RELATORIO AULA PRATICA IMUNOHISTOQUÍMICA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E ESTRUTURAL APLICADAS
AULA PRÁTICA:
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA PCNA (PROLIFERAÇÃO CELULAR)
LAYS OLIVEIRA ROCHA
METODOLOGIAS LABORATORIAIS APLICADAS À BIOLOGIA CELULAR
22 de novembro de 2017
Profa. Dra. Daniele Lisboa Ribeiro
Introdução: 
Imuno-histoquímica (IHQ) é a identificação de epítopes no tecido através da reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), revelada por um marcador visual e examinada à microscopia óptica e/ou eletrônica. A Imunohistoquímica é largamente utilizada no diagnóstico e prognóstico do câncer. Vários anticorpos são utilizados para o diagnóstico das mais específicas situações. Porém, nesse experimento, utilizamos o PCNA. 
Objetivos:
Este método de diagnóstico é amplamente usado para diagnosticar células anormais, como por exemplo, as encontradas em neoplasias. Existem marcadores específicos moleculares que caracterizam acontecimentos celulares particulares, como, por exemplo, proliferação ou apoptose. A IHQ também é muito utilizada na pesquisa básica que visa compreender a distribuição e localização de diversos biomarcadores e proteínas expressas em várias partes do organismo. A observação de uma interação antígeno-anticorpo pode ocorrer de diferentes formas. O que mais ocorre é um anticorpo conjuga-se com uma enzima, que por sua vez, irá catalisar uma reação que irá gerar coloração. O objetivo do experimento então, é analisar a proliferação celular, por meio de imunomarcação com PCNA, nas células cancerígenas de uma amostra de próstata.
Materiais utilizados: 
Uma próstata com câncer foi fixada em formol e emblocada em parafina e submetida a cortes no micrótomo e estendida em lâmina de vidro previamente limpa e silanizada. Inicialmente as lâminas foram desparafinadas em 3 banhos de xilol durantes 15 minutos cada. A seguir, um banho em álcool 100% de 3 minutos cada e reidratados em cadeia descendente de álcool 95%, 85% e 70% sendo 1 minuto cada e por fim, lavado em água. 
Os cortes foram submetidos ao tratamento em banho-maria para recuperação antigênica. Essa etapa foi realizada colocando as amostras em uma panela vapor (92°C) com tampão citrato de pH 6,0 por 20 minutos. O material então foi deixado para resfriar em temperatura ambiente por 10 minutos. 
Em seguida, foi feito o bloqueio de peroxidade endógena tecidual, por meio de uma passagem de 15 minutos em solução de água oxigenada 3% em metanol no escuro, para não perder a fluorescência e depois lavado em PBST três vezes de 5 minutos cada. 
Após esse procedimento, realizou-se o bloqueio de interações inespecíficas de proteínas. Foi utilizado o background sniper em 10 minutos e depois lavado em PBST(detergente tween) em 3 vezes de 5 minutos cada. Essa etapa é importante pois ela retira o que não foi ligado, aumentando a afinidade da ligação. 
As secções teciduais foram submetidas à incubação do anticorpo primário mouse anti-human PCNA em concentração 1:100 em solução tampão BSA 1%. Essa incubação durou 1,5 hora em temperatura de 37°C. 
Após lavar em PBST 3 vezes de 5 minutos cada, os cortes receberam de 30 a 50 microlitros em cada lâmina, o anticorpo secundário de amplifier mouse e rabbit (Hidef Cell Marque) em solução pronta para uso, por um período de 10 minutos, sendo lavados em seguida em tampão PBST por três vezes, 5 minutos cada. Logo após, foi gotejado sobre a lâmina, 30 a 50 microlitros do complexo polímero-HRP pronto para uso, durante o tempo de 10 minutos e em seguida lavados com tampão PBST por três vezes, 5 minutos cada.
Para a revelação da reação, foi utilizado o cromógeno “Kit DAB” (Diaminobenzidina 3,3’) previamente preparado conforme recomendações do fabricante. Os cortes receberam o cromógeno (35µl) em 1 ml de solução tampão, já com água oxigenada. O primeiro tempo de revelação foi marcado e repetido nas demais lâminas. 
A seguir, visualizamos as lâminas no microscópio e percebemos que não houve uma boa coloração e tentamos realizar uma contra coloração com hematoxilina para tentarmos visualizar com maior riqueza de detalhes e mesmo assim não foi suficiente. 
Para finalizar a aula prática, a lâmina foi desidrata em concentrações decrescentes de álcool (80%, 95%, 100% e 100%) por 1 minuto cada e em seguida clareados com 3 banhos de xilol de 10 minutos cada.