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RESUMO - VIROLOGIA • Introdução a Virologia Os vírus são os organismos mais abundantes da Terra e dos oceanos. Existem vírus que infectam plantas, amebas - os chamados mimivirus, vírus grandes que possuem genoma do tamanho semelhante ao de bactérias, cuja descoberta revolucionou a virologia -, além de outros vírus – denominados virófagos, que podem infectar, por exemplo, os mimivirus. Durante sua replicação nos diversos seres, os vírus seguem a fisiologia da célula do seu hospedeiro, seja ele qual for. Desse modo, fica clara a complexidade e diversidade desses seres, uma vez que são capazes de se adaptar aos diferentes organismos. O vírus é conhecido por ser um parasita celular obrigatório. Porém, é importante notar que nem todo parasita celular obrigatório é um vírus, de modo que essa consiste apenas em uma importante característica desses seres, não sendo utilizada para defini-los. Como fica claro, existem inúmeras diferenças entre os vírus e organismos unicelulares. Por exemplo, os vírus não se dividem por divisão binária, isto é, dividem a própria célula em duas. Isso ocorre em todas as células de todos os organismos após a duplicação do DNA, mas não em vírus, pois ao final de sua replicação as novas partículas virais de DNA/RNA e proteínas ficam dentro da célula hospedeira para serem montados novos vírus. Além disso, o vírus não se replica na ausência de hospedeiro celular; apresenta DNA ou RNA como genoma, nunca ambos juntos; o genoma pode ser infeccioso, isto é, o genoma per si consegue gerar outras partículas virais, quando injetados em uma célula, e ocorre apenas em vírus RNA+; não possui ribossoma ativo em síntese de proteína e não possui metabolismo próprio, no que se refere a produção de energia. Assim, os vírus constituem um grupo extenso e diverso, que pode variar em estrutura e material genético, ter genoma único ou segmentado, que pode ser fita simples ou dupla fita e linear ou circular. Entretanto, essas informações permaneceram obscuras por muitos anos, e começaram a ser desvendadas conforme os estudos sobre microorganismos avançavam. Nesse contexto, surgiu o Postulado de Koch, que relatava o seguinte: - o agente infeccioso deve estar presente no caso de uma doença; - o agente deverá ser isolado do hospedeiro e cultivado in vitro; - a doença deverá ser reproduzida quando uma amostra do agente retirado de uma cultura é inoculada em um hospedeiro saudável e suscetível; - o mesmo agente deverá ser recuperado do hospedeiro infectado experimentalmente. Contudo, esse postulado era aplicado apenas para bactérias, dado que vírus não são cultiváveis in vitro. Assim, todas as doenças que não se encaixavam nesse perfil infecto contagioso proporcionado por bactérias, eram descartadas, o que prejudicou o estudo da virologia. Esse quadro foi mudado por dois pesquisadores que realizaram um experimento com macerado de tabaco com mosaico, filtraram esse macerado, restando apenas liquido. Esse líquido, então, foi introduzido em uma planta saudável, ou cultivado in vitro. A planta apresentou sinais de infecção pelo “fluido contagioso vivo”, no entanto, o cultivo in vitro não foi possível. Mais tarde, o “fluido contagioso vivo” foi analisado por microscopia eletrônica, possibilitando a visualização de pequenas partículas – as chamadas partículas virais. *Terminologias Utilizadas em Virologia: 1. Capsídeo - camada externa de proteínas que envolve a partícula viral e em cujo interior se encontra o acido nucléico. É formado por unidades estruturais. 2. Unidade Estrutural - a menor unidade funcional que irá formar o capsídeo, ou seja, que, repetidamente, forma o capsideo. 3. Capsômero - unidades morfológicas observadas na superfície das partículas virais e representam clusters e unidades estruturais. 4. Nucleocapsídeo - associação do capsídeo com ácido nucleico, ou associação de proteínas virais com ácidos nucleicos. Às vezes, chamado de “core”. 5. Envelope - material lipoproteico que envolve o nucleocapsídeo. Os lipídios são originários da célula hospedeira. 6. Vírion - partícula viral infecciosa fora da célula. *Estrutura Viral e Sua Composição: Os vírus possuem diversas estruturas e morfologias. Basicamente, como dito, os vírus são DNA ou RNA - o que está associado a proteínas estruturais codificadas pelo genoma viral. A partir disso, existem duas possibilidades de associação de proteínas virais, que dá origem a vírus não envelopados ou envelopados. Os vírus não envelopados são aqueles onde há associação do genoma com proteínas estruturais, formando o capsídeo; e além disso, pode haver também associação entre proteínas não estruturais (RNA polimerase, enzimas, etc.) e o material genético, formando o nucleocapsídeo. Já a estrutura do vírus envelopado se organiza da mesma maneira, porém, somado à ela, há associação de glicoproteínas – proveniente do vírus - e lipídeos – proveniente da membrana plasmática do hospedeiro. Quanto à morfologia, existem duas formas básicas de vírus na natureza: filamentar e esférica, as quais possuem simetria helicoidal e icosaédrica, respectivamente. Outros vírus, chamados complexos, não seguem nenhum parâmetro de simetria. OBS: Forma é o que se vê; já simetria são parâmetros simétricos físicos e matemáticos que garantem a estabilidade e estado de menor energia desses vírus. *Classificação e Taxonomia: Os vírus são classificados através da taxonomia, e, atualmente, o que leva a classificação dos vírus é a semelhança entre os genomas, através do sequenciamento. Além desse, outros aspectos são levados em consideração, como: tipo de envelope, tipo de genoma, número de moléculas do genoma, presença/ausência de envelope, simetria, tipo de hospedeiro, etc. O sistema de classificação utilizado é poliético e hierárquico, e não segue a nomenclatura binomial latinizada de Linneus. A classificação universal é feita por um órgão chamado ICTV, que segue a seguinte organização: ordem, família, subfamília, gênero e espécie. Como consequência dessa metodologia, a classificação taxonômica dos vírus começa por sua inclusão em um gênero, para depois agrupá-lo na família e ordem. Porém, algumas classificações não seguem os critérios do ICTV – antes, classificam conforme a patogênese desenvolvida pelo vírus, com base nos tropismos dos vírus e modos de transmissão em: vírus entéricos, respiratórios, arbovírus, oncogênicos e vírus das hepatites. Assim, vírus de mesma via são classificados em comum, embora abriguem vírus completamente diferentes. Por fim, uma última classificação é a classificação de Baltimore, baseada na estratégia que os vírus usam para produzir o RNAm. Essa classificação levou a obtenção de 6 classes de vírus. Uma dessas classes é Rna vírus de genoma dNA dupla fita. Outra classe são DNA fit simples – seja ela positiva ou negativa. Terceira classe, vírus de genoma de RNA fita psoitiva, pois esses rnas já são o próprio rnam, o qual será traduzido para gerar prteinas – donde vem o nome positivo/negativo. Porém, essa classificação não incluía o vírus da hepatite B, de modo que foi adicionada, originando a seguinte organização: OBS: A fita de DNA molde é chamada de fita negativa. A fita não molde é a fita de DNA positiva (senso), e possui sequencia igual a do RNAm complementar à fita molde, só que com desoxirribonucleotideos. • Replicação Viral A replicação viral trata do processo de entrada do vírus na célula do hospedeiro e o desenvolvimento de seu ciclo replicativo. É importante notar que a replicação viral é diferente de replicação do genoma – a replicação viral diz respeito ao processo de estabelecimento do ciclo replicativo do vírus, e não como ele replica seu genoma. No que se refere ao genoma viral,predominam vírus DNA em detrimento de vírus RNA, os quais possuem diferentes ciclos de replicação. Os vírus RNA, pelo próprio tipo de genoma, são mais independentes da célula hospedeira, enquanto os de DNA utilizam toda a maquinaria da celular. OBS: A exceção nessas divisões, é que de todos os vírus do genoma DNA, apenas vírus da classe VII de Baltimore (hepatite B) passam por intermediário de replicação de RNA, apesar de serem vírus de genoma DNA. De modo contrário, embora os retrovírus sejam genoma RNA, passam por intermediário de replicação de DNA. Antes de entendermos o ciclo replicativo, porém, são necessárias comparações entre partículas virais envelopadas e não envelopadas. Os vírus não envelopados possuem como componentes proteínas e ácidos nucleicos. Em termos de propriedades, são altamente resistentes a modificações ambientais, como temperatura, acidez, proteases, detergentes e desidratação. A partir disso, vírus não envelopados tendem a ter resistência maior aos agentes físico-quimicos, por conta da capa proteica extremamente resistente – a qual é energeticamente favorável para manter a estabilidade da partícula, sendo mais resistente que bicamada lipídica. Além disso, como os vírus não envelopados são liberados por lise da célula, são espalhados mais facilmente no ambiente e resistem mais tempo nele até a próxima infecção, já que podem permanecer desidratados e ainda assim infecciosos, resistir a tratamentos com detergentes, etc. Já os vírus envelopados, normalmente são mais sensíveis e têm pouca resistência às condições supracitadas. Eles saem da célula por alteração na membrana celular, e são geralmente liberados por brotamento da célula. Como consequência, eles devem se manter hidratados para manter a integridade do envelope, e, pois, a infecção. Assim, fica claro que vírus envelopados, por necessitarem da bicamada lipídica para o processo infeccioso, são mais sensíveis a alterações ambientais do que os vírus não envelopados. OBS: A maioria dos vírus que entram no TGI são não envelopados, pois devem ser resistentes às mudanças do pH, proteases, etc. *Etapas Gerais do Ciclo Replicativo Viral: As etapas do ciclo replicativo viral são: adsorção; penetração; desencapamento ou desnudação; síntese de macromoléculas; automontagem ou morfogênese e liberação das novas partículas e maturação. Este último processo depende do vírus, podendo estar junto ou não da automontagem; e, além disso, pode ocorrer antes ou após a liberação das partículas virais. Vale ressaltar que todas essas etapas não servem para fagos, apenas para vírus que infectam animais, não havendo, portanto, ciclo lítico ou lisogênico. De maneira geral, os vírus adsorvem na célula e devem penetrar e dentro dela para se desintegrarem. Após a desintegração, os ácidos nucleicos são liberados no núcleo ou citoplasma dependendo do vírus, e geram mRNAs a partir de DNA, ou o próprio genoma já pode ser o mRNA, os quais são traduzidos em proteínas. Uma dessas proteínas pode (ou não) atuar como polimerase para a geração de genomas, permitindo a formação de novos vírus. O tempo de duração desse ciclo depende do vírus, podendo variar de 1 a 40 horas. Os vírus de animais normalmente seguem o tempo de vida de uma célula ou menos. Esse ciclo pode ser dividido em: período de eclipse, exponencial e estacionário. No período de eclipse ocorre a desintegração do capsídeo, em que há abundância de material genético e proteínas virais, sendo detectadas poucas partículas virais. Conforme isso ocorre, há o crescimento exponencial, até que se atinja uma fase estacionária. ➢ Locais de Replicação: No que se refere a vírus de genoma DNA, a grande maioria realiza sua replicação no núcleo, uma vez que poucos deles possuem aparato completo para tal, e necessitam, portanto, da maquinaria da célula, como a RNApol II. Já vírus de genoma RNA devem produzir mais genomas de RNA, e para isso, necessitam de enzimas RNA pol RNA dependente – isto é, RNA pol que utiliza uma molécula de RNA como molde. Todo vírus de genoma RNA deve codificar a sua própria RNA pol RNA dependente, pois não tem como utilizar da célula. Assim, em sua grande maioria, vírus RNA têm sua replicação no citosol, visto que não precisam de produtos celulares localizados no núcleo, como aparato de splicing, RNA pol, timidina quinase, etc. OBS: Existem, porém, exceções como o retrovírus, que possui intermediário de replicação de DNA, que integra no genoma da célula. E a outra exceção é vírus influenza, que não tem cap nos RNAm. Esse vírus vai para o núcleo e cliva o cap dos mRNA do hospedeiro, que é inativado, e integra-o ao seu mRNA. Esse fenômeno é chamado de cap snatch. ➢ As etapas: 1) Adsorção A adsorção nada mais é do que a ligação do vírus a receptores celulares – seja ele qualquer molécula presente na membrana plasmática que o vírus reconheça como ligante para que permaneça adsorvido na célula. O vírus pode se ligar de duas formas à célula: caso seja envelopado, a ligação ocorre por alguma estrutura do envelope; e, se for não envelopado, se liga via alguma proteína do capsídeo. A essas proteínas virais que se ligam a alguma molécula na membrana da célula do hospedeiro, chamamos de antireceptor. 2) Penetração e Desencapamento A penetração é o processo de entrada do vírus da célula, enquanto o desencapamento é a exposição do ácido nucleico viral – o qual ocorre no núcleo ou citosol, dependendo do sítio de replicação do vírus. É importante notar que possuem vírus que não realizam o processo de penetração; antes, adsorvem e injetam seu material genético na célula sem essa etapa. OBS: A adsorção e a penetração são fenômenos distinguíveis pela temperatura, onde o primeiro não depende dela e o segundo depende. Isso porque, a penetração depende do metabolismo energético, o qual deve ter uma temperatura ótima de funcionamento. A modulação da temperatura pode ser utilizada para sincronizar as etapas do ciclo replicativo. A penetração dos vírus pode ocorrer por duas grandes vias, dependendo do vírus. Vírus não envelopados entram nas células por endocitose da membrana plasmática (1). Já vírus envelopados podem penetrar por fusão do envelope viral com membrana plasmática (2) ou endocitose e subsequente fusão do envelope com a membrana da vesícula (3). Ambos os processos necessitam de receptor, uma vez que deve haver o reconhecimento receptor- antirreceptor. Vale ressaltar que uma mesma espécie viral pode utilizar mais de uma via de penetração nas células. Na penetração por fusão do envelope (2), o que ocorre é que após a adsorção do vírus, há a fusão do envelope viral à membrana plasmática, com consequente liberação do capsídeo no citoplasma. Se o vírus replica no núcleo, o capsídeo é carregado por elementos do citoesqueleto até o núcleo, onde o vírus ejeta seu DNA. Já por endocitose, há a ligação do antirreceptor viral com o receptor do hospedeiro, adsorção do vírus e endocitose, em que o vírus se utiliza da via de endocitose do hospedeiro. Dentre elas, a mais comum é a endocitose mediada por clatrina, além daquela que se utiliza das cavéolas (independente de clatrina), onde ambas levam ao endossoma – organela acidificada. Porém, os vírus não envelopados vão diretamente para o endossoma (1), enquanto que os vírus envelopados necessitam que haja a fusão do envelope com a membrana do endossoma (3). Por fim, o local de liberação do vírus depende de onde ele realiza sua replicação – se no citosol, o vírus é aí liberado; se for no núcleo, é liberado no poro nuclear. OBS: Alguns vírus dependem da acidez do endossoma para que haja a fusão da vesícula em que o vírus se encontra com a membrana do endossoma. O vírus influenza, por exemplo,depende dessa acidificação para exposição de peptídeos de fusão presentes em seu envelope, os quais levam a fusão com a membrana do endossoma, permitindo, então, a saída do vírus. Alem disso, outras proteínas também sofrem desarranjo e permitem, por exemplo, a entrada de íons dentro do capsideo, os quais dessaranjarão a estrutura do material genético (nucleocapsideo) que, por fim, é liberado no citoplasma. 3) Síntese de Macromoléculas Dentro da síntese de macromoléculas, devemos levar em consideração os diferentes tipos de genoma encontrado nos vírus, classificados de acordo com a classificação de Baltimore. Vale ressaltar que essa classificação não abrange se o material genético é circular ou linear. Veremos, pois, a seguir, a replicação de cada grupo viral, de acordo com a classificação de Baltimore. a) Vírus de DNA dupla fita Antes de entender esta replicação, é importante ressaltar que os vírus têm duas fases de expressão gênicas: pré-replicativa e pós-replicativa, entre as quais há a replicação do DNA. Vírus de genoma DNA geralmente produzem RNAm e proteínas típicas de cada fase, onde as proteínas da fase pré-replicativa preparam o ambiente celular para a replicação – isto é, auxiliam ou induzem a entrada na replicação de DNA (poucas proteínas). Já as proteínas da fase pós-replicativa estão envolvidas na montagem do vírus, as quais são maiores e geralmente são estruturais e pertencentes ao envelope. Assim, uma fase depende da outra, de modo que se a pré-replicativa for interrompida, as demais não acontecem. O tempo que cada fase dura depende de cada vírus. O vírus de DNA dupla fita inicia a produção de seus RNAms pré-replicativos a partir de uma RNA polimerase que pode estar codificada em seu genoma ou podem pertencer à célula hospedeira, dependendo do vírus. Além disso, o vírus pode requerer de diversos fatores de transcrição, sistema de splicing, etc. Uma vez feitos os RNAm, são produzidas proteínas pré-replicativas (entre elas a DNA polimerase, se ele for citoplasmático), levando a replicação do DNA. O DNA replicado, então, gera mais RNAm, permitindo a produção de mais proteínas, dessa vez estruturais, que formam a partícula viral, composta de capsídeo e proteínas. b) Vírus de DNA fita simples São vírus de replicação nuclear, totalmente dependentes da célula hospedeira. A grande maioria é fita simples negativa, mas existem positivos e ambos devem duplicar o DNA, gerando dupla fita. Assim, abole-se a etapa pré-replicativa. Essa dupla fita gera RNAm, a partir do qual são produzidas proteínas estruturais, além de haver a indução de mais replicação. A montagem do capsídeo, então, é feita com apenas uma fita, que pode ser a negativa ou a positiva. c) Vírus de RNA fita simples positiva Esse genoma já é o próprio RNAm, de modo que, ao entrar na célula, o genoma já é prontamente traduzido em proteínas pelos ribossomos. Assim, o vírus não carrega consigo uma RNA polimerase, apenas possui seu gene no genoma; antes, ao ser traduzido, o RNAm gera proteínas – dentre elas a RNA polimerase dependente de RNA (replicase). Essa proteína, então, fará a síntese de um intermediário de replicação – um RNA- complementar ao RNA+. A partir da ação da replicase, o RNA- dá origem a uma nova fita positiva. Após isso, há a montagem da partícula, sem a inclusão da replicase, uma vez que o genoma parte para novas infecções, onde novas replicases são produzidas imediatamente após a infecção. Assim, dizemos que vírus de RNA+ possuem o genoma é infeccioso – isto é, basta ele para que a infecção seja realizada. d) Vírus de RNA fita simples negativa Ao contrário do RNA+, que já é o próprio RNAm, o RNA negativo é o complementar ao RNAm, não podendo, portanto ir para o ribossomo ser traduzido. Para que consigam realizar a replicação, esses vírus devem trazer consigo uma RNA polimerase RNA dependente, já que as células do hospedeiro não possuem tal enzima. Uma vez dentro da célula, o vírus se vale desta replicase para produzir o RNAm +, que pode, então, ser traduzido em mais replicases e proteínas estruturais. Isso, pois, permite a síntese de novas fitas de RNA negativo a partir da original. Assim, gera-se primeiro um RNA+, para que depois seja gerado um RNA- a ser utilizado na montagem das novas partículas virais. e) Vírus de RNA dupla fita Embora esse vírus tenha ambas as fitas positiva e negativa, a fita positiva não corresponde totalmente ao RNAm, de modo que o RNA não é desfeito para que essa fita positiva seja usada. Neste genoma, há uma RNA polimerase associada, por meio da qual gera-se o RNAm a partir da fita negativa, ainda dentro do capsídeo. Assim, essa fase pré-replicativa independe da célula hospedeira. Esse RNAm+, então, é exportado para a célula do hospedeiro, onde é traduzido, gerando proteínas e novos RNAs dupla fita para montar a partícula viral – comportamento semelhante ao vírus de genoma RNA-. f) Retrovírus O retrovírus, apesar de possuir um genoma RNA fita positiva simples, não se comporta como tal, pois necessita passar por uma fase de DNA na sua replicação, não sendo, portanto, infeccioso. Este evento é garantido pela transcriptase reversa (RT), replicase associada ao genoma, a qual possui três tipos de atividade: DNA polimerase RNA dependente (sintetiza DNA a partir de uma fita de RNA); RNaseH (degrada RNA híbrido, isto é, que é metade RNA e metade DNA, degradando apenas o RNA nessas fitas hibridas); DNA polimerase DNA dependente (gera próvirus, que vão para o núcleo e se integram ao genoma por ação da integrase, também presente junto ao vírus). Tendo isso em vista, quando o RNA+, a RT realiza suas atividades: gera uma fita de DNA complementar ao RNA+; degrada o RNA+; e gera o DNA complementar ao DNA previamente sintetizado – e ambas formam o provírus. Esse provírus, então, vai para o núcleo e se integra no genoma com o auxílio da integrase. Feito isso, ele passa a se comportar como o DNA da célula, sendo transcrito por meio da DNA pol II, também pode passar por splicing, dependendo do vírus. A partir disso, podem ser formados o RNAm (alguns genes) ou genômico (toda extensão do genoma do vírus). O RNAm vai para o citosol, onde é traduzido e dá origem à mais RTs, além de outras proteínas estruturais. Essas proteínas comporão a membrana do envelope, onde ficam ancoradas, ou formam o capsídeo, permitindo a saída do vírus da célula com duas copias de seu genoma nas partículas virais. g) Hepadnavirus (Hepatite B) O vírus da hepatite B possui DNA dupla fita, chamado parcial – isto é, é dupla fita apenas em uma região. Esse vírus utiliza RNA polimerase da célula para produzir seus RNAm e RNA pré-genômico fita positiva, o qual abrange toda extensão do genoma também. A partir daí, o RNAm é traduzido, gerando proteínas estruturais e transcriptase reversa. O RNA pré- genômico fita positiva, então, é empacotado no capsídeo junto à RT, a qual transforma a fita de RNA em uma de DNA dupla fita, por meio de suas ações já descritas. Assim, o DNA genômico dupla fita desse vírus é gerado dentro do capsídeo. Vale ressaltar que a falha em cumprir quaisquer etapas leva a uma infecção não produtiva ou abortiva. A infecção só é produtiva caso produza vírus infecciosos, que conseguem infectar nova célula e produzir progênie viral. Por fim, enquanto A DNA pol possui atividade de correção 3’-5’ (exonuclease; proofreading), o que resulta em uma mínima taxa de erros, ao contrário da RNA polimerase, que possui mínima atividade de correção 3’-5’. Isso significa que o genoma de qualquer vírus RNA individualmente irá conter certo número de mutações, quando comparado à sequênciaconsenso selvagem para aquela espécie viral. Isto tem importantes implicações para a biologia e evolução dos vírus de genoma RNA, uma vez que significa que uma população de uma determinada espécie de vírus não é geneticamente homogênea, nem na natureza, nem em laboratório. Como consequência, vírus de genoma RNA podem evoluir ate um milhão de vezes mais rápido que os vírus que tem DNA como genoma. Contudo, há um preço: altas taxas de erro de polimerase impõem limites importantes no tamanho do genoma. Poucos genomas de vírus “RNA” contem mais de 30kb e a maioria possui entre 5 e 15kb. Portanto, vírus de genoma DNA possuem maior variabilidade do que aqueles que possuem RNA como genoma. 4) Automontagem e Liberação de Novas Partículas Essas duas etapas estão associadas à maturação, que nada mais é do que a partícula com capacidade infecciosa. Uma vez sintetizadas as proteínas, o vírus deve fazer sua automontagem – processo intrínseco a ele – e os locais onde tal processo ocorre está relacionado ao local de sua replicação. Por exemplo, em vírus que se replicam no núcleo, a montagem é feita no próprio envelope nuclear; outros vírus podem usar Golgi, retículo, citosol (em regiões livres de organelas); outros, ainda, fazem a montagem logo abaixo da membrana, no local onde sairão por brotamento. Todas essas vias, porém, são inerentes a vírus envelopados. Os vírus não envelopados saem da célula por lise: eles tomam todo o citoplasma, se dispondo em arranjos paracristalinos, até que a célula fique abarrotada de vírus, culminando em sua lise. • Patogênese I Até então, vimos estratégias utilizadas pelo vírus para entrar na célula, em um ambiente microscópico. A partir de agora, veremos como o vírus realiza a infecção em um ambiente macroscópico. O vírus em suspensão no ambiente deve encontrar seu hospedeiro, entrar na célula e causar a infecção – processo esse que é ineficiente. Nesse sentido, o processo pelo qual os vírus causam doença no hospedeiro é chamado de patogênese, o qual leva a uma soma de efeitos no hospedeiro, resultado tanto da replicação viral, quanto da resposta antiviral produzida pelo sistema imune do indivíduo. Além desse, outro conceito importante é o de patogenicidade ou virulência, que se refere à capacidade de um vírus ou outro organismo de produzir doença. Assim, enquanto a patogênese é o processo pelo qual o vírus produz a doença, enquanto virulência refere-se à intensidade da infecção. OBS: O conceito de virulência é comparativo, e só faz sentido quando se compara com outros vírus ou com diferentes condições do hospedeiro. Assim, um vírus só é virulento dependendo do parâmetro de comparação. Outro conceito importante é o de iceberg ou pirâmide de infecções. Na pirâmide se compara a exposição do hospedeiro e da célula, onde pode se fazer um paralelo entre as duas condições. A base da pirâmide representa a exposição sem ter infecção, denotando a dificuldade de um vírus infectar. A seguir, há as infecções sem sintomatologia; na metade de cima, ocupando uma fração bem menor, há as doenças de sintomatologia moderada. Acima dessa, estão presentes casos muito graves, seguido do pico, onde localizam-se casos em que a doença leva à morte. Esse conceito mostra a dificuldade de vírus levarem seu hospedeiro à morte, o que é importante, na medida em que há a exposição constante dos indivíduos a diversos vírus. Vale ressaltar que alguns vírus fogem a etapas dessa pirâmide, como a varíola, que não apresenta infecções assintomáticas e o vírus da raiva, que é 100% letal. A patogênese é dividida em etapas, visto que o organismo é dotado de barreiras biológicas para combater infecções, as quais garantem a ineficiência da maioria delas. Dessa forma, o vírus deve vencer tais barreiras para avançarem na patogênese e subir na pirâmide, e, conforme isso ocorre, o organismo responde tentando contê-lo. Ainda, se o vírus falha em completar qualquer uma dessas etapas, ocorre uma infecção abortiva, subclínica, branda, ou ausência de infecção. *Etapas da Patogênese: As etapas da patogênese são: entrada; replicação primária; disseminação; replicação secundaria e transmissão. A disseminação e replicação secundária não são etapas necessárias para transmissão, donde deve-se ressaltar que: disseminação é o processo que ocorre dentro de um mesmo hospedeiro, enquanto transmissão ocorre de um para outro hospedeiro. Desse modo, em uma infecção localizada, ocorrem as etapas de entrada, replicação primaria e transmissão, não havendo disseminação e replicação secundária, ao contrário da infecção sistêmica, onde acontecem todas as etapas. Nesse processo, o vírus entra por uma porta de entrada e replica no local de entrada (linfonodos regionais), a partir de onde é transmitido, no caso de infecção localizada. Caso a infecção seja sistêmica, há a replicação primária, seguida de disseminação sanguínea ou neural (viremia primaria), que atinge órgãos principais do corpo, sobretudo fígado e baço. Após infectar esses órgãos, realizará replicação secundária neles, para, por fim, cair novamente na circulação novamente (viremia secundária), ganhando órgãos por onde tem tropismo, até ser transmitido. 1. Entrada A entrada se dá pelas portas de entrada, específica para cada vírus, e são elas: conjuntiva, trato respiratório, urogenital, gastrointestinal, ânus, pele, etc., as quais oferecem a primeira barreira de entrada. Em sua camada mais externa, a epiderme apresenta células mortas que impedem a infecção, as quais constituem a primeira barreira de infecção. A maioria dos vírus que entram pela epiderme realiza infecção localizada, devido à distância dos vasos sanguíneos, localizados mais profundamente. O trato urogenital, por sua vez, é bastante utilizado por vírus de DSTs, entrando por microfissuras durante o ato sexual. Já a conjuntiva também esta associada a infecções localizadas, e conta como barreiras a lágrima, cílios e pálpebras. Porém, as portas de entrada mais comuns são os tratos respiratório e gastrointestinal. O primeiro é mais flexível quando se trata de infecções locais, que poderão estar em qualquer lugar do trato – ou seja, são bem abrangentes. A barreira que o vírus deve atravessar é o muco do trato respiratório. Além disso, vírus que por aí entram possuem características em comum, como a replicação favorecida em baixa temperatura mais baixa, encontrada no trato respiratório devido a circulação de ar. Já no caso do trato gastrointestinal, os vírus entram no corpo pelo intestino, atravessando as células M da mucosa, do lúmen, e se replicam, por fim, nas células abaixo delas. Geralmente, esses vírus não são envelopados, pois precisam enfrentar várias condições adversas durante o caminho, como o pH ácido estomacal; presença de proteases e outras enzimas digestivas; sais biliares; muco com IgA, etc. 2. Replicação Primária A replicação primária acontece nos linfonodos regionais, próximos ao local onde ocorreu a entrada. Após a replicação, eles ganham capilares e a grande circulação. A replicação culmina em viremia primária – isto é, alta concentração de vírus no sangue. 3. Disseminação No processo de disseminação, existem duas vias: hematógenas ou sanguínea – mais utilizada – ou neural, as quais não são excludentes (o vírus da pólio usa ambas). A escolha da via depende de diversos fatores, como a cepa do vírus, da fase em que ele se encontra na patogênese e da porta de entrada. OBS: Por exemplo, reovirus tradicionalmente entra pelo TGI e faz infecção localizada, porém, há cepas que disseminam por via sanguínea para o SNC. Em outros casos, quando se altera sua porta de entrada para intramuscular, essas cepas eu não disseminam normalmente acabampor disseminar para SNC pela via neural. No caso da disseminação via sanguínea, é importante ressaltar a viremia - concentração de vírus nos sangue -, determinada entre a produção celular e o que é retirado da circulação por meio do sistema imune. A viremia pode ser primária ou secundária (dependendo da replicação) e ativa (pela infecção) ou passiva (pela inoculação de vírus no sangue, não sendo fruto de replicação do vírus no organismo; só ocorre em insetos). Ainda, eles podem circular livres no plasma ou infectar células sanguíneas. Já a via neural é utilizada por poucos vírus, sendo uma via extremamente rápida e capaz de esconder o vírus do sistema imune, o que torna mais complexa a montagem de uma resposta humoral. Ainda, a disseminação pode ser retrógrada - quando o vírus caminha do axônio para o corpo celular – ou anterógrada – onde o vírus realiza o caminho inverso. OBS: O tipo de disseminação é importante, pois permite a determinação da fase da patogênese. O vírus da herpes, por exemplo, entra em latência no neurônio, onde se desloca retrogradamente (apenas o DNA do vírus entra no neurônio, ficando em forma epissomal, semelhante a um plasmídeo). Sua reativação leva ao transporte anterógrado para as células que aquele neurônio inerva na boca. Por isso, a infecção da herpes geralmente ocorre no mesmo lugar. Ainda, existem três termos importantes que devem ser enfatizados: neurotrópico, neuroinvasivo e neurovirulento. O primeiro indica o tropismo do vírus pelas células do sistema nervoso, onde realiza sua replicação. Já o segundo termo se refere aos vírus que devem entrar no SNC para a replicação, após infectar um sitio periférico. Por fim, o terceiro termo denomina vírus que causam doença devido a replicação no SNC, manifestada por sintomas neurológicos. Por exemplo, herpes é pouco neuroinvasivo, embora seja neurotrópico e altamente neurovirulento, uma vez que faz a invasão; já raiva é muito neuroinvasivo e neurovirulento. 4. Replicação secundaria A replicação secundária está intimamente ligada ao conceito de tropismo, uma vez que esse processo ocorrerá em locais que os vírus possuam tropismo – ou seja, afinidade por determinados órgãos ou regiões. Nesse sentido, existem dois tipos de tropismo: tropismo limitado e tropismo pantrópico. O primeiro é quando o vírus possui preferência de replicação por poucos tecidos, enquanto o segundo se refere a vírus que são capazes de infectar muitos órgãos. Existem diversos fatores envolvidos no tropismo, tais como: presença de receptores (mas não só!), fatores virais, transcricionais (ativação gênica do vírus), celulares, próteses celulares, região de brotamento do vírus ao sair da célula, etc. Assim, além da presença de ligante- receptor, a célula deve conter todo aparato necessário para a replicação do vírus, bem como o vírus deve apresentar características que se encaixem àquele tipo celular, tornando cruciais os fatores intrínsecos celulares e virais. Nesse sentido, existem as células susceptíveis e permissivas: células que apresentam receptor para determinado vírus são susceptíveis; porém, além disso, devem ser permissivas à replicação viral dentro delas, o que é determinado por fatores intracelulares que favorecem a infecção. A soma da permissividade e susceptibilidade com fatores virais é o que permite o tropismo. OBS: Experimento para detectar se célula não susceptível é permissiva é expressar o receptor nessa célula. Células de camundongo transgênicas expressam receptores para vírus da pólio e foi neles que se estudou a doença. Os níveis de permissividade das células podem ser diferentes, o que leva aos diferentes tropismos. O fato de ser permissivo determina a replicação, e os fatores que as células oferecem para a replicação determina o tropismo – ou seja, onde os vírus terão preferência de se replicar. Após alcançar os órgãos que tem tropismo, o vírus retorna para porta de entrada – local que também tem tropismo, uma vez que foi o local de entrada -, por onde é transmitido. Por exemplo, um vírus que tem como porta de entrada o TGI, será transmitido via oral-fecal. • Patogênese II: Padrões de Infecção Viral Padrões de infecção viral são quadros de como a doença causada pelo vírus se manifesta no indivíduo, assumindo, nesse caso, que haverá sintomatologia. *Conceitos: - Vírus citopáticos: são aqueles que produzem uma manifestação clara do vírus no órgão ou cultura de células infectada por ele, através de alterações morfológicas. Para cultura de células, diz-se que o vírus é citolítico. - Vírus não citopáticos: são vírus que não produzem alteração morfológica nas células ou tecidos que infectam. - Infecção produtiva: é aquela que produz partículas virais infecciosas, ou seja, progênie viral, tanto a nível microscópico (celular), quanto a nível macroscópico (hospedeiro como um todo). - Infecção não produtiva: é aquela que, no ambiente microscópico, não é capaz de produzir partículas maduras, por falha nas etapas de replicação. Qualquer falha nas etapas de patogênese, diz que a infecção não foi produtiva. A infecção não produtiva pode ser, ainda, abortiva ou latente: a abortiva é quando o vírus aborta a infecção em algum estágio da patogênese, seja por controle do sistema imune ou por defeito em alguma função importante para a realização de alguma das etapas. Em outras palavras, é quando um vírus deve alcançar um determinado local, mas não o faz com êxito. Já a latente é quando o vírus para de produzir partículas infecciosas, durante um determinado período. *Padrões de Infecção: As doenças podem apresentar dois tipos de padrões de infecção: aguda ou persistente – a qual se subdivide em persistente clássica ou crônica, lenta, e latente. Dependendo do hospedeiro, o vírus pode realizar infecção aguda ou persistente. Por exemplo, o arbovírus é um vírus que possui fase de replicação em artrópodo, onde realizam infecção persistente clássica, e outra fase em vertebrado, onde fazem infecção aguda. Na infecção aguda, o vírus entra no organismo e leva certo tempo para tentar estabelecer a infecção, tendo de vencer diversas barreiras, como muco, além das respostas inatas do sistema imune. A partir de um determinado momento – chamado de limite -, o vírus supera a resposta inata, e continua a se propagar, aumentando a produção de novos vírus. Durante esse período, o organismo monta uma resposta adaptativa (humoral e celular, baseadas em células T e anticorpos). Quando a resposta adaptativa está em seu auge, combate a infecção e controla o vírus, promovendo decaimento em sua quantidade, até o momento em que há o clearance do vírus – ou seja, a limpeza do vírus do organismo. Se todo esse processo ocorre, dizemos que a infecção foi aguda. Porém, se após todo esse processo, o organismo não consegue se livrar do vírus, dizemos que a infecção foi persistente. Assim, na infecção aguda, ou o organismo elimina o vírus, ou é eliminado por ele; já na infecção persistente, o vírus permanece no organismo por diversos meios inerentes à ele, em que o individuo convive com o vírus sem que haja sua eliminação, o que pode levar ou não à sua morte do hospedeiro. OBS: Tanto infecções localizadas quanto sistêmicas podem se manifestar com um padrão agudo de infecção! ➢ Tipos de Infecção Persistente - Clássica ou Crônica: nesse caso, o individuo é infectado e há produção de vírus, sem a apresentação de sintomas. O vírus convive bem com o hospedeiro por muito tempo, produzindo partículas virais sem que as células do hospedeiro sejam afetadas. Porém, em um determinado momento, os sintomas podem aparecer e provocar a morte do hospedeiro. - Infecção Lenta: o vírus entra na célula e estabelecesua infecção, seguida de uma fase aguda. Porém, quando o sistema imune controla a ponto de baixar muito a carga viral, o vírus consegue escapar desse controle, a fim de manter sua produção, ainda que baixa. Essa baixa produção, ao longo do tempo, pode levar a uma soma de efeitos não mais controláveis pelo sistema imune, de modo que aparecem os sintomas que podem levar à morte do indivíduo. OBS: As vezes a produção pode estar mais alta, ou mais baixa no caso da infecção crônica, o que pode provocar confusão entre ela e a infecção lenta. - Latente: é aquela em que realmente há, na maioria das vezes, produção de vírus e sintomatologia, como no herpes. Nesse caso, o vírus, uma vez dentro do hospedeiro, pode entrar em latência em um determinado momento, onde não há produção de partículas virais, embora o material genético do vírus ainda esteja presente. Durante o período de latência, o genoma viral assume forma epissomal, e não se integra ao DNA. Além disso, há apenas expressão de um pequeno número de genes virais, os quais estão associados à latência - porém, os genes são expressos a nível de RNAm, e não a nível proteico. Uma vez findado o tempo de latência, esses genes não mais serão expressos, dando lugar à expressão de genes participantes da replicação viral, a fim de promover a reativação do vírus. OBS: Latente x crônica – na latente há ausência de produção de partícula viral, ou seja, não tem expressão do material genético, embora haja o material genético. Na crônica, tem produção de vírus, mesmo que baixa. Contudo, para que o vírus realize infecção persistente, deve ser capaz de promover alguns eventos tais como: limitar seu efeito citopatico (CPE), isto é, limitar seu potencial de causar alterações morfológicas na célula hospedeira; manter seu genoma nas células hospedeiras durante o processo infeccioso; e evitar eliminação pelo sistema imune do hospedeiro. O efeito citopático pode ser evitado quando o vírus invade determinadas células, que, geralmente são semi ou não permissivas, de modo que não replicam, embora mantenham seu genoma na célula. Por exemplo, herpes causam efeito citopático na epiderme, mas não nas células nervosas. Além desse, outro mecanismo para reduzir o CPE é produzir alterações metabólicas na célula, como a inibição da síntese de proteínas das células (shut off). Isso é importante para a latência ou persistência, na medida em que a inibição da produção proteica leva à morte da célula e sinaliza ao sistema imune de que há algo errado com ela. [mas a morte da célula não é interessante para o vírus] Além de diminuir o CPE, o vírus deve manter seu genoma nas células hospedeiras, o que pode ser feito de três formas: integração do genoma do vírus no genoma do hospedeiro; manter seu genoma na forma epissomal ou realizam alta taxa de mutação. Por exemplo, vírus de RNA, como da família de flavivírus, se valem muito do último processo. Por fim, para realizar a infecção persistente o vírus também deve evitar sua eliminação pelo sistema imune. Para tal, o vírus faz expressão restrita ou nenhuma das proteínas virais, como na infecção latente. Ou, ainda, pode infectar sítios imunologicamente privilegiados, os quais são locais de difícil acesso pelo sistema imune, como SNC (a barreira hematoencefálica limita o acesso de linfócitos e neurônios não expressam moléculas MHC classe I ou II), rins e in fe c ç õ e s p e rs is te n te s ou crônica Persistente clássica epiderme (acesso limitado de linfócitos T em ambos os casos). Por fim, o vírus também pode levar a redução da expressão de antígenos MHC classe I e II e outras moléculas de adesão, como ICAM-1 e à interferência com a resposta antiviral por citocinas OBS: É mais fácil para vírus DNA fazer persistência, pois pode fazer epissoma ou integrar. Já para RNA é mais difícil, pois não integram, nem fazem epissomas; antes, se valem de mecanismos de mutação, gerando quasispécies. *Manifestação da Infecção: Vimos até agora os padrões de infecção, que, uma vez estabelecida, pode ser aguda ou persistente. Dentro dessa manifestação, independente do padrão de infecção, existem fases clinicas das manifestações analisadas pelo médico. O primeiro período da manifestação é o período de encubação – período compreendido entre o inicio da infecção e o aparecimento dos sintomas. Após isso, começa o período prodrômico ou os pródromos da doença – período da infecção em que os indivíduos apresentam sintomas clínicos gerais e inespecíficos da doença (comuns a diversas viroses), como febre, mal estar, etc. Este evento possui relação com a resposta inata atuando para eliminar a infecção. Neste período, tem inicio o período de infecciosidade, no qual o indivíduo infectado permanece excretando o vírus, ou seja, transmitindo o vírus. Após isso, tem início o período de sintomatologia específica, que são os sinais clínicos específicos da doença, em que o individuo infectado ainda transmite o vírus. • Interação Vírus-Célula: Vimos que os vírus, para sobreviverem, invadem as células hospedeiras, multiplicam seu genoma e expressam proteínas para formar novas partículas virais, as quais serão liberadas, num processo chamado ciclo replicativo viral. Apesar de parecer um processo no qual os vírus são os principais atores, a célula hospedeira também possui participação ativa. A partir do primeiro contato com o vírus, há o disparo de mecanismos de proteção diversos para evitar a instalação do parasita. Os mais comuns e primeiramente descobertos foram a indução do efeito citopático e as alterações metabólicas celulares. Contudo, conforme o conhecimento avança, novos mecanismos de interação vírus-célula vão sendo elucidados. Aqui trataremos de alguns deles. 1. Mais antigos: 1.1. Efeito Citopático: O efeito citopático corresponde às alterações morfológicas que um vírus induz ao entrar nas células. Este processo não é característico de todos os vírus ou células hospedeiras, variando entre os diferentes tipos de envolvidos. Um exemplo clássico de efeito citopatico é a formação da placa viral, que pode ocorrer por duas causas. A primeira se dá pela lise da célula hospedeira, no momento da saída do vírus para o meio extracelular. Já o segundo, pela alteração na morfologia celular, que se torna arredondada, levando à perda parcial de aderência da célula na placa. Neste segundo caso, o que ocorre é a interação do vírus com componentes do citoesqueleto, os quais ele recruta para beneficio próprio. Assim, pode ocorrer mobilização de proteínas do citoequeleto para transporte de proteínas virais; rompimento das fibras de stress (porções do citoesqueleto que envolvem a periferia da célula, mantendo-a íntegra) para saída da célula; indução da polimerização de caudas de actina, eu agem como catapultas para lançamento de novas partículas virais a longas distancias, a fim de atingirem novas células. OBS: A presença das caudas de actina está relacionado ao tamanho da placa viral. Isto está diretamente relacionado à distancia com a qual o vírus consegue ser lançado – quanto menor a cauda, menor a distancia. Desse modo, vírus que induzem a formação de grandes caudas de actina apresentam placas virais maiores, enquanto vírus que formam caudas menores apresentam placas menores e vírus que não induzem formação de cauda, placas mínimas. Vale lembrar que, em todos esses casos, o vírus recruta as proteínas celulares adequadas e as induz a realizarem essas funções, uma vez que o genoma viral não codifica para todo o aparato necessário. 1.2. Alterações Metabólicas: O exemplo mais conhecido é o shut off da síntese de proteínas, o qual foi primeiramente detectado via marcaçãoda síntese por cisteína radioativa. Atualmente, sabe-se que existem vários mecanismos pelos quais essa inibição pode acontecer. Estão entre eles a degradação de RNAm celular; competição do RNAm viral e celular pela tradução; inibição do transporte do RNAm celular do núcleo para o citoplasma; inibição do splicing dos RNAs celulares; cap snatch - vírus que não possuem RNAm com cap roubam o cap do RNAm celular, que garante o reconhecimento pelos fatores de tradução; indução da tradução viral via IRES (determinadas regiões secundarias, com ligações intracadeia, presentes em alguns vírus, que são reconhecidas pela subunidade menor do ribossomo de forma estável, permitindo a tradução) em vez de cap; etc. OBS: A descoberta do IRES revolucionou o que se sabia sobre tradução e ocorreu em experimentos que mediam a tradução em plasmídeos contendo dois genes marcadores: o primeiro vinha acoplado a um cap e o segundo, poderia ter apenas RNA de espaçamento ou IRES. A tradução ocorria normalmente para o primeiro gene, o qual estava acoplado ao cap, mas no segundo, dependia da presença do IRES ou do RNA de espaçamento. Se o plasmídeo contivesse RNA de espaçamento, a segunda proteína não era feita, o que não acontecia caso houvesse a presença do IRES, de modo que a segunda proteína era traduzida mesmo após o códon de parada do primeiro gene. Assim, descobriu-se que o IRES possibilitava o recomeço da tradução em células não infectadas. Em células infectadas, por sua vez, a presença de cap e IRES levava o ribossomos a privilegiar a proteína acoplada a IRES. Isso acontecia porque a célula infectada levava a uma clivagem de um fator de tradução importante pra tradução por cap. Hoje se sabe que 10% dos RNAs celulares possuem IRES pra situações de stress. Os genes relacionados a ele são geralmente de ciclo celular, desenvolvimento, diferenciação, hipóxia, stress, etc. 2. Mais modernos: 2.1. Alterações do ciclo celular: Dentre as alterações mais comuns, está a indução da entrada no ciclo celular, com fins de síntese do material genético e proteínas virais durante a fase S. Geralmente realizado por vírus de DNA, isso se dá a partir da manipulação de fatores supressores de tumor/controladores do ciclo, sendo os mais expressivos, Rb e p53. O fator Rb constitutivamente inibe um complexo transcricional importante de entrada num novo ciclo celular – o complexo E2F-DP. Nesse sentido, os vírus impedem essa inibição. Além disso, eles também podem recrutar o próprio complexo E2F-DP para funcionar como fator transcricional para o próprio vírus. Já a proteína p53 controla a regulação de p21, importante para entrada no ciclo celular. 2.2. Alterações na transcrição: A transcrição pode ser acelerada por alguns vírus, como os herpes, por aumento da afinidade da RNA polimerase II por seu promotor viral, bem como aumentando a eficácia do recrutamento dos fatores auxiliares. 2.3. Alterações nos mecanismos de morte celular: Dentro deste aspecto, os vírus podem manipular os processos de apoptose e autofagia. A manipulação da apoptose se dá no sentido de inibi-la ou induzi-la, em diversas fases, a partir de genes específicos no genoma viral, os quais codificam proteínas pró ou anti-apoptóticas. A via mais afetada é a intrínseca e a marcação é feita via citocromo c, clivagem de caspases, etc. Já no caso da autofagia, de modo parecido com a apoptose, ela pode ser induzida ou inibida, sendo a marcação feita por LC3. Muitos vírus induzem a formação, por exemplo, de autofagossomos, onde eles ficam protegidos, replicando, sem deixá-lo maturar e dar continuidade a autofagia. • Diagnóstico Para que o diagnóstico seja dado, é importante saber a porta de entrada do vírus e o período em que a patogênese se encontra, a fim de que os exames adequados sejam feitos. Os métodos utilizados para diagnóstico da infecção viral são: isolamento viral por inoculação de ovos embrionados; isolamento viral por propagação de vírus em cultura de células (detecção de CPE); visualização de partículas virais; testes sorológicos (detecção de antígenos ou anticorpos virais) e detecção de ácido nucleico viral. 1) Isolamento Viral em Ovos Embrionados Neste método, o vírus pode ser inoculado em diferentes locais do ovo para se propagar. Esse, pois, é um método fácil, uma vez que inocula-se no ovo um vírus que antes estava em uma célula semi-permissiva, de modo que dificulta-se a replicação do vírus. O número de dias do embrião no qual o vírus é inoculado depende do tipo de vírus, o que possui relação com a geração de INF – dependendo do dia do embrião, há maior ou menor produção do INF, o que interfere diretamente a replicação do vírus. Além disso, a temperatura de encubação também é importante. O vírus é, geralmente, colocado na membrana coloalantoica, e depois o ovo é colocado em uma estufa. Ao final do de um determinado tempo, o ovo é aberto e a membrana coloalantoica é retirada. 2) Isolamento Viral em Cultura de Células Este método consiste na amplificação da quantidade do suposto patógeno, facilitando sua detecção e caracterização, a partir de culturas primárias (retiradas diretamente dos tecidos), células 2n, linhagens estabelecidas ou células hematopoiéticas. Além disso, pode-se realizar a identificação de CPE, através de alterações morfológicas ou corpos de inclusão. Porém, embora isso seja eficaz para verificar a infecção da célula, não deve ser utilizado como diagnostico, pois muitos vírus fazem isso. OBS: Linhagens estabelecidas podem ser células transformadas de origem cancerígena ou células existentes no laboratório em geral, as quais têm tempo de vida definido e não são 2n, possuindo, portanto, características diferentes. A cultura de células pode ser utilizada para diagnóstico em casos específicos, como por exemplo, como no diagnóstico para herpes, a partir da célula Elvis. Essas células têm um promotor no genoma que coordena a expressão do marcador lacZ. Esse promotor apresenta em sua estrutura um sítio de ligação para fator de transcrição de herpes, onde se ligam proteínas VP16 e ICP0, os quais, uma vez ligados, promovem a transcrição do gene lacz. 3) Visualização de Partículas Virais Para a visualização das partículas virais, um método muito utilizado é a microscopia eletrônica de transmissão, por contrastação negativa ou corte de células infectadas. Porém, possui algumas desvantagens, como: possuir o microscópio; o fato de a maioria dos vírus possuírem a mesma simetria, dificultando sua distinção. 4) Detecção de Antígenos Virais O teste mais comum para a detecção de antígenos virais é um teste chamado de hemoaglutinação – o qual nada mais é do que a ligação de um receptor celular ao antirreceptor na partícula viral, e, claro, só serve para hemácias. Nesse teste, o vírus se liga ao receptor e aglutina na hemácia. Na sequência, são realizadas diluições da amostra, em que se verifica a aglutinação ou não das hemácias – na presença do vírus, elas se aglutinam e recobrem a parede do pocinho, e, em ausência do antígeno viral, elas se depositam no fundo. Porém, este método não distingue entre vírus infecciosos ou não infecciosos. Outro método para detecção de antígenos é o teste ELISA de captura, utilizado para detecção de partículas virais, e não para anticorpos contra o vírus. Nesse caso, utiliza-se uma placa de 96 poços, onde, em cada poço, existe o anticorpo de captura, ou seja, que reconhecem a partícula viral. O antígeno viral, então, é adicionado, juntamente com um anticorpo secundário acoplado a um indicador, o qual indica se houver a reação. Por fim, outro método que também detecta antígenos é são testes imunocromatográficos. Esse teste consiste em um papel especial cromatográficocom uma membrana de nitrocelulose em cima, em várias camadas. Existem dois grupos de AC nessas membranas: um móvel e outro fixo. O que se faz, então, é pingar uma gota da amostra que, por capilaridade, migra para uma faixa onde se encontram os AC móveis. Os vírus se ligam aos AC e continuam migrando até a outra faixa onde se localizam os AC fixos, que funcionam como controle para a validação do teste. 5) Testes Sorológicos Todos os testes citados são sorológicos, porém, nesse caso, são testados anticorpos a fim de inibir o vírus de fazer o que ele deve fazer. Assim, por exemplo, realiza-se inibição do teste de hemoaglutinação: o vírus é colocado em contato com o soro do paciente, que, se tiver AC contra o vírus, deve ser capaz de impedir a hemoaglutinação. Assim, nesse caso, o indivíduo positivo é aquele em que as hemácias ficaram depositadas no fundo e negativo é o indivíduo cujas hemácias aglutinaram. Já no caso do ELISA, há agora a detecção de AC contra determinada doença. No fundo das plaquinhas, em vez de anticorpo, colocam-se antígenos virais, que entram em contato com o soro do paciente. Porém, deve-se atentar pra o AC secundário utilizado – IgG, por exemplo, é anticorpo de memória também, e não necessariamente reflete uma infecção, ao contrário de IgM. No teste imunocromatográfico, por sua vez, em vez de os ACs estarem na membrana, colocam-se os antígenos virais conjugados a ouro coloidal. O soro do paciente, então, é inoculado e passa pelas linhas de antígeno, reagindo com eles caso os AC estejam presentes nessa amostra de soro. De novo, detecta-se se há AC, e não partícula viral em si. O PRNT (plaque reduction neutralization test) é um teste de neutralização mais específico, utilizado para detectar se o indivíduo possui anticorpos neutralizantes – os quais se ligam à proteína do vírus, bloqueando sua interação com a célula, neutralizando a infecção. Isso é importante, na medida em que o paciente pode ter altos níveis de AC, mas sem a capacidade de neutralizar a infecção. Assim, o AC neutralizante garante que o indivíduo está apto a neutralizar a infecção. No PRNT, o soro do paciente é diluído em uma placa de 96, misturado com determinada quantidade do vírus. Após isso, encuba-se a amostra para que o AC neutralizante se ligue ao vírus. Depois da encubação, coloca-se essa mistura em uma cultura de células, e, assim mede- se a capacidade de neutralização pela capacidade das células serem infectadas. O resultado é medido pela formação de placas virais na cultura. Analisando-se as diferentes diluições, pode- se ter uma ideia se o individuo tem ou não esses ACs neutralizantes - quanto maior a diluição e menor a formação de placas, maior possibilidade de o individuo possuir ACs neutralizantes. O teste deve ter um controle positivo, que é uma pessoa controle referencia. Nesse controle, as placas virais só aparecem a diluições muito altas. Dependendo do vírus, a partir de certa diluição já se considera neutralizante. Obviamente só pode ser feito pra vírus que formam placas. Se o individuo já foi vacinado, o resultado pode ser decorrente a isso. Por fim, o western blotting também é usado, geralmente para confirmar o teste de ELISA. 6) Testes de Acido Nucleico O primeiro exemplo é o PCR, o qual exige certo conhecimento de que vírus se trata, como a qual família ele pertence, o que é importante para a escolha dos primers. Assim, deve-se ter um diagnostico clinico prévio que guie a escolha desse teste. No PCR, os vírus são diferenciados pelo tamanho do fragmento amplificado – o que pode ou não ser claro entre dois vírus. Com isso, parte-se para o RFLP, outro teste com enzimas de restrição, que clivam o clivam DNA em regiões chamadas de palindrômicas em sítios de diferentes tamanhos. Nesse teste, o amplicon (produto do PCR) é cortado com enzimas de restrição. Assim, sabendo-se a sequência de alguns genes do vírus, consegue-se determinar a enzima de restrição e determinar se aquele fragmento é daquele vírus. Caso haja polimorfismo na zona de clivagem, não há o reconhecimento do sitio de clivagem. Vírus de mesma família (espécies diferentes) geralmente apresentam esses polimorfismos que permitem diferenciar os pontos de clivagem. Outro tipo de PCR é o PCR multiplet - trata-se de kits de PCR que contêm pares de primers diferentes e específicos para diferentes doenças. Dessa forma, há a possibilidade de detecção de diferentes vírus a partir de um único kit. Embora ótimo, não é muito simples, pois os primers devem ser diferentes e específicos, de modo que o primer de um vírus não pode reconhecer nenhuma sequência de outro. Além disso, os amplicons devem possuir tamanhos diferentes. Ainda, os primers tem de estar nas mesmas condições de nucleotídeos, temperatura de anelamento, condições da reação em geral, etc. Já o nested-PCR é o que utiliza o produto da primeira reação de PCR como input para a segunda. Isso é usado, pois muitas vezes na primeira o resultado da negativo pela baixa taxa de DNA presente, o que não quer dizer que a pessoa não esteja infectada, mas sim que a infecção não esta grande ainda. Nesse segundo PCR, caso haja trecho amplificado, ele é amplificado mais ainda, permitindo sua detecção. O amplicon de segunda reação pode ser menor que o da primeira, por causa dos primers (nested). No semi-nested, utiliza-se um primer igual o da primeira e um diferente. Nested é quando os dois são diferentes. Quando se usa os mesmos nos dois, chama-se reamplificação. Todo PCR negativo é feito um nested PCR depois, para reconfirmar. Por fim, no Real Time PCR é possível realizar a distinção com pouca quantidade, além de dispensar a corrida no gel, por permitir a visualização direta. • Respostas Antivirais: A infecção por um vírus leva à ativação do sistema imune do hospedeiro, o qual responde de modo a iniciar uma resposta inata e, na sequência, adaptativa. A resposta inata, restrita a uma região localizada, é conferida basicamente pela produção de citocinas, dentre elas uma família muito importante no combate às infecções virais: dos interferons. Os interferons, como dito, são proteínas da família das citocinas, amplamente expressas e que têm forte atividade antiviral, antiproliferativa, anti-tumor e atuação sobre a resposta imunológica. Elas constituem a primeira linha de defesa contra as infecções virais e são espécie-específicas. Além disso, estão distribuídas em três famílias: tipo I ou α/β, que leva a uma resposta primordialmente antiviral; tipo II ou γ, produzida na resposta adaptativa em célula de defesa, tais como linfócitos T, NK e neutrófilos; e tipo III ou λ, produzido em células de origem epitelial. Cada tipo de interferon possui um receptor específico. Com dito, os interferons agem induzindo uma resposta antiviral, proliferativa e tumoral na célula, de modo que vale ressaltar que a molécula, por si só, não possui estes efeitos. Assim, durante a infecção viral, o interferon não atua diretamente sobre a replicação viral – em vez disso, dispara uma série de respostas celulares para combater a infecção. A principal resposta disparada é o estabelecimento do chamado estado antiviral em células não infectadas. *Estado Antiviral: Todas as células hospedeiras possuem genes que codificam para produção de interferon, os quais, em estado fisiológico, estão silenciados. Porém, uma vez que há a infecção por um patógeno, moléculas características desses microorganismos – chamadas padrões de reconhecimento de patógenos - são reconhecidas pelo nosso organismo a partir de receptores específicos, os quais podem ser citoplasmáticos ou de membrana, tais como os Toll-like. Como exemplo desses padrões, há a presença de material genético no citoplasma ou mesmo a presença deRNA dupla fita, um intermediário da replicação viral. O reconhecimento desses padrões pelos receptores induz ao recrutamento, pelos receptores, de moléculas adaptadoras, as quais disparam uma cascata de sinalização que leva à ativação de fatores de transcrição (IRF3 ou IRF7, por exemplo) geralmente por fosforilação. Esses fatores, então, são translocados para o núcleo, onde se ligam ao promotor dos genes de interferon e disparam a transcrição. Após isso, o transcrito vai para o citoplasma, onde é traduzido, e os interferons são, então, secretados da célula infectada. Ao ser secretado, o interferon se liga aos seus receptores de membrana específicos nas células vizinhas ou na própria célula que o secretou, disparando outras cascatas de sinalização parácrina ou autócrina, respectivamente. A ligação do interferon ao seu receptor leva à dimerização do mesmo, com recrutamento da via JAK-STAT, a qual leva a fosforilação das proteínas STATs, que são fatores transcricionais. A fosforilação desses fatores leva à sua ativação e deslocamento para o núcleo, onde levam à transcrição de mais de 400 genes, cujos produtos representam uma verdadeira artilharia contra a infecção viral, sendo chamados, em conjunto, de ISGs. A caracterização dos ISGs depende da presença de um motivo estrutural específico de ligação do fator STAT no promotor, o qual permite a transcrição. Dependendo do tipo de interferon e da célula hospedeira, os ISGs serão diferentes. Apesar disso, há alguns tipos de ISGs encontrados em todas ou quase todas as células. Os dois exemplos mais importantes e estudados são a PKR e 2-5OAS. OBS: Vale ressaltar que alguns ISGs são proteínas constitutivamente expressas, mas nesse estado sua expressão fica exacerbada, por exemplo. A PKR inativa está defosforilada, mas uma vez que a célula é infectada, ocorre sua ativação por autofosforilação, disparada pela ligação a um dsRNA - um produto da infecção viral. A PKR foforilada, então, leva à fosforilação do fator de iniciação da tradução eIF2 (subunidade α), cuja função é carregar o RNAt iniciador acoplado à metionina até o ribossomo. Essa fosforilação na subunidade α impede a reciclagem do fator, que não pode mais participar da tradução. Assim, há uma parada na síntese de proteínas. Isso impede a continuidade do ciclo replicativo viral, mas também celular, constituindo um suicídio celular. Já a 25OAS é uma enzima responsável pela síntese de adenilato (polímero de A). essa enzima esta inativa em estado fisiológico e é ativada pela presença de dsRNA, passando a sintetizar os polímeros de A. Esses polímeros, então, ativam uma RNase-L que a existe nas nossas células de forma inativa. Uma vez ativa, ela degrada preferencialmente RNAm e ribossomais sem especificidade – ou seja, degrada tanto viral quanto celular – levando a uma inibição da síntese de proteína geral, assim como ocorre com a PKR. OBS: Teoricamente, todos os vírus deveriam ser sensíveis ao interferon, mas ao longo da evolução os vírus criaram mecanismos para escapar da resposta imune do hospedeiro. Assim, existe uma serie de proteínas virais que atacam elementos da via de interferon. O escape pode se dar de diversas formas: inativando ação de PKR, produção de proteínas que mimetizam receptores de interferon (param a cascata do estado antiviral), ligadoras de dsRNA, etc. Vale ressaltar, por fim, que os ISGs, uma vez sintetizados, permanecem em sua maioria inativos até que a célula seja infectada. Por isso muitas vezes sua ativação depende de moléculas características da infecção, como a presença de dsRNA, como visto. Além disso, vale lembrar também que a produção dos ISGs depende da sinalização por interferon extracelular, de modo que o intracelular não possui essa capacidade. Ainda, o interferon, por si só, não possui atividade antiviral, sendo responsável apenas pelo estabelecimento do estado antiviral em células na infectadas. 2-5 Oligo adenilato sintetase
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