TÉCNICA DE PCR EM DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

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TÉCNICA DE PCR EM DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase) é atualmente amplamente utilizada para o seqüenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de impressões digitais do material genético e detecção e diagnóstico de doenças infecciosas.
Por ser um método direto de alta sensibilidade, a reação em cadeia de polimerase está sendo considerada uma grande aliada na detecção de doenças infecciosas. Sua versatilidade, que permite a aplicação em diversos materiais biológicos, aliada à rapidez de análise é outro diferencial da técnica.
	Algumas das técnicas de PCR são:
TR – PCR
NESTED-PCR
MULTIPLEX-PCR
MICROARRAY
Desempenho da técnica nested PCR (nPCR) para detectar o complexo Mycobacterium tuberculosis em amostras de sangue de pacientes com suspeita de TB para sua possível utilização como uma ferramenta auxiliar no diagnóstico laboratorial da doença em crianças. Métodos: Detecção do complexo M. tuberculosis em amostras de sangue usando como alvo a sequência de inserção IS6110 do DNA genômico do bacilo. Foram avaliados 120 pacientes, menores de 15 anos de idade, de ambos os sexos, provenientes de hospitais públicos do Recife (PE). O diagnóstico de TB foi realizado pelo médico assistente do serviço de saúde de acordo com os critérios da Sociedade Torácica Americana. A nPCR amplificou um fragmento de 123 pb com oligonucleotídeos externos (IS1/IS2) e, na reação subsequente, com oligonucleotídeos internos (IS3/IS4), gerando um amplicon de 81 pb. Resultados: A TB ativa ou latente esteve presente em 65 pacientes, foi descartada em 28 suspeitos e 27 não tinham a doença (controles). A sensibilidade da nPCR foi de 26,15%, sendo significativamente maior na forma extrapulmonar (55,56%) em relação à pulmonar (18,18%), e a especificidade foi de 92,73%. Conclusões: Diante das dificuldades diagnósticas da TB infantil e do baixo número de casos estudados, a nPCR em sangue demonstrou ser uma técnica rápida e específica, mas com baixa sensibilidade. Para saber a sua real utilidade no diagnóstico de formas paucibacilares, sobretudo as extrapulmonares, novas pesquisas devem ser desenvolvidas com uma casuística maior de crianças e com outros espécimes biológicos além do sangue.
RTPCR é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares.
A tecnologia de microarray é uma ferramenta de análise de expressão gênica que permite investigar a expressão de centenas ou milhares de genes em uma amostra com uma reação de hibridização. A tecnologia é baseada na hibridação de alvos marcados derivados de amostras biológicas e uma série de sondas de DNA imobilizadas em uma matriz sólida, que representam os genes de interesse. O estudo simultâneo de centenas de genes transformou a técnica de microarray em uma ferramenta de análise global muito importante, com aplicações em várias áreas, incluindo o estudo do desenvolvimento de neoplasias.
Uma opção ao diagnóstico por PCR é a utilização de uma de suas variantes, o PCR multiplex. Esta técnica se baseia na inclusão, em uma mesma reação de PCR, de pares de iniciadores capazes de amplificar diferentes seqüências de um determinado agente etiológico, incluindo uma que será amplificada com certeza em qualquer amostra clínica. Este tipo de controle interno diferenciará se o resultado é realmente negativo ou se decorre de um problema que tenha inibido a reação. 
        
O PCR multiplex, apesar de ser uma variante com vantagens consideráveis sobre o PCR convencional, também possui suas limitações. Dependendo dos agentes que se queiram identificar, o número de pares de iniciadores a serem adicionados em uma mesma reação também é um fator limitante para uma amplificação adequada. Quando muitos são adicionados, observa-se uma diminuição, até mesmo expressiva, da sensibilidade do teste. Mesmo sendo possível a manipulação em alguns casos, a solução para este problema pode exigir o uso de outra técnica, como a hibridização reversa.