Marcadores moleculares de DNA

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MARCADORES MOLECULARESDE DNAMarcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA expresso ou nãoQuando o comportamento do marcador segue as leis de herança de Mendel, pode ser definido como marcador genético
MARCADORES RFLP (Polimorfismo no Comprimento dos Fragmentos de Restrição)Polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA por meio do uso de enzimas de restriçãoPossuem expressão co-dominanteO número de marcadores no genoma é ilimitadoO nível de polimorfismo alélico em cada loco é grandeResultam de mutações na molécula de DNA
Auto-radiografia de uma membrana de hibridização revelando marcadores RFLP. Indivíduos homozigotos para o alelo A1 (3,5,6,7,8 e 9) e homozigotos para o alelo A2 (1,2, e 4) de um loco RFLP
Padrão de restrição do produto de amplificação de um segmento de 350 pbdo gene da κ-caseína (bovino) digerido com a enzima de restriçÃo HinfI1. Controle negativo da reação de PCR2. Produto de amplificação não digerido3 e 5. Produto da digestão de heterozigotos AB4 e 7. Produto da digestão de homozigotos AA6. Produto da digestão de homozigotos BB8. Padrão de tamanho ØX174RF-HaeIII
BLAD
BLAD (Deficiência na adesão de leucócitos embovinos)Ocorre em homozigotos recessivos, os quais raramentesobrevivem
Permitem encontrar associações entre marcadores e genes que controlam um caráter de interessePermite identificar genótipos homozigotos e heterozigotosMuitos dos locos marcadores descritos são dialélicos, limitados para o mapeamento genético A presença de alelos raros faz com que muitas populações apresentem padrão monomórfico
MARCADORES MINISSATÉLITESConsistem de pequenas sequências idênticas (unidade de 5 a cerca de 100 pares de bases) que se repetem lado a lado O DNA dos indivíduos é clivado com enzimas de restrição, separado por eletroforeseOs padrões de múltiplas bandas obtidos constituem oschamados “DNA fingerprints” e permitem discriminarindivíduos e estabelecer graus de parentesco e endogamia
Auto-radiografia de locos minissatélites mostrando o alto polimorfismo encontrado nestes locos, o que justifica a extensa aplicação em estudos genéticosO complexo padrão de bandas visualizado mostra o conceito de fingerprint de DNA
Amostragem de diversas regiões do genoma simultaneamenteO padrão de bandas produzido corresponde a todos os alelos de todos os locos detectados Impossível identificar os alelos correspondentes a cada locoQualificam-se para identificação de indivíduos e verificação de casos de paternidade, mas não são tão úteis em mapeamento genético ou testes de ligação gênica entre marcadores e genes de interesse
MARCADORES MICROSSATÉLITESConsistem de pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas lado a ladoAltamente polimórficos (em eucariotos formam locos genéticos mais polimórficos do que os minissatélites)Multialélico e de grande conteúdo informativoCada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco 
Regiões microssatélites de DNA
AGCTTTCGCACACACACACATTATGTACCC
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AGCTTTCGCACACACACACACATTATGTACC
TCGAAAGCGTGTGTGTGTGTGTAATACATGG
Regiões contendo sequências simples repetidas são amplificadas por meio de PCR (de locos específicos) utilizando-se um par de primers específicosDetecção em gel de eletroforese A análise consiste no PCR de vários locosPossuem expressão co-dominante, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados
Base genética e detecção de polimorfismo de microssatélite A e B: Genótipos homozigoto e heterozigoto para uma região genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA)/(GT) Alelo (CA10)Alelo (CA10)Alelo (CA13)Alelo (CA15)CA13/CA15
CA10/CA10
Base genética e detecção de polimorfismo de microssatéliteGel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos (banda única) e heterozigotos (duas bandas) em indivíduos diplóidesA. CA10/CA10B. CA13/CA15C. CA12/CA12D. CA10/CA15E. CA12/CA13F. CA12/CA18G. CA13/CA13H. CA17/CA17I. CA18/CA18J. CA10/CA13
Alelos do microssatélite CSFM50 (cromossomo 2 dos bovinos) revelados por auto-radiografia de produtos de PCR. M=marcador de tamanho a intervalos de 10 pb
Microssatélite
Análise de DNA microssatélites por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com marcação radioativa ou por coloração pela prata
Elevado conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) A análise de vários locos permite estabelecer relações de paternidade e identificação personalizadaCompleta cobertura de qualquer genoma eucariotoIdeais para mapeamento genético, identificação e discriminação de genótipos e estudos de genética de populaçõesAdmite-se que existam microssatélites próximos a regiões cromossômicas que influenciam a variação das características quantitativas, os QTLs* QTL (Loco de Característica Quantitativa)
Ilustração e interpretação de casos analisados por testes de DNANecessidade de identificação do vínculo genético em animais domésticosObter padronização racialEvitar e detectar fraudes no registro genealógicoAcompanhamento do melhoramento genético
Exemplo de Identificação IndividualIdentificação do animalNome: RG:Raça: QM Sexo: F Cor: Zaino Rec: 20/12/2013 Proprietário: RESULTADOSSolicitante: ABQMCaso: LG 179 Data: 15/01/2014Amostras: PêloResponsável pela coleta e identificação: Marcador ProdutoASB 17 ORVHL 20 IHTG 10 ORHTG 4 KMAHT 5 KNAHT 4 HHMS 3 IHMS 6 PHMS 7 JMLEX 3 PLEX 33 LQASB 2 KASB 23 IK
Exemplo de Teste de PaternidadeAnálise de marcadores genéticos em equinos por amplificação de regiões polimórficas de DNAConclusõesCaso: LG 179c RESULTADOS ALINHADOSData: 15/01/2014 Amostras: Pêlo ANIMAL A ANIMAL B ANIMAL CMARCADORASB 17 NR OR FOVHL 20 I I IMHTG 10 OR OR RHTG 4 K KM MAHT 5 K KN JNAHT 4 HJ H HHMS 3 I I IPHMS 6 P P PHMS 7 LM JM JNLEX 3 HP P MPLEX 33 MQ LQ LASB 2 KO K KASB 23 IL IK KAnimal B se qualifica como cria de Animal A e Animal C
Exemplo de Teste de MaternidadeAnálise de marcadores genéticos em equinos por amplificação de regiões polimórficas de DNARESULTADOS ALINHADOSConclusõesCaso: LG 174c Data: 07/01/2014 Amostras: Pêlo ANIMAL A ANIMAL B ANIMAL CMARCADORASB 17 * MN NRVHL 20 * LN LMHTG 10 * MO MHTG 7 * NO NHTG 4 * KP KAHT 5 * KN KNAHT 4 * HJ HKHMS 3 * IP IPHMS 6 * LM MHMS 7 * LO JOHMS 1 * JM JKLEX 3 * KL LMLEX 33 * LM MASB 2 * O OQCA 425 * JN NAnimal A – Amostra não disponívelAnimal B qualifica como cria de Animal C independente do pai considerado 
Exemplo de Exclusão de PaternidadeAnálise de marcadores genéticos em equinos por amplificação de regiões polimórficas de DNACaso: LG 177c RESULTADOS ALINHADOSData: 15/01/2014Amostras: Pêlo ANIMAL A ANIMAL B ANIMAL CMARCADORASB 17 NR HM HQVHL 20 I L ILHTG 10 OR OR MRHTG 4 K M MAHT 5 K O NOAHT 4 HJ O HOHMS 3 I M MHMS 6 P P PHMS 7 LM N NOLEX 3 HM LM LPLEX 33 MQ Q MQASB 2 KO IR QRASB 23 IL JK KUAnimal B possui ASB 17-M, LEX 3-M, ASB 2-I e ASB23-J não presentes no Animal C ou Animal A sendo assim excluído como cria deste parAinda mais, Animal A é excluído como pai de Animal B nos sistemas ASB 17, VHL 20, HTG 4, AHT 5, AHT 4, HMS 3, HMS 7, LEX 3, ASB 2 e ASB 23, independente de mãe consideradaAnimal B qualifica como cria de Animal C independente do pai considerado
MARCADORES RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso) Utiliza primers únicos, mais curtos e de sequência arbitráriaBASE GENÉTICADuas sequências de DNA complementares ao primerdevem estar suficientemente adjacentes e em orientação opostaVisualização em gel de agarose ou em géis de poliacrilamida de alta resolução Cada primer dirige a síntese de vários segmentos de DNA simultaneamente em diversos pontos do genoma, resultando em várias bandas no gel (fingerprints genômicos)
Primer 5’ AGTA 3’5’ AGTA 3’ 3’ATGA 5’3’ TCAT 5’ 5’ TACT 3’ BASE GENÉTICA DOS MARCADORES RAPD
A BA 1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 - 472 3 516Inserção BBandas polimórficas472 3 516 DeleçãoMutação pontualBASE GENÉTICA DOS MARCADORES RAPD
APLICAÇÕES DOS MARCADORES RAPDAnálise da estrutura e diversidade genética em populações naturais ou de melhoramento e em bancos de germoplasmaEstabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre diferentes espéciesConstrução de mapas genéticos Localização de genes de interesse econômico
NATUREZA MOLECULAR DOS LOCOS RAPDMutações de ponto em sítio de iniciação e deleções ou de inserções de sítios de iniciação (não amplifica)Polimorfismo genético tem natureza binária (banda presente ou ausente)Distribuídos ao acaso ao longo do genomaSequências internas dos segmentos amplificados pode pertencer a sequências de cópia única ou altamente repetitivasComportam-se como dominantesAA e Aa: amplificação com banda presente (mesma classe fenotípica)aa: não amplificação e ausência de banda (fenótipo nulo)
Marcadores RAPD (mutação pontual) Mutação pontualsem pareamentoSem produtoa b BandaPolimórficaProduto de PCR
VANTAGENS DOS MARCADORES RAPDEficientes no mapeamento de polimorfismos ligados a locos de resistência a doençasEficientes em tempo e mão-de-obra e custo mais baixoNão requer desenvolvimento prévio de biblioteca de sondas específicas ou marcação radioativaNecessita quantidade mínima de DNAGera grande quantidade de polimorfismoAdequado para construção de mapas genéticos ao nível intra-específico
600 pb - J-20
RAPD inter-específico de Eimeria
600 pb - E. acervulina E. tenella E. maxima
RAPD intra-específicode Eimeria
LIMITAÇÕES DOS MARCADORES RAPDBaixo conteúdo de informação genética por loco, apenas um alelo é detectado Algumas bandas são fácil e claramente interpretadas, enquanto que outras são ambíguas O uso de marcadores RAPD para análises filogenéticas, fingerprinting e determinação de paternidade deve ser criterioso
SEXAGEM DE AVES MONOMÓRFICAS POR PCREm aves monomórficas não há dimorfismo (diferençasvisíveis) entre machos e fêmeasO monomorfismo pode ocorrer antes da maturidadesexual (curiós) ou ao longo de toda a vida (papagaios)Arara-azulArara-canindéTucano-preto CardealPapagaio-congo Papagaio-verdadeiroCurió
APLICAÇÕES DA DETERMINAÇÃO DO SEXOProteção de espécies silvestres ameaçadas de extinçãoEscolha de aves para acasalamento e venda de filhotes emcriatórios de aves ornamentaisEscolha de aves de produção para formação de matrizespara reprodução
MÉTODOS DE SEXAGEM INCLUEMCariotipagemEm aves o sexo homogamético é o masculino (ZZ) e o heterogamético, o feminino (ZW)Amostras de células vivas metafásicas para a análise de cariótipoMétodo lentoNem sempre as metáfases permitem análise do cariótipoAnálise de hormônios esteróides nas fezesFêmeas têm razões estrógeno/testosterona maiores do que machosAnálise realizada após a maturidade sexualAs fezes devem ser frescas
LaparoscopiaVisualização das gônadas por meio de incisão cirúrgica e introduçãodo laparoscópioMétodo invasivo, embora bastante seguroNão deve ser método de escolha em espécies ameaçadas de extinçãoGônadas de animais imaturos sexualmente apresentam visualizaçãomais difícilSexagem por DNADNA fingerprintingVisualização de bandas em Southern blots hibridizadas com sondas de sequências minissatélites e autorradiografiaRequer grande quantidade de DNA e mão de obra especializadaMétodo lento e caro, com aplicação limitada a alguns pscitacídeos
Sexagem por PCRMétodo preferido, que pode ser realizada por meio de amostras de sangue e penasUtilizado com uma precisão superior a 99%O sexo aviário é determinado pela amplificação por PCR de umaregião do intron do gene CHDO gene CHD possui uma cópia no cromossomo Z e outra no W (CHD-Z e CHD-W)O intron presente no cromossomo W é ligeiramente maior do que o do Z
PCR do gene CHD (sexagem de aves)Banda de maior tamanho(W)Banda de menor tamanho (Z)Interpretação da PCR1 banda: macho2 bandas: fêmeaZZ ZW OO +O+O
Perfil eletroforético do PCR de sexagem1 Padrão de tamanho: 100pb2 Macho3 Macho4 Fêmea5 Fêmea6 Controle sem DNA 1 2 3 4 5 6600 -100 -pbPCR do gene CHD (sexagem de aves)
PCR do gene CHD (sexagem de aves)VantagensRequer quantidades pequenas de DNA Aplica-se à maior parte das espécies de avesNão invasivoRapidez e simplicidadeNão depende da maturidade sexual da aveDesvantagensNão se aplica a espécies que não apresentem diferençasem seus cromossomos sexuaisRequer cuidados para se prevenir contaminação com produtos pré-amplificados
SEXAGEM DE EMBRIÕES BOVINOS POR MEIO DE PCR A produção de embriões in vitro (PIV) de mamíferos domésticos de interesse econômico permite a geração de grande número de embriões e incluiMaturação in vitro (MIV)Fecundação in vitro (FIV) Cultivo in vitro (CIV)
Em bovinos, a técnica de FIV possibilita melhor aproveitamento do potencial reprodutivo dos rebanhos, diminuindo o intervalo entre gerações e acelerando o melhoramento genético animalAliada à técnica de transferência de embriões, permite aumentar a vida reprodutiva de animais de alto valor genéticoO controle da proporção dos sexos nas espécies domésticas é de grande interesse comercial para a agropecuária É interessante o nascimento de grande número de terneiros do sexo feminino em raças com aptidão leiteira, e do sexo masculino em raças com aptidão para corte
O DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA DE PCR POSSIBILITOU UM GRANDE AVANÇO NA ÁREA DA SEXAGEM DE EMBRIÕESA sexagem de embriões através de PCR é rápida, simples e apresenta uma eficácia de mais de 90%A técnica é utilizada para amplificar e detectar DNA específico do cromossomo Y, presente somente nas células dos embriões do sexo masculinoDados da literatura demonstram que a porcentagem de embriões sexados por citogenética é de 81% e que, por intermédio da técnica de detecção do antígeno H-Y, 88%
Sexagem por PCR Alíquotas das amostras contendo os embriões são acrescidas de dNTP(A, T, C e G), MgCl2, tampão de PCR e Taq DNA polimerase e de dois pares de primersO primeiro par de primers deriva-se da sequência BC1.2, específica do cromossomo Y bovinoBC1.2 5’ - ATC AGT GCA GGG ACC GAG ATG-3’ BC1.2 5’ - AAG CAG CCG ATA AAC ACT CCT T3’O segundo par, específico para regiões autossômicas bovinas, a sequência microssatélite 1.715, pode ser utilizado para controle interno das reações1.715 5’ - TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT - 3’ 1.715 5’ - TCG TGA GAA ACC GCA CAC TG – 3’
AMPLIFICAÇÃO EM TERMOCICLADOR POR 30 CICLOSDesnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 56ºC por 1 minuto e extensão a 72ºC por 1 minutoAo final, as amostras permanecem incubadas a 72ºC por 10 minutos, para a extensão final do DNAVISUALIZAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNAAlíquotas dos produtos de PCR são submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamidaApós a eletroforese, os géis são imersos em solução corante de brometo de etídioANÁLISES DOS GÉISTransiluminador de luz ultravioleta
INTERPRETAÇÃO DAS BANDAS NO GELFêmea: apenas um fragmento de 216 pares de bases, referente à sequência satélite 1.715Macho: dois fragmentos de DNA, referentes à sequência BC1.2 (196 pares de bases) e à sequência microssatélite 1.715 (216 pares de bases)(M) marcador de peso molecular em escada de 100 pares de bases; (1) DNA deleucócitos de bovino fêmea; (2) DNA de leucócitos de bovino macho; (3) DNA de embrião bovino fêmea; (4) e (5) DNA de embrião bovino macho; (6) e (7) controles negativos sem DNA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DOENÇAS HEREDITÁRIAS DOS ANIMAIS DOMÉSTICOSDoenças hereditárias resultam de mutações no DNA e sãotransmitidas para a progênieBase genética dos marcadores de doençashereditáriasUm marcador molecular de uma doença genética é qualquer segmento específico de DNA (expresso ou não) que apresente uma associação com a ocorrência do alelomutado
8 17 a b c d e 13 f g h i j k l mM D D D D D D D S S S S S S D S S MM Escada alélicaS SadioD Doente 8 x 17 8 x 13 f x gF2F1(CA)20 -(CA)19 -(CA)18 -(CA)17 -(CA)16 -Identificação de marcadores molecularesassociados a doenças hereditáriasA base genética da associação é ditada pelaligação entre o segmento do marcador e o alelo (a ligação pode ser estabelecida por meiode estudos de segregação)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M S S S S S S S D S S S S S S S S D S MM Escada alélicaS SadioD Doente(CA)20(CA)19(CA)18(CA)17(CA)16 Análise de um microssatéliteInterpretação: Parece haver uma relação entre homozigose do alelo (CA)16 e a doença
EXEMPLOS DE MARCADORES MOLECULARES PARA USO EM VETERINÁRIAMarcadores para Produção AnimalKappa caseína no leite ruminantesLactoglobulina no leite de ruminantesMiostatina (bovinos Belgian Blue)QTL para produção de leite (bovinos Holandês)Hormônio do crescimento (bovinos de leite)QTL para presença de chifresGenes para cor da pelagem (bovinos Angus)
Marcadores para Reprodução AnimalSexagem de embriõesReceptor de estradiol (suínos)Hormônios protéicos e receptores Detecção de Doenças GenéticasBLAD Deficiência de Adesão de leucócitos bovinos (bovinos Holandês)DUMPS Deficiência da Uridina Monofosfato Sintase (bovinos Holandês)HYPP Paralisia Periódica Hipercalêmica (equinos Quarto de Milha)Síndrome do Estresse Porcino - PSS (suínos)Deficiência Fator VIII da coagulação (cães)
Detecção de doenças infecciosas e parasitáriasLeptospiroseBruceloseTuberculoseViroses diversas como Gumboro, Raiva e NewcastleLeshimaniose em cães