Biotécnicas aplicadas a reprodução animal Cap. 12

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apresentamumpadrãodepareamentoespe-
cíficodeformaqueumapurinaestásempre
pareadacomumapirimidina.Assim,estão
semprepareadasaadeninacomatiminaea
guaninacoma citosina.Os doisfIlamentos
dahélicedeDNA separam-sequandoaspon-
tesdehidrogêniosãorompidas.Issopodeser
obtidoatravésdoaquecimentodasoluçãode
DNA, oupelaadiçãodeácidoouálcalipara
ionizarsuasbases.O desenrolamentodadu-
plahéliceéchamadodedissociação,oufusão
(doinglêsmelting)eocorreabruptamenteem
umadeterminadatemperatura.A temperatura
dedissociação(Tm- doinglêstemperatureof
melting)é definidacomoa temperaturana
qualmetadedaestruturadeduplahélicedo
DNA é desfeita.Essatemperaturadepende
da composiçãode basesda cadeiajá que
moléculasdeDNA ricasemparesdebaseG-
C temumaT maisalta.m
Uma característicamarcantedasmolé-
culasdeDNA deocorrêncianaturaléo seu
comprimento.As moléculasdeDNA devem
sermuitolongasparacodificarograndenú-
merode proteínaspresentesnum organis-
mo,mesmonascélulasmaissimples.A repli-
caçãodo DNA é feitapor uma interação
complexaecoordenadademaisde20proteí-
nas.Dentreessas,tempapelfundamentala
DNA polimerasequecatalisaa adiçãogra-
, dualdeunidadesdedesoxirribonucleotídeos
à cadeiade DNA. A replicaçãodo DNA é
semiconservativa.Umanovacadeiaéforma-
daàpartirdeumfIlamentodamoléculaori-
ginal,o qualservedemoldeparaa síntese
deumnovofragmento.
O DNA nos cromossomoseucarióticos
estáfortementeligadoapequenasproteínas
básicaschamadashistonas.Essasproteínas
constituemcercade metadeda massados
cromossomoseucarióticos,sendoa outra
metadedeDNA. O materialcromossômico
nucleoprotéicoé chamadode cromatina.
Esta é constituídade unidadesrepetidas,
cadaumacontendoaproximadamente200
pb (paresdebases)deDNA associadosàs
histonas.Porsuavez,essasunidadesrepeti-
dassãodenominadasnucleossomos.A maior
partedoDNA cromossômicoenvolveexter-
namenteum cernedehistonas,enquantoo
restante,denominadoligante,unenucleosso-
mosadjacentesecontribuiparaaflexibilida-
dedafibradecromatina.Assim,umafibrade
cromatinaéumacadeiaflexíveldenucleosso-
mos,quelembraadisposiçãodascontasde
um colar(Figura12.1).
Histona 2A, 26 3 e 4
Histona H1
- -
Figuro 12. 1.
Gemede8 moléculasde
Histona
Esquemadeumaregiãodocromatinaconten-
do umnucleossomo.A duplohélicede DNA
lemazul)estáenrolado00 redordooctômero
de histonas.A histona1 ligo-seà parteexter-
nodestapartículae 00 DNA ligante.
O enrolamentodo DNA aoredordeum
nucleossomocontribuiparasuacompactação,
diminuindosuaextensãolinear.A taxade
compactaçãodonucleossomoédecercade
sete,no entanto,oscromossomosmetafási-
cosdosmamíferosapresentamumataxade
compactaçãode 104queé obtidapelafor-
maçãodeumadisposiçãohelicoidal.O dobra-
mentoemalçaforneceacompactaçãoadicio-
nal.Oscromossomoseucarióticossãomaio-
rese têmum graumaiscomplexodeorga-
nizaçãoestruturaldoqueosprocaríóticos.Os
263
genomasdasleveduras,moscasdasfrutase
bovinoscontêmcercadequatro,quarentae
milvezesmaisDNA, respectivamente,queo
genomadeEscherichiacoli.Essaabundância
dotaos eucariontesde potencialidadesque
estãoausentesnos procariontese adiciona
desafiosà replicaçãoeà expressão.
MétodosUtilizadosno Mapeamento
dosGenes
Um mapagenômicodescreveaordeme
o espaçamentodemarcadoresdeDNA (ge-
neseseqüênciasidentificáveisdeDNA) en-
tresi,emcadacromossomoepodeapresen-
tardiferentesníveisderesolução.Numare-
soluçãomaisbaixa,temoso mapadeliga-
çãoquedescreveaslocalizaçõescromossô-
ricas relativasdemarcadorespor meiode
seuspadrõesdeherança.Qualquercaracte-
rísticafísicaoumolecularcomherançamen-
delianaequesejadiscriminávelentreindiví-
duospodeserconsideradoummarcadorge-
néticoempotencial.Marcadorespodemser
produtodeexpressãodegenesousegmentos
deDNA não-codoficante,mascujopadrão
deherançapodeserdefinido.As diferenças
emseqüênciasdeDNA sãomarcadoreses-
pecialmenteúteisporseremabundantes,de
caracterizaçãoprecisae relativamentefácil.
Quanto maisvariáveis(polimórficos)os
marcadores,maisúteisnomapeamento.Em
outraspalavras,formasalternativastêmque
existirentreindivíduosde modoqueesses
possamserdiscriminadosentrediferentes
membrosdeumgrupoestudado,oqualpode
serumafamília,população,raçaoumesmo
umaespécie.
O mapadeligaçãodeumaespécieécons-
truídoatravésdaobservaçãodequãofreqüen-
tementedoismarcadoressãoherdadosjuntos.
Doismarcadoreslocalizadospróximosumao
outro,no mesmocromossomo,temgrande
probabilidadedeserempassadosjuntosdepai
parafilho. No entanto,ocasionalmenteos
cromossomosdeumparsubmetem-seaum
processodenominadorecombinação(doin-
glêscrossing-over).Quandoissoocorre,mes-
momarcadoresrelativamentepróximospo-
demserseparados.A probabilidadedeque
issoocorraémaiornaproporçãoemqueos
doismarcadoresestejammaisdistantesno
cromossomo.No mapagenéticoasdistâncias
entreos marcadoressãomedidasemcenti-
morgans'(cM). Dois marcadoressãoditos
separadospor 1cM quandoataxaderecom-
binaçãoéde 1%.Umadistânciagenéticade
1cM éaproximadamenteigualaumadistân-
ciafísicade 1milhãodepb (1 Mb).
Existemdiferentestiposdemapasfísicos,
variandono seugrauderesolução.O mapa
cromossômico,tambémdenominadocitoge-
nético(Figura12.2),ébaseadono distinto
padrãodebandasobservadasno microscó-
pioóticodecromossomoscorados.Diferen-
tesestratégiastêmsidoempregadasutilizan-
dotécnicasdebiologiamolecularbuscando
mapascomumaresoluçãomaisfma.O mapa
físicodemaisaltaresoluçãoconsistenose-
quenciamentocompletodasbasesquecom-
põem cadacromossomodeum genoma.
Outroaspectobastanteinteressanteéque
o mapeamentodeváriosgenesemdiferentes
espéciestemreveladoaexistênciaderegiões
dehomologiamuitoconservadasdurantea
escalaevolutiva.O cromossomoX dosmamí-
ferosé altamenteconservadoentreasespé-
cies,permitindomapearregiõesporhomolo-
gia.O mapeamentodegenesautossomosho-
mólogosderatosehomemtemtambémreve-
ladoconservaçãodessessegmentosemrela-
çãoa outrasespécies,aindaqueemmenor
graudoqueocorrecomo cromossomoX.
MarcadoresMoleculares
O conhecimentodavariabilidadegené-
ticatemumpapelfundamentalemnossa
* unidadede recambinaçãocujonomeé homenagemaogeneticistaamericanoThomasHuntMorgan.
264
A
c
Figura12.2.
'I
I
II
6
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8
I.
13
II
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II
3
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II
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Cariótipode fêmeabovina- Bostaurus2n=60IA),Javali- Susscrofascrofa2n =36(B),híbridoJavali
x Suínodoméstico-Susscrofascrofax Susscrofadomestica2n=371c)e cariótipodo suínodoméstico
- Susscrofadomestica2n=38IDI.O javalié umanimalnativodaÁsia,Áfricae Europae quevemsendo
utilizadocomoalimentohámuitotempo.Suacarneé consideradanobree apresentabaixopercentual
degordura.Na Américado Sulfoi introduzidonoUruguaie naArgentinaondeocorreramcruzamentos
livrescomosuínosdomésticosresultandoemanimaishíbridosqueapresentamcaracterísticasdasduas
espéciesparentais.Na Américado Norte,o javalifoicruzadopropositalmentecomo porco-do-mato,
produzindoo Varão-selvagem.O JavaliSelvagemda EuropaContinentalapresentaumcariótipocom-
postopor 36 cromossomosenquantoo suínodomésticoapresenta38. Os animaishíbridospodem
ápresentarcariótiposcom37 ou 38 cromossomos.Estacaracterísticatemsidomuitoutilizadaparadi-
ferenciarosJavalislegítimosde seushíbridos,vistoquea discriminaçãopelofenótiponemsempreé
possível.-FotografiasgentilmentecedidaspelosDrs.JoséCarlasF.Moraes- EMBRAPA- PecuáriaSul
(cariótipobovino!eThalesRenatoO. Freitas- DepartamentodeGenética- UFRGS,Mana daSilva-
Citocel- Laboratóriode Genética(demaisfiguras).Reproduçãoautorizada.
compreensãosobrea evoluçãodasespécies
e dos processos envolvidos no desenvolvi-
mento normal e patológico. As freqüências
dos alelos para marcadores genéticos nu-
cleares "clássicos" (grupos sangüíneos e
proteínas) são conhecidos em milhares de
populações e espécies.
Qualquer característicadeterminadapor
um genesimplesque exibevariabilidadege-
néticadiscretaconstituium polimorfismo,o
265
II 11 1I I. li II
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qualmarcaum segmentocromossômico.A
rigor,considera-sepolimórficooloconoqual
oalelomaisfreqüentepossuiumafreqüência
igualou inferiora 99 %. Se genesafetando
umacaracterísticaquantitativa(QTL) ou
qualitativaestiveremnumsegmentocromos-
sômicopróximoàquelemarcador,omonito-
ramentodasegregaçãodopolimorfismopode
permitirumainferênciaindiretadapresença
do QTL eo valorfenotípicoa seresperado
paraacaracterísticaquantitativadevidoa li-
gação.A certezadessainferênciadependerá
daproximidadedomarcadorao QTL queé
medidopelafreqüênciaderecombinação.O
valordomarcadordependerádamagnitude
enaturezadosefeitosquantitativos.
Grupos Sanguíneos e Polimorfismos
Protéicos
Os estudoscomgrupossangüíneosani-
maisforaminiciadosno anode 1900por P.
EhrlicheJ. Morgenroth,períodoemquetam-
bémforamdescritososprimeirosgrupossan-
guíneosemhumanospor K. Landsteiner
(Hines,1999).Seguiram-seavançosdastéc-
nicasdeimunizaçãocomaconseqüentede-
tecçãode grupossangüíneosemdiferentes
espéciese já emmeadosda décadade 30
surgemosprimeirosrelatosdesuautilização
emtestesdepaternidadeemespéciesdeani-
maisdomésticos(eqüinos).Nadécadade50,
como surgimentodastécnicasdeinsemina-
çãoartificial,houveumredobradointeresse
na utilizaçãode técnicasde imunogenética
nãosomenteparaa identificaçãoanimale
controledepaternidade,mascomoumafer-
ramentaaserutilizadaemestudosdegenéti-
cadepopulaçõesebuscademarcadorespara
genesquecodificamcaracterísticasde inte-
resseeconômico.Atualmente,embovinossão
reconhecidos11sistemasdegrupossangüí-
neosou antígenoseritrocitários,denomina-
dosA, B,C, F, J, L, M, S,Z, R', eT'. O sis-
temaB caracteriza-sepor suacomplexidade
266
ímparentretodososmamíferos,estimando-
sequepossuamaisde1000alelosoufeno-
grupos.Todososgrupossanguíneosdebo-
vinosjá têmsualocalizaçãocromossômica
conhecida(Nicholas,1987;Hines,1999).
O desenvolvimentodastécnicasdeele-
troforese(Hunter& Markert,1957)deu
acessoaumanovacategoriadepolimorfis-
mos,os polimorfismosprotéicQs.Basica-
mentea técnicaconsistenaseparaçãode
moléculas,porsuacargaelétrica,tamanho
e forma,atravésdamigraçãoemummeio
desuporteetampõesadequadossobain-
fluênciadeumcampoelétrico.A eletrofore-
sedezonaconstituiatécnicamaisutilizada,
freqüentementeassociadaà aplicaçãode
métodoshistoquímicosparalocalizaraszo-
nasdeatividadeenzimáticadiretamenteno
meiodesuporte(Smithies,1955).Embo-
vinos,ospolimorfismosprotéicosconsistem
normalmentedevariaçõesobservadasem
proteínasdosangue(plasma/soro,eritróci-
toseleucócitos)edoleite.
A técnicaconvencionaldeeletroforesepos-
sui a limitaçãode detectarapenascercade
30%davariaçãogenéticaprotéica,poisape-
nasessepercentualdemutaçõeséquealtera
acargaelétricadasproteínas.Não obstante,
estudosdavariabilidadeeletroforéticadaspro-
teínaspermitiramaidentificaçãodeumgran-
denúmerodepolimorfismosemdiferenteses-
pécies,possibilitandoaavaliaçãodeparâme-
trosdadiversidadegenéticadosorganismos,
taiscomoopercentualdelocospolimórficos
eaheterozigosidademédiapor loco.
As principaisutilizaçõesdestacategoria
demarcadoresestãorelacionadascom:
a. controledepaternidade;
b. caracterizaçãodepopulaçõesnaturais,
visandoestabelecerasrelaçõesfIlogené-
ticasentreosdiferentesníveishierárqui-
cos(gêneros,espécies,raças)afimdees-
clarecerahistóriaevolutivadaspopula-
çõese estabelecercritériosadequados
parasuapreservaçãoe/ouutilização;
c. caracterizaçãodepopulaçõesdeani-
maisdomésticos,visandoestabelecer
a influênciadoambientee processos
deseleçãoartificialsobresuacompo-
siçãogenética,bemcomodeterminar
asrespectivasdistânciasgenéticaspara
permitiraotimizaçãodosprocessosde
cruzamentobaseadosnaexploração
daheterose;~
d.diagnósticoecontrolededoençasgené-
ticas,comoerrosinatosdometabolis-
moeoutrasmutaçõesquecausemdefi-
ciênciasquantitativasou qualitativas
nasproteínascomousematividadeen-
zimática.Ex:DeficiênciadeFatorVIII
(=hemofilia)ea-manosidose;
e.discriminaçãoentreosdiferentestipos
degêmeos.Apesardapossíveltrocade
sangueentregêmeosfraternos,autili-
zaçãoconjuntadegrupossanguíneos
epolimorfismosprotéicospodemfazer
adiscriminaçãoentreindivíduosdizigó-
ticosemonozigóticoscomumaeficiên-
ciamuitopróximaa 100%.
Atualmenteexistemrelatosdaexistência
depolimorfismoem13proteínasplasmáti-
cas,12proteínaseritrocitárias,noveproteí-
nasleucocitáriase 6 proteínasdo leite,a
grandemaioriajápossuindosualocalização
cromossômicaconhecida(Hines,1999).
Polimorfismosde DNA
A descobertadaestruturadoDNA em
1957tevecomoconseqüênciaestudosenvol-
vendoasvariaçõesnaturaisemsuaestrutura.
Numprimeiromomento,ospesquisadores
enfrentavamo problemadetrabalharcom
quantidadeslimitadasdeDNA,todaelaori-
gináriadaextraçãoefetuadaapartirdecélu-
Iasbemconservadas.Essepanoramamudou
radicalmenteapartirdadécadade80com
a descriçãodeumatécnicarevolucionária,
denominadareaçãodepolimeraseemcadeia
(Mullis& Faloona,1987)ouPCR(doinglês
Polymerasechain reaction),como émaisco-
mumenteconhecida.
APCR (Figura12.3)éumatécnicalabora-
torialquereproduzartificialmentea forma
comoo DNA éreplicadonanatureza.Apre-
sentadaàcomunidadecientíficanumencon-
tro em1984,a PCR foi adotadacomouma
ferramentadepesquisaessencialdadosua
potencialidadedeutilizaçãonaáreadebiolo-
giamolecular.A técnicadePCR temsidouti-
lizadacomosmaisdiferentespropósitosque
vãodesdeaidentificaçãodeindivíduosapar-
tir de restosmortaisde guerra,análisede
DNA pré-histórico,diagnósticodedoenças,
auxílioeminvestigaçõespoliciais,determina-
çõesdepaternidade,entreoutrasaplicações.
A PCR éummétodorápidoeversátilpara
aamplificaçãodesegmentosdeDNA epode
serimplementadoapartirdeumafonteque
contenhaapenasumamolécula.Usualmen-
te,ométodoérealizadodeformaapermitir
umaamplificaçãoseletivadeumaseqüência
alvoespecíficadentrodeumacoleçãohete-
rogêneadeDNA (p.ex.DNA genômicoto-
tal ou populaçãocomplexadeDNA). Para
permitirtalamplificaçãoseletiva,énecessá-
ria algumainformaçãopréviada seqüência
alvoparaquesepossaconstruirduaspeque-
nasseqüências(15-30 pb) deoligonucleo-
tídeosiniciadores(doinglêsprimers).Quan-
doadicionadosaoDNA genômicodesnatu-
rado,essesiniciadoresligam-seespecifica-
menteàs suasseqüênciascomplementares
de DNA queflanqueiama regiãoalvode-
sejada.Essasseqüênciassãodesenvolvidas
de formaque,empresençade uma DNA
polimerasetermoestávele precursoresde
DNA (osquatrosdeoxinucleotídeostrifos-
fatados),inicie-seasíntesedenovascadeias
quesãocomplementaresdacadeiadoDNA
alvo.A técnicade PCR é umareaçãoem
cadeiaporqueoDNA sintetizadoemumci-
clo inicialpassaa sero moldeparaasínte-
seposteriordeDNA nosciclossubseqüen-
%7
Mistura
Pl
~ 111111111111111I1111I111I111111111111
DNAAlvo
aTaq
P2
Iii;y +DNTPs
Desnaturação ~';'IIIIIIIIIIIII'IIIIIIIIIIIIII alii;y'"""""""'"""'"""""""1 94°C
Anelamento III!l"1111111111111111111I~a 1"1"'"""'""'"""'"" 55°C
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Extensão !!WIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJI.IIIII
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Figura12.3. Diagramailustrandoas diferentesetapasdurantea amplificaçãode DNA utilizandoa técnicade PCR.
tesoApós aproximadamente30ciclosdesín-
teseosprodutosde PCR deverãoincluir,
alémdo DNA original,aproximadamente
105cópiasda seqüênciaalvo.Essaquanti-
dadepodeserfacilmentevisualizadacomo
umabandadiscretade tamanhoespecífi-
coquandosubmetidaà eletroforeseemgeldeagarose.A reaçãoenvolveciclosseqüen-
ciaiscompletoscompreendendotrêsetapas
básicas:
a. Desnaturação- compreendea disso-
ciaçãodasligaçõesquemantêmunida
aduplafitadeDNA. Issoéobtidotipi-
camentepelautilizaçãodetemperatu-
rasentre93-95°C;
268
'I1m1l11ll111l11ll11l111l111l11l111l1'
mnlllllllllllllllllllllllllllllllll
b.Reanelamento- Ligaçãodasseqüên-
ciasiniciadorascoma seqüênciaalvo.
Essepassonormalmenteutilizatempe-
raturasentre50e70°Cdependendoda
Tmdoduplexesperado.A temperatura
deanelamentoétipicamente5°Cabai-
xo da Tmcalculada.Temperaturasde
anelamentomaiselevadasaumentama
especificidadedareação.
c. Síntesedo DNA - A partirdosinicia-
doresjá ligadosà seqüênciaalvo,co-
meçaa síntesedeumanovaseqüência
complementar.As temperaturasque
conferemmaioreficiêncianessaetapa
estãoentre70-75°C.
A DNApolimerasetermoestáveltemsido
obtidadeorganismoscujohabitatnatural
ocorreemfontestermais.Porexemplo,aTaq
polimerasevastamenteutilizadaé obtidaa
partirdo Thermophilusaquaticuse é ter-
moestávelaté94°C,comumatemperatura
ótimadefuncionamentode80°C.
Astécnicasmod~nasdebiologiamole-
cularfacilitarama detecçãodepolimorfis-
mosgenéticosdiretamentenoDNA.Osmar-
cadoresde DNA alémde apresentarem
maioresníveisdepolimorfismosqueospro-
téicos,permitemtambémaobtençãodeda-
dosderegiõesnãotranscritase identifica-
çãodemutaçõessilenciosas.Contamainda
comafacilidadedemanipulaçãoeamaior
estabilidadedoDNA,oqueosestátransfor-
mandoemmaterialdeeleiçãoparacompa-
raçõesbiológicasetambémcomomarcado-
resparacaracteresdeprodução.
PolimorfismosdeComprimentode
FragmentosdeRestrição
Opolimorfismodecomprimentodefrag-
mentosderestrição(RFLP)édemonstrado
pelafragmentaçãodoDNA atravésdouso
deenzimasderestriçãoqueo cortamem
regiõesespecíficas,resultandoemfragmen-
tosdediferentestamanhos,osquaisvariam
deacordocomalocalizaçãodosítiodere-
conhecimento.Essasenzimassãoendonu-
cleasesproduzidasoriginalmenteporbacté-
riascomoummecanismodedefesaquevisa
destruiroDNAdeagentesinvasores.Como
asenzimasderestriçãotêmseqüênciasde
reconhecimentoespecíficas,mutaçõesque
acarretamacriaçãooueliminaçãodesítios
declivagem(corte)alteramo tamanhodos
fragmentosdeDNA.Essesmarcadoresfo-
ramidentificadospelaprimeiravezhámais
de20anosemumexperimentodestinadoà
detecçãodemutaçõesemDNA devírus
(Grodzickeretal.,1975).
O produtodeclivagempodeserobser-
vadopor hibridizaçãodessesfragmentos
comseqüênciashomólogasdeDNAmarca-
do radiativamenteouporcompostosque
desencadeiamluminescência.Esseproces-
so,noentanto,ébastantelaboriosoeapes-
quisademarcadoresnumgenomacomple-
topodetornar-seextremamentecomplexae
atémesmoinviável,dopontodevistapráti-
co.Umaalternativaparaa caracterização
dessesmarcadoreséadigestãodefragmen-
tosmenoresrealizadaapósa amplificação
porPCR. Entretanto,comoosRFLPssão
codominantese dialélicos,possuembaixo
conteúdodeinformaçãodepolimorfismo
(doinglêspolymorphisminformationcon-
tent,PIC). Exemplificando:seduascópias
daregiãocromossômicaemquestãonão
podemserdistinguidas(homozigotaspara
aqueleloco),nãoserápossíveldeterminar
qualcópiafoiherdadajuntocomumdeter-
minadotraçoquantitativoenenhumainfor-
maçãodeligaçãopodeserobtida.Dessa
forma,somentequandoos indivíduossão
heterozigotosparao loco,épossíveldistin-
guirqualaleloestáassociadoaumacarac-
terísticaemquestão.A freqüênciadehete-
rozigotosnapopulaçãoparaumdetermina-
dosistemaé,portanto,deextremaimpor-
tânciae diretamenteproporcionalàsfre-
qüênciasalélicas.
PolimorfismosdeDNA Amplificadoao Acaso
A denominaçãodepolimorfismodeDNA
amplificadoao acaso(do inglêsRandom
Amplified PolymorphicDNA - RAPD) foi
criadaporWilliamsetalo(1990)e,concomi-
tantemente,Welsh & McClelland (1990)
descreveramo métododenominadoderea-
çãoemcadeiadapolimerasecominiciadores
(primers)aleatóriosAP-PCR(doinglêsArbi-
trarilyPrimed-PolymeraseChainReaction).
Essa técnicaproduzmilhõesde cópiasde
segmentosdeDNA, obtendo-seacaracteri-
269
zaçãodogenomaindividual,poismuitasban-
daseletroforéticaspodemserdetectadasge-
randoopadrãodeimpressõesdigitaisdeDNA
(doinglêsDNA fingerprints).No entanto,es-
sesmarcadoresapresentamalgumasdesvan-
tagens.Entreelas,acomplexidadedopadrão
resultante,a impossibilidadede diferenciar
heterozigotose homozigotose o desconhe-
cimentodopadrãodeherançadasbandas.
Minissatélitese Microssatélites
Boapartedogenomadoseucarioteséfor-
madaporseqüênciasrepetitivasemtandem,
denominadasdeDNA altamenterepetitivo,ou
DNA satélite.Seqüênciascurtasrepetitivas
foramanalogamentedenominadasdeminie
microssatélitese estãodispersaspelogeno-
ma.Apresentamumconteúdovariáveldeci-
tosinaeguanina(CG) eaocontráriodoDNA
satélite,nãoseconcentramemregiõeshete-
rocromáticas(pararevisãoverTautz,1993;
Strachan& Read,1996).A análisedesses
marcadoresnuclearespodeserocomplemen-
tonecessárioparaestudoscomoutrosmar-
cadores,proporcionandoum quadromais
completodaestruturagenéticadapopulação.
Os minissatélitessão seqüênciascom
unidadesderepetiçãoquevariamentrenove
a 100pb,localizadospreferencialmenteem
regiõesteloméricasesubteloméricas,sendo
tambémdenominadasdenúmerovariávelde
repetiçõesemtandem(do inglês- Variable
NumberTandemRepeats- VNTR). Sãopo-
limórficosereconhecidosportécnicassimi-
laresàsdosRFLPs, porém,a sondautiliza-
~a paraasuadetecçãoéaprópriaregiãode
repetiçãodo minissatélite.O primeiroloco
hipervariáveldetectado,utilizandoumason-
dadeDNA anônimo,foi descritoem 1980
por Wyman& White e, desdeentão,um
grandenúmerodessespolimorfismosfoi
descritoe caracterizado.Exemplificando,
NakamuraetaI. (1987)analisaram372clo-
nesdeDNA humanoe,desses,77apresen-
tavampolimorfismosdo tipoVNTR, sendo
que18possuíamumaheterozigosidadesu-
periora 80%.
A análisedessespolimorfismospodetam-
bémserfeitaporPCR, constituindo-senuma
metodologiarápidaeeconômica,porémcom
limitações,já que quandoocorremalelos
commaisde70pbemheterozigotos,verifi-
ca-seamplificaçãopreferencialdealelosde
menortamanhoemdetrimentodosmaiores.
Osmicrossatélites(Figura12.4)consistem
de unidadesderepetiçõespequenas,1 a 6
I CACACACA... .CACACACACA [
IGTGTGTGL. GTGTGTGTGT [ A
[
ALELO (CA)112 [
13'
15'
13'
15'
I CACACACA... .CACACACACA [
IGTGTGTGT .GTGTGTGTGT IALELO (CA)112 [
Figura12.4.RepresentaçãoesquemáticadeumlocomicrossatélitecomrepetiçõesdedinucleotídeosCA EmA é
apresentadoumindivíduohomozigotoe emBumindivíduoheterozigoto.Notarqueasdiferentesformas
nãosediferenciampelaseqüênciade basesmassimpelonúmerode repetições.
270
ALELO (CA)118'
'CACACACA....CACACACACACACACA' , 3'
, 'GTGTGTGL.GTGTGTGTGTGTGTGT' 15' B
ALELO(CA)122I
'CACACACA...CACACACACACACACACACA' , 3'
, 'GTGTGTGL.GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT' ,5'
pbecorrespondemamaisde20%dogeno-
madosmamíferos.Sãoconhecidostambém
comorepetiçõespequenasemtandem(do
inglêsShortTandemRepeats- STR). Os mi-
crossatélitesestãodistribuídosao acasono
genomaesãomaisfreqüentesepolimórficos
queos minissatélites.,Essasseqüênciassão
caracterizadasapartirdebibliotecasgenômi-
cashibridizadascomumasondacomrepeti-
çõesdedi ou trinucleotídeoso quepermite
identificarasregiõescontendomicrossaté-
lites.A partirdoseqüenciamentodessasre-
giões,sãodesenhadosiniciadoresparaasse-
qüênciasúnicasqueflanqueiamomicrossa-
télite.Posteriormente,comoauxíliodaPCR,
pode-seentãoamplificaros fragmentos,o
quepermiteidentificaravariabilidadeindivi-
dualemcadaloco.
Os marcadoresmolecularesdo tipomi-
crossatélitesãoparticularmenteinteressantes
devidoasuadistribuiçãoaleatóriaportodoo
genoma,estimando-seseunúmerodelocos
emaproximadamentelxl04-105.Alémdisso,
comoos microssatélitesseguemos padrões
deherançamendelianas,sãoadequadosaos
estudosdeligaçãoedadinâmicagenéticadas
populações.Inúmerosmicrossatélitestêm
sidodescritosparaasprincipaisespéciesde
interesseeconômico.O últimomapadeliga-
çãopublicadoparaaespéciebovina,porexem-
plo, reporta1250marcadorespolimórficos
(1236microssatélitese14antígenosincluindo
proteínaseritrocitáriaseséricas)distribuídosnos29autossomosenoparsexual(Kappes
etaI., 1997).Essespolimorfismospermiti-
ramaobtençãodeummapadogenomabo-
vinodealtaresolução,cobrindoumtotalde
2990centimorgans,o quedemonstraa im-
portânciadosmicrossatélitesemestudosde
ligação.Adicionalmente,temaumentadosua
utilizaçãoemanálisesdegenealogiasecon-
troledefmação.Damesmaforma,váriosestu-
dostêmbuscadomapeargenesparacaracte-
rísticasquantitativas(QTLs), utilizandoesses
polimorfismoscomresultadosanimadores.
Emanálisespopulacionais,dadoscompa-
rativosentremarcadoresprotéicosemicrossa-
télitestambémtêmdemonstradoasuperiori-
dadedessesúltimos.Arranzetalo(1996),por
exemplo,compararamcincomicrossatélites
equatorzeproteínas,verificandoqueo poli-
morfismoexibidopelosmicrossatélitesfoi
maior que dasproteínas;79 alelosforam
observadosnosmicrossatélitescontra28nos
protéicos,sendoa heterozigosidade,conse-
qüentemente,bemmaiornosprimeiros.Nos
últimosanos,devidoafatorescomoesses,os
microssatélitestemtidoumautilizaçãomaciça
nasavaliaçõesdevariabilidadegenéticadentro
eentrerebanhos.
Existemexperimentosquesugeremuma
participaçãoimportantedesseslocosnaregu-
laçãogênica(Schrothetal., 1992;Comings,
1998;Oliveira,2000).A partirdessesformu-
laram-sehipótesessobreomododeinteração
dosmicrossatélitescomaherançapoligênica.
Foi sugeridoqueessasseqüênciasexercem
algumefeitosobreaexpressãodosgenesaos
quaisestãoassociadas.O efeitoseriadepen-
dentedonúmeroderepetiçõesdoalelo.Isso
sebaseiana observaçãodequeseqüências
ricas empurinase pirimidinasalternadas,
(CA)n,comoosmicrossatélites,apresentam
a capacidadede formaro Z-DNA (Figura
12.5),emcondiçõesfisiológicas.Como háuma
tendênciapara seqüênciasde Z-DNA se
agregaremnasregiõesdeiniciaçãodatrans-
criçãocomumaausênciavirtualdasmesmas
emposiçõesintergênicasepseudogenes,os
microssatélitesteriamumpapelpotencialna
regulaçãogênica.Comings et aI. (1996)
sugeremquea associaçãodeummicrossa-
télitecomumdeterminadofenótipopoligê-
niconãodependeriadeumaleio específico,
masquehaveriaum limiarno tamanhoda
repetiçãoqueinterferirianaregulaçãogêni-
ca.Tantoalelosgrandescomopequenospo-
deriaminterferir,concorrendotantoparaum
aumentocomoparaumareduçãodaexpres-
?71
Figura12.5.Visãotridimensionalapresentandoasdife-
rentespossibilidadesde conformaçãoda
estruturadoDNA.B-DNAé supostamente
a formade ocorrêncianaturalnacromati-
na.O A-DNAocorreemsoluçõescomalta
concentraçãodesaise o Z-DNAé uma
formaalternativaqueocorrequandoexis-
temseqüênciasricasemG-C. Adaptado
de Reichertet01.2000. Reproduzidocom
permissãodo autor.
são.Assim,osgenótiposusualmentesão
agrupadosdeacordocomotamanhodosale-
losem:homozigotosparaaleloscurtos,ho-
mozigotosparaaleIoslongoseheterozigo-
tos(Comings,1998).
Polimorfismodo DNA Mitocondrial
Naavaliaçãogenéticadosanimaisdomés-
ticos,comumenteutilizam-seteoriasbasea-
dasnosgenesnucleares.Essatemsidoafonte
dematerialnasanálisesdacomposiçãodahe-
rançaemanimaisdomésticos.Contudo,exis-
temoutrasorganelasdentrodascélulasque
possuemseuprópriomaterialgenético,uma
dasquaisé a mitocôndria.As mitocôndrias
atuamnageraçãodeenergiapormeiodaoxi-
272
daçãofosforilativa.Estaconsistebasicamente
numprocessoatravésdo qualo NADH e
FADH2, produzidospelametabolizaçãodos
nutrientes,sãooxidadoscomaconcomitante
formaçãodeATP.Aproximadamente90%de
todoo ATP dosmamíferoséproduzidonas
~ mitocôndrias(Voet& Voet,1995).
O DNA mitocondrialé uma molécula
fechadacomaproximadamente16.500nu-
cleotídeos,cujaseqüênciacompletajáfoide-
terminadaparadiversosmamíferos,incluin-
dohumanos,bovinos,ovinos,camundongos
eratos.O genomamitocondrialconsisteem
doisrRNAs, 22tRNAs e 13genesparapro-
teínas.A moléculatambémpossuiumare-
giãonãocodificante,denominadaD-Loop,
queéresponsávelpelocontroledareplicação
edatranscrição(Wallace,1995).
As variaçõesmolecularesno DNA mito-
condrialtêmsidodemonstradasatravésde
análisesdeRFLP ecomparaçãodeseqüências
de nucleotídeos.Existemmuitostrabalhos
associandodoençashumanasadiferençasnas
seqüênciasdeDNA mitocondrial.A Síndrome
deKeams-Sayres(KSS)eaNeuropatiaÓpti-
caHereditáriadeLeber(LHON) sãoexem-
plosdetaisdoenças(Wallace,1995;Gillham,
1994).Especificamente,a LHON demons-
trouestarcorrelacionadacomumamutação
simplesdogeneparaNADH Desidrogenase.
Talsubstituiçãodenucleotídeospodepoten-
cialmenteafetarcaracterísticasprodutivasou
sanitáriasemanimaisdomésticos;entretanto,
a influênciadospolimorfismosdo DNA mi-
tocondrialnasaúdedosanimaisdomésticos
aindafoipoucoinvestigada.
A D-loop (Figura12.6)é a regiãomais
variáveldo genomamitocondrial,masnão
codificanenhumprodutogênicoconhecido.
Portanto,o polimorfismodessasseqüências
nãopodealterarnenhumacadeiaespecífica
de subunidadeprotéica.Entretanto,como
sãoresponsáveispelocontroledareplicação
e transcrição,tais polimorfismospodem
servirdemarcadoresparadiferençasemou-
troslocaisdo genomamitocondrial.
ACGT ACGT ACGT
Figura 12.6. Seqüênciadebasesda regiãocontroladora
ID-Ioop)do mtDNA de bovinos.
Os genesmitocondriaistêmherança
materna,oquesignificaquesãotransmitidos
pelafêmeaparaambosossexosdaprogênie.
O conhecimentodamagnitudedosefeitos
citoplasmáticosoumitocondriaisé muito
importanteparaqueasestimativasdacontri-
buiçãomaternapossamserajustadasapro-
priadamente.O estudodeassociaçõesentre
variantesdomtDNAeaeficiênciaprodutiva
emanimaisdomésticospodetrazergrandes
contribuiçõesàspráticasseletivas,alémde
fornecersubsídiosparaastécnicasdeclo-
nagemeproduçãodeanimaistransgênicos.
Empregode MarcadoresGenéticos
no MelhoramentoAnimal
A maioriadostraçosdeimportânciaeco-
nômicaé multifatorial,o quesignificaque
sãocontroladosporváriosgeneseafetados
porfatoresambientais.Emrazãodisso,apre-
sentambaixasestimativasdeherdabilidade
(h2)e sãomenossensíveisà seleçãodireta.
Setomarmoscomoexemplodecaracte-
rísticamultifatorialaeficiênciareprodutiva,
a prevalênciade interaçõesgenótipox am-
bienteegenótipoxmanejosãoprovavelmen-
te,responsáveispelasbaixasestimativasde
h2« 0,15) quelhessãoatribuídas(Davis
1993;Kootsetal., 1994).A baixah2,asso-
ciadaaoslongosperíodosdetemporeque-
ridosparaamensuraçãodascaracterísticas
reprodutivasnasfêmeas,limitaousodastéc-
nicasdeseleçãotradicionaisemfunçãodo
elevadocusto.A eficiênciadaspráticassele-
tivaspodeserincrementada,sensivelmente,
combinando-seaseleçãodiretaparaumade-
terminadacaracterísticacomaseleçãopara
umacaracterísticaassociadaou"marcador".
Walkley& Smith(1980)compararamaefi-
ciênciadaseleçãodireta,indiretaecombina-
danaprolificidadeemovinos(h2=O,tO),
observandoumincremento50%superiorda
combinadaemcomparaçãocoma seleção
diretasimples.
O problemaconcentra-senaquestãode
qualmarcadorutilizar.A princípio,pode-se
considerara possibilidadedeutilizaçãode
característicasfísicasemarcadoresmolecu-
lares.Existeumasériedecaracteresfísicos
quesãoutilizadoscomomarcadoresindire-
tos,visandoaseleçãoparamelhoreficiência
reprodutiva,aexemplodoperímetroescrotal.
Contudo,apesardemuitostraçosfísicos
apresentaremaltaherdabilidadee conse-
qüentementeboarespostaàseleção,essetipo
decaracterísticanormalmentetemsuaex-
pressãoafetadapelainteraçãocomo am-
bienteesistemasdemanejo.
Devidoa seupadrãodeherançamono-
gênica,autilizaçãodemarcadoresmolecu-
larescomoferramentadeseleçãoéumaal-
ternativainteressante.A co-segregaçãode
umQTL commarcadorespróximospermi-
tea utilizaçãodasvariaçõesnestesmarca-
dores(polimorfismos)nosprogramasde
273