTEXTO
ANALÍTICO
CONTEXTO
DIAGNÓSTICO
Diagnostica Parâmetro:
Infectado, Doente
•Sen.Diag.= Infectado / Doente e o teste foi + (%)
•Esp.Diag = N.Infectado/Sadio e o teste foi - (%)
•Sen.Anal.= Quanto de Analito detecta?
•Esp.Anal.= Detecta Analitos semelhantes?
Reagentes
Imunoreagentes
Animais
Células
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CONTEXTO
ANALÍTICO
CONTEXTO
DIAGNÓSTICO
Diversos Fatores
Interferem na
Geração da
[Analito] 
Diversos Fatores
Interferem na
Detecção da
[Analito] 
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
FP
FN •Sensibilidade analítica insuficiente 
• Especificidade analítica insuficiente
(reações cruzadas)
ANALÍTICO (detecção) DIAGNÓSTICO (geração)
•Reagentes e equipam. c/ problemas
•Conservação inadequada do analito
•Tempo da infec.(antígeno / resposta imune)
•Imunodepressão / Imunotolerância
•Gama de agentes com Reação Cruzada
na região
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Testes de Alta Especificidade Analítica 
Tendem a apresentar
Alta Especificidade Diagnóstica
Testes de Baixa Especificidade Analítica 
Tendem a apresentar
Baixa Especificidade Diagnóstica
Testes de Alta Sensibilidade Analítica 
Tendem a apresentar
Alta Sensibilidade Diagnóstica
Maior risco de amplificar 
reações cruzadas e ruídos
Testes de Baixa Sensibilidade Analítica 
Tendem a apresentar
Baixa Sensibilidade Diagnóstica
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
Reflexos da 
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica
dos Testes
nos diferentes momentos do
Controle de Doenças
SENSIBILIDADEDIAGNÓSTICA
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
+ -
Resultado
do
Teste
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
SENS.
diagn.= VP+FN
VP x 100 VN+FP
VN x 100ESPEC.
diagn.=
Sem título mínCom título mín
Condição do Hospedeiro
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
+ -
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
Valor Preditivo + =
VP + FP
VP
x 100
Sem título mínCom título mín
Melhora-se o VP+
Diminuindo FP
Com o aumento da 
Espeficidade.
Resultado
do
Teste
Condição do Hospedeiro
VP + = 47/142 x 100= 33,1% VP+ = 190/270 x 100= 70,37%
INFLUÊNCIA DA PREVALÊNCIA NO VALOR PREDITIVO +
100050 950
47
3
95
855
142
858
Condição
+
+
-
-
RES.
TESTE
TOTAL
TOTAL
P= 5% S= 95% E= 90%
1000
+
+
-
-
TOTAL
TOTAL
P= 20% S= 95% E= 90%
190 27080
10 720 730
200 800
RES.
TESTE
Condição
+ -
Situação real
Resultado
do
Teste
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
FN
VP
VP VN
FN
FP
FP
VP+ =
Alta
Prevalência
Baixa
Prevalência
VP
VP + FP
Saída Menor Prevalência =
Teste mais Específico
Mesmo Teste
Sens.Diag.
Esp. Diag.
VN
Leonardo J. Richtzenhain
Professor Titular – FMVZ/USP
OBRIGADO PELA ATENÇÃO!