Clonagem de genes DNA recombinante

Prévia do material em texto

CLONAGEM DE GENES
Conjunto de técnicas utilizadas para a produção in vitrode moléculas híbridas de DNA, provenientes de diferentes origens, denominadas DNA recombinante* Este produto (DNA recombinante) pode ser introduzido em células vivas, replicando-se e originando milhares de cópias idênticas chamadas clones recombinantesENGENHARIA GENÉTICA
Pesquisa básicaDiagnósticoProdução de vacinasProdução de proteínas de uso terapêuticoAlteração das características animais e vegetais destinados à produção ou pesquisaAplicações da Engenharia Genética
Sistemas de restrição-modificaçãoVetores de clonagemEnzimas que modificam o DNA: ligases, polimerases e polinucleotídeo quinasesMétodos de transformação de células procarióticas e eucarióticasDesenvolvimento da clonagem gênica
Bactérias possuem um padrão próprio de metilação das bases de seu DNA devido a ação de enzimas denominadas metilases de modificação* O DNA de outra espécie, apresentando um padrão de metilação diferente, ao entrar na célula bacteriana, será digerido por enzimas denominadas endonucleases de restriçãoSistemas de restrição-modificação
5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’Exemplo: 5’ G3’ CTTAA AATTC 3’G 5’Enzimas de restriçãoCada enzima de restrição reconhece uma pequena seqUência específica, contendo geralmente 4 a 10 pares de basesSe o sítio de clivagem não estiver modificado (metilado), ocorre a clivagem de ambas as fitas
Enzimas de restriçãoClivagem gerando extremidades cegasClivagem gerando extremidades coesivas
Constituídos de ácido nucléico (plasmídeos ou vírus), utilizados para carrear uma sequência de DNA exógeno com a finalidade de replicá-la em grande quantidade, trasncrevê-la em um RNA ou expressar seu produto protéicoApresentam replicação autônoma na célula hospedeiraApresentam sítios de clivagem únicos e adjacentes para várias enzimas de restriçãoContêm marcadores genéticos de seleção, geralmente genes de resistência a antibióticosVetores de clonagem
Coleção randômica de fragmentos de DNA, ligados a moléculas de um vetor, que abrangem, em seu conjunto, toda a informação genética de uma espéciePodem ser de dois tipos: Genômica: o DNA do organismo é fragmentado e ligado diretamente ao vetorcDNA: o mRNA purificado do organismo é utilizado como molde para a síntese de um DNA de dupla fita, denominado DNA complementar ou cDNA, o qual é ligado ao vetorBiblioteca de genes
cDNA
Ligando fragmento de DNA a molécula de um vetor
Clonagem gênica em plasmídio bacteriano
Seleção de bactériascontendo vetorCultivo em meio de cultura contendo o antibiótico de seleção * Somente bactérias contendo o vetor com o gene de resistência crescem no meio
Identificação de bactérias contendo vetores recombinantesMarcadores citoquímicosSistema pUC18/E. coli na presença de X-gal: colônias recombinantes brancas e não recombinantes azuisSeleção dos clones de interesse (“screening”)
Seleção dos clones de interesse (“screening”)Utilização de anticorpos (SELEÇÃO BASEADA NA EXPRESSÃO DO PRODUTO PROTÉICO)* As colônias bacterianas são replicadas, transferidas para membranas de nitrocelulose, lisadas e os filtros são incubados com soros para a detecção das colônias produtoras da proteína de interesse Seleção de clones contendo o gene de interesseUtilização de sondas de DNA (SELEÇÃO BASEADA NA SEQUÊNCIA DO FRAGMENTO CLONADO)* As colônias bacterianas são replicadas, transferidas para membranas de nitrocelulose, lisadas e os filtros são incubados com sondas de DNA marcadas com radioisótopos ou com substâncias quimioluminescentes
Utilização de sondas de DNA (SELEÇÃO BASEADA NA SEQUÊNCIA DO FRAGMENTO CLONADO)
Clonagem gênica em vírus
Caracterização do gene Determinação do número de cópias Determinação do arranjo genômicoSequenciamento do geneCaracterização dos transcritosCaracterização do produto protéicoDeterminação da funçãoRegulação da expressão gênica